本方案介绍了在脓毒症小鼠模型中进行盲肠结扎穿刺（CLP）的操作细节。CLP是建立脓毒症动物模型最常用的实验技术之一。因此，为获得可靠的研究结果，需要采用标准化的CLP操作流程。
本文内容
摘要
摘要
脓毒症是一种严重危及生命且进展迅速的疾病，每年在全球造成数百万人死亡。研究人员已通过多种动物模型对脓毒症的病理生理机制进行了大量研究；其中，通过盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型在实验室中被广泛使用。影响CLP模型严重程度和可重复性的三个技术因素包括：结扎盲肠的比例、用于盲肠穿刺的针头尺寸，以及挤入腹腔的粪便量。脓毒症的快速且特异性诊断是影响预后的重要因素。目前脓毒症诊断的金标准是微生物培养；然而，该过程耗时较长，有时准确性也不足。检测脓毒症特异性生物标志物的方法较为快速，但现有标志物由于半衰期短、缺乏特异性以及敏感性不足而效果不理想。因此，迫切需要一种能够在早期阶段可靠地反映脓毒症的生物标志物。既往研究表明，脓毒症中存在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过度形成。瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）作为NETs的组分，在脓毒症动物和患者体内均显著升高，CitH3的存在可作为脓毒症可靠的诊断生物标志物。本研究旨在描述一种标准化的CLP诱导脓毒症小鼠模型，并建立一种可靠的脓毒症血液生物标志物。我们的工作可能为未来脓毒症的早期和准确诊断提供贡献。
引言
脓毒症被定义为由宿主对感染的失调反应所导致的危及生命的器官功能障碍1，而感染性休克是严重脓毒症患者死亡的首要原因2。脓毒症和感染性休克每年在全球范围内导致数百万人死亡3。改善脓毒症患者预后的关键在于及时启动抗生素等治疗措施4。诊断脓毒症的金标准方法是微生物培养；然而，微生物培养耗时较长，且可能出现假阳性和假阴性结果，这极大地限制了其临床意义5。因此，迫切需要鉴定出一种可用于脓毒症的血液生物标志物。降钙素原被认为是理想的脓毒症生物标志物，但其诊断效能有限，因为它无法区分脓毒症与非感染性全身炎症疾病6。
小鼠盲肠结扎穿刺（CLP）在科学研究中常用于建立脓毒症模型。CLP 是应用最广泛的脓毒症模型之一，因其可模拟多微生物性腹膜炎，同时激活促炎性和抗炎性免疫反应7。目前普遍认为，与注射细菌内毒素等其他方法相比，CLP 建立的脓毒症模型更具临床相关性。因此，CLP 被视为科研中经典的脓毒症模型8。然而，CLP 的主要缺点在于其可重复性较差，因为模型的严重程度受多种因素影响，如结扎盲肠的比例、针头大小、穿刺次数以及剖腹手术技术。因此，有必要对 CLP 诱导的脓毒症模型进行标准化。本研究详细描述了 CLP 诱导脓毒症模型的操作方案，旨在展示标准化操作流程，提高其实验可重复性。
在脓毒症的早期阶段会发生炎症反应，中性粒细胞释放过量的氧化物和蛋白酶，导致器官损伤8。脓毒症病理生理学的一个关键因素是中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成，其释放核成分和胞质成分，如DNA、瓜氨酸化组蛋白和抗菌蛋白酶9。最近的研究表明，NETs的过度生成介导了脓毒症的病理过程；而通过YW3-56或Cl-amidine等化学物质酶抑制肽基精氨酸脱亚氨酶（PAD），减少NETs的生成，则在脓毒症小鼠模型中表现出促进生存的作用10,11。瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）于2011年被鉴定为脓毒症特异性蛋白12，后续研究已证实循环中CitH3浓度是脓毒症可靠的诊断生物标志物13,14。与降钙素原相比，CitH3被认为是一种更敏感且持续时间更长的生物标志物，且在区分脓毒症与炎症细胞因子方面具有更高的特异性13。
在本研究中，我们评估了在CLP诱导的小鼠脓毒症模型中一种可靠的脓毒症诊断生物标志物。
方案
所有动物实验均按照中南大学湘雅医院动物伦理审查委员会批准的指南进行（编号：202103149）。
1. 准备
