脓毒症小鼠盲肠结扎穿刺模型中可靠生物标志物的评估

摘要

本方案介绍了在脓毒症小鼠模型中进行盲肠结扎穿刺（CLP）的操作细节。CLP是建立脓毒症动物模型最常用的实验技术之一。因此，为获得可靠的研究结果，需要采用标准化的CLP操作流程。

摘要

脓毒症是一种严重危及生命且进展迅速的疾病，每年在全球造成数百万人死亡。研究人员已通过多种动物模型对脓毒症的病理生理机制进行了大量研究；其中，通过盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型在实验室中被广泛使用。影响CLP模型严重程度和可重复性的三个技术因素包括：结扎盲肠的比例、用于盲肠穿刺的针头尺寸，以及挤入腹腔的粪便量。脓毒症的快速且特异性诊断是影响预后的重要因素。目前脓毒症诊断的金标准是微生物培养；然而，该过程耗时较长，有时准确性也不足。检测脓毒症特异性生物标志物的方法较为快速，但现有标志物由于半衰期短、缺乏特异性以及敏感性不足而效果不理想。因此，迫切需要一种能够在早期阶段可靠地反映脓毒症的生物标志物。既往研究表明，脓毒症中存在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过度形成。瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）作为NETs的组分，在脓毒症动物和患者体内均显著升高，CitH3的存在可作为脓毒症可靠的诊断生物标志物。本研究旨在描述一种标准化的CLP诱导脓毒症小鼠模型，并建立一种可靠的脓毒症血液生物标志物。我们的工作可能为未来脓毒症的早期和准确诊断提供贡献。

引言

脓毒症被定义为由宿主对感染的失调反应所导致的危及生命的器官功能障碍¹，而感染性休克是严重脓毒症患者死亡的首要原因²。脓毒症和感染性休克每年在全球范围内导致数百万人死亡³。改善脓毒症患者预后的关键在于及时启动抗生素等治疗措施⁴。诊断脓毒症的金标准方法是微生物培养；然而，微生物培养耗时较长，且可能出现假阳性和假阴性结果，这极大地限制了其临床意义⁵。因此，迫切需要鉴定出一种可用于脓毒症的血液生物标志物。降钙素原被认为是理想的脓毒症生物标志物，但其诊断效能有限，因为它无法区分脓毒症与非感染性全身炎症疾病⁶。

小鼠盲肠结扎穿刺（CLP）在科学研究中常用于建立脓毒症模型。CLP 是应用最广泛的脓毒症模型之一，因其可模拟多微生物性腹膜炎，同时激活促炎性和抗炎性免疫反应⁷。目前普遍认为，与注射细菌内毒素等其他方法相比，CLP 建立的脓毒症模型更具临床相关性。因此，CLP 被视为科研中经典的脓毒症模型⁸。然而，CLP 的主要缺点在于其可重复性较差，因为模型的严重程度受多种因素影响，如结扎盲肠的比例、针头大小、穿刺次数....

方案

所有动物实验均按照中南大学湘雅医院动物伦理审查委员会批准的指南进行（编号：202103149）。

1. 准备

1. 选取雄性 C57BL/6J 小鼠（体重：20–25 g；年龄：8–12 周），在进行任何操作前饲养 3 天。
2. 称量小鼠体重。
3. 通过吸入 1.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并轻捏脚趾以检查麻醉深度。
4. 将小鼠固定在加热垫上。在腹部涂抹脱毛膏，停留时间不超过 1 分钟，随后去除脱毛膏和毛发。
   ​注意：手术期间应将加热垫置于麻醉小鼠身下，以维持其正常体温。

2. 操作

1. 准备适用于啮齿类动物手术的无菌外科器械。佩戴无菌手套、口罩和手术服，以确保无菌条件。
2. 使用碘伏棉片对腹部皮肤消毒至少三次。用无菌手术巾覆盖手术区域。
3. 使用无菌手术剪沿腹白线在腹壁上做一个约 2 cm 的切口。
   注意：不要损伤器官。
4. 用无菌镊子识别并分离出腹膜腔内的盲肠。
5. 用 4-0 丝线结扎盲肠体积的 75%。不要结扎肠系膜血管。
   注意：结扎盲肠的比例决定了脓毒症的严重程度。
6. 使用 21 G 针头在盲肠尾端与结扎位置之间....

结果

如图所示 图2A假手术组中通过 Western blotting 未检测到 CitH3。CLP 后血清 CitH3 浓度显著升高，而抑制 NET 的形成可阻断这一升高。 通过 PAD抑制剂YW3-56的给药¹⁰. 图2B 显示通过ELISA测定的血清CitH3浓度。在CLP术后24小时，与假手术组相比，CLP组的血清CitH3浓度升高（p = 0.0008），而这种CitH3的增加可被Cl-amidine显著抑制，Cl-amidine是一种PAD抑制剂，可限制NET的形成（p = 0.0028).

讨论

盲肠结扎穿刺术（CLP）将病原体引入腹腔，以建立脓毒症的临床前模型。实施CLP时，必须采用无菌条件，以消除外源性细菌的干扰，并准确使用麻醉剂剂量¹⁶。影响脓毒症模型严重程度和可重复性的三个技术要点是：结扎盲肠的比例、用于盲肠穿刺的针头尺寸，以及挤入腹腔的粪便量。大约结扎75%的盲肠可导致重度脓毒症，50%结扎导致中度脓毒症，25%或更少结扎则导致轻度脓毒症¹⁷。穿刺次数和针头大小决定死亡率¹⁸，最佳效果通过贯穿式穿刺实现。仅需少量（一滴）粪便即可引发细菌性腹膜炎，在挤出粪便时需格外小心。由经验丰富的操作者实施时，CLP过程大约耗时10分钟。

本研究中描述的CLP诱导脓毒症小鼠模型存在若干局限性。首先，小鼠体型可能过小，难以获取足够的血液样本用于外周血分析和细胞因子检测。其次，无法在新生动物中实施CLP手术。第三，仍可能存在变异性，难以获得可重复的结果。在开展研究性实验前，必须确保外科操作人员已接受充分的CLP操作训练并具备足够的实践经验。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
21G针头
3,3’,5,5’四甲基联苯胺	R&D Systems Inc	DY999
抗CitH3单克隆抗体	实验室自研
抗CitH3多克隆抗体	Abcam	ab5103
抗兔二抗	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6小鼠	中南大学湘雅医学院
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
脱毛膏
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
异氟烷	Sigma-Aldrich	26675-46-7
酮洛芬	Sigma Aldrich	PHR1375
丝线缝合线（4-0） && 6-0)
手术器械
YW3-56	GLPBIO	GC48263