- 选取雄性 C57BL/6J 小鼠（体重：20–25 g；年龄：8–12 周），在进行任何操作前饲养 3 天。
- 称量小鼠体重。
- 通过吸入 1.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并轻捏脚趾以检查麻醉深度。
- 将小鼠固定在加热垫上。在腹部涂抹脱毛膏，停留时间不超过 1 分钟，随后去除脱毛膏和毛发。
注意：手术期间应将加热垫置于麻醉小鼠身下，以维持其正常体温。
2. 操作
- 准备适用于啮齿类动物手术的无菌外科器械。佩戴无菌手套、口罩和手术服，以确保无菌条件。
- 使用碘伏棉片对腹部皮肤消毒至少三次。用无菌手术巾覆盖手术区域。
- 使用无菌手术剪沿腹白线在腹壁上做一个约 2 cm 的切口。
注意：不要损伤器官。 - 用无菌镊子识别并分离出腹膜腔内的盲肠。
- 用 4-0 丝线结扎盲肠体积的 75%。不要结扎肠系膜血管。
注意：结扎盲肠的比例决定了脓毒症的严重程度。 - 使用 21 G 针头在盲肠尾端与结扎位置之间的中点处，贯穿盲肠壁（形成两个孔）进行一次贯穿性穿刺（从一侧穿入，穿透至对侧）。
- 丢弃针头。轻轻挤压盲肠，使少量粪便通过穿刺孔挤出。
注意：挤入腹膜腔的粪便量应保持一致，因为这也会影响脓毒症的严重程度。假手术组小鼠应跳过步骤 2.5–2.7。 - 轻柔地将盲肠放回腹腔内。
- 分别用 6-0 丝线缝合腹肌和皮肤。
- 用碘伏对切口进行消毒。
- 在腹部左下象限注射酮洛芬（5 mg/kg），以避免损伤盲肠。将小鼠置于加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。
- 将小鼠放入温度可控的房间（22 °C）内的笼子中，并自由提供食物和水。术后第一周内每 6 小时检查一次小鼠。
- 当小鼠出现符合预定义终点的脓毒症症状时，采用过量二氧化碳实施安乐死。
3. 治疗
- 随机将小鼠分为假手术组、CLP 组、CLP + YW3-56 组（图 2a）以及 CLP + Cl-amidine 组（图1).
注意：假手术组除不进行CLP外，其余操作均与CLP组相同。给予YW3-56（5 mg/kg）或Cl-amidine（40 mg/kg） 通过 在第2.9步缝合肌肉和皮肤层时，进行腹腔注射，注射时间为缝合后1小时。 - 样品采集
- 从眶后静脉丛采集外周血15 术后24小时。
- 通过离心（1,000 x g）制备血清 g，5 分钟）并保存于 -80 °C，直至使用。
- 使用间接夹心 ELISA 试剂盒测定 CitH3 浓度，方法如前所述13.
- 将抗CitH3单克隆抗体包被于96孔板上，用于捕获CitH3蛋白。
- 用 DNase I（150 单位/毫升，37°下孵育 1 小时）处理血清，然后加入孔板中（20 µL，室温孵育）。
- 加入抗CitH3多克隆抗体（0.33 µg/mL，100 µL，2 h）以检测捕获的CitH3蛋白。
- 在孔中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（0.02 µg/mL，100 µl），孵育1小时。
- 充分洗涤后，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（100 µL，孵育20分钟）显色。
注意：ELISA 试剂盒的进一步实验方案细节已在先前发表的文献中提供13.
- 统计分析
- 采用单因素方差分析（one way ANOVA）比较三组之间的差异，随后进行Bonferroni事后检验以进行多重比较。使用统计软件完成数据分析。 p 0.05 及以下的值被视为具有显著性。
结果
如图所示 图2A假手术组中通过 Western blotting 未检测到 CitH3。CLP 后血清 CitH3 浓度显著升高，而抑制 NET 的形成可阻断这一升高。 通过 PAD抑制剂YW3-56的给药10. 图2B 显示通过ELISA测定的血清CitH3浓度。在CLP术后24小时，与假手术组相比，CLP组的血清CitH3浓度升高（p = 0.0008），而这种CitH3的增加可被Cl-amidine显著抑制，Cl-amidine是一种PAD抑制剂，可限制NET的形成（p = 0.0028).
图1实验分组 小鼠被随机分为假手术组、CLP 组、CLP + YW3-56 组（A）以及 CLP + Cl-amidine 组（B）。CLP 操作按前述方案进行。给予 YW-3-56（5 mg/kg）或 Cl-amidine（40 mg/kg） 通过 腹腔注射在CLP造模后1 h进行。假手术组除不进行CLP外，其余操作均与CLP组相同。在不同时间点采集血液，分离血清并储存于-80 °C。80 °C 直至使用。YW3-56 和 Cl-amidine 均为肽基精氨酸脱亚氨酶抑制剂，可显著抑制中性粒细胞胞外诱捕网的形成。缩写：CitH3 = 瓜氨酸化组蛋白 H3；CLP = 盲肠结扎穿刺。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：在CLP诱导的脓毒症模型中，血清CitH3浓度显著升高，PAD抑制可缓解该升高。（A）通过Western印迹检测血清CitH3浓度。假手术组未检测到CitH3。CLP组CitH3浓度显著升高，而YW3-56处理可阻断该升高。（B）采用ELISA法测定血清CitH3浓度。假手术组几乎未检测到CitH3。CLP组CitH3水平显著升高，而给予Cl-amidine后该升高被减弱。YW3-56和Cl-amidine均为PAD抑制剂，可显著抑制中性粒细胞胞外诱捕网的形成。缩写：CitH3 = 瓜氨酸化组蛋白H3；CLP = 盲肠结扎穿孔；PAD = 肽基精氨酸脱亚胺酶。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
盲肠结扎穿刺术（CLP）将病原体引入腹腔，以建立脓毒症的临床前模型。实施CLP时，必须采用无菌条件，以消除外源性细菌的干扰，并准确使用麻醉剂剂量16。影响脓毒症模型严重程度和可重复性的三个技术要点是：结扎盲肠的比例、用于盲肠穿刺的针头尺寸，以及挤入腹腔的粪便量。大约结扎75%的盲肠可导致重度脓毒症，50%结扎导致中度脓毒症，25%或更少结扎则导致轻度脓毒症17。穿刺次数和针头大小决定死亡率18，最佳效果通过贯穿式穿刺实现。仅需少量（一滴）粪便即可引发细菌性腹膜炎，在挤出粪便时需格外小心。由经验丰富的操作者实施时，CLP过程大约耗时10分钟。
本研究中描述的CLP诱导脓毒症小鼠模型存在若干局限性。首先，小鼠体型可能过小，难以获取足够的血液样本用于外周血分析和细胞因子检测。其次，无法在新生动物中实施CLP手术。第三，仍可能存在变异性，难以获得可重复的结果。在开展研究性实验前，必须确保外科操作人员已接受充分的CLP操作训练并具备足够的实践经验。
盲肠结扎穿刺术（CLP）可建立一种临床高度模拟的脓毒症模型，能够模拟脓毒症的病理生理过程及细胞因子谱，在啮齿类动物中已得到广泛应用。通过调整穿刺针的大小以及结扎盲肠的百分比，可调控CLP模型的严重程度，以满足不同研究目的的需求。根据我们利用CLP模型获得的结果，检测小鼠循环中瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）的浓度可实现脓毒症的早期诊断。血清CitH3浓度的诊断价值有助于及时启动抗脓毒症治疗，从而显著改善脓毒症个体的预后。
致谢
感谢王伟教授和刘帅博士在实验方面提供的帮助。本工作由中南大学湘雅医院青年科研基金（编号：2019Q10）、湖南省自然科学基金（编号：2020JJ4902）以及国家自然科学基金（编号：82202394）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 21G针头 | |||
| 3,3’,5,5’四甲基联苯胺 | R&D Systems Inc | DY999 | |
| 抗CitH3单克隆抗体 | 实验室自研 | ||
| 抗CitH3多克隆抗体 | Abcam | ab5103 | |
| 抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6小鼠 | 中南大学湘雅医学院 | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| 脱毛膏 | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| 酮洛芬 | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| 丝线缝合线（4-0） && 6-0) | |||
| 手术器械 | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
参考文献
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