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方法文章

基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

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DOI：

10.3791/63586

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2022年4月21日

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

本文内容

摘要

本文描述了一种基于质谱的蛋白质组学方法，用于对具有已知组织命运的脊椎动物Xenopus laevis胚胎中的细胞谱系进行表征。

摘要

细胞发育为组织和器官过程中的分子事件表征，有助于更深入理解正常发育机制，并为疾病设计高效的治疗方案。能够精确鉴定和定量大量及多种类型蛋白质的技术，将提供目前尚缺失的、关于组织和生物体在时空上协调发育的分子机制信息。本文介绍一种基于质谱的实验方案，可在Xenopus laevis（青蛙）胚胎中对已知细胞谱系的数千种蛋白质进行定量检测。该方法基于可重复的细胞命运图谱，结合已建立的技术，用于识别、荧光标记、追踪以及采样特定细胞及其后代（克隆），这些技术均来自脊椎动物发育的经典模型。通过显微取样、解剖分离或荧光激活细胞分选获取细胞内容物后，提取蛋白质并进行自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析。采用液相色谱和毛细管电泳实现蛋白质的可扩展分离，进而利用高分辨质谱（HRMS）进行高精度的蛋白质检测与定量。本文以神经组织命运决定细胞的蛋白质组学表征为例，展示了该方法的应用。这种基于细胞谱系指导的高分辨质谱蛋白质组学技术可适用于不同组织和生物体，具有足够的灵敏度、特异性和定量能力，可用于深入探究脊椎动物发育过程中蛋白质组的时空动态变化。

引言

我们对细胞分化以及组织和器官发生的理解，是数十年来对基因及其产物进行精细靶向筛选的结果。深入了解重要细胞事件过程中所有生物分子及其含量，将有助于揭示控制脊椎动物体轴时空模式形成的分子机制。目前，能够实现分子扩增与测序的技术已可常规检测大量基因和转录本，从而支持基础生物学和转化研究中的假设驱动型研究。为了理解发育系统，鉴于转录与翻译之间存在复杂的关联，有必要对多种蛋白质及其翻译后修饰进行直接分析。基于全局蛋白质组学的 体外 生物系统，例如诱导多能干细胞，开始阐明组织诱导的机制1,2在复杂的生物体（如脊椎动物胚胎）中，发育过程依赖于形态发生素在时空背景下的浓度梯度3因此，了解细胞分化形成特化组织（如神经组织）过程中的蛋白质组变化，是揭示控制正常与异常发育的分子程序并指导下一代治疗策略的关键。

非洲爪蟾（Xenopus laevis）是一种在细胞与发育生物学、神经生物学以及再生生物学研究中广泛应用的脊椎动物模式生物。约翰·戈登爵士因发现体细胞核具有多能性而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖4,5，这一成果凸显了该模型在基础研究和转化研究中的重要性。Xenopus 胚胎在母体外发育，便于对细胞、细胞克隆以及基因表达在不同发育阶段进行直接操作。其不对称的色素分布和模式化的细胞分裂使得研究人员能够绘制出可重复的细胞命运图谱，最早可追溯至16-6 和32-细胞7,8 阶段的胚胎。对于基于高分辨率质谱（HRMS）的蛋白质组学研究，该模型的其他优势还包括胚胎体积相对较大（直径约1 mm），可提供充足的蛋白质用于分析（早期卵裂阶段胚胎约含130 µg蛋白质，16-细胞胚胎的单个细胞约含10 µg蛋白质）9,10。

目前，高分辨质谱（HRMS）是检测蛋白质的首选领先技术。该技术能够直接、灵敏且特异地检测和定量多种蛋白质，通常可同时分析数百至数千种不同的蛋白质11。基于HRMS的自下而上蛋白质组学包含一系列相互关联的步骤。首先从细胞或组织样本中提取蛋白质，随后使用蛋白酶（如胰蛋白酶）对其进行酶解消化（即自下而上蛋白质组学）。所产生的肽段根据其不同的理化性质进行分离，这些性质包括疏水性（反相液相色谱，LC）、净电荷（离子交换色谱）、分子大小（尺寸排阻色谱）或电泳迁移率（毛细管电泳，CE）。肽段随后被电离，通常采用电喷雾电离（ESI）技术，生成的肽离子通过串联高分辨质谱（HRMS）在气相中发生碎片化，从而实现检测与测序。所获得的肽段数据被映射至研究对象生物体的蛋白质组。由于蛋白质特异性（蛋白质原型）肽离子信号强度与蛋白质浓度相关，因此可进行无标记或基于标记（多重定量）的蛋白质定量分析。HRMS蛋白质组学提供了关于研究体系分子状态的丰富信息，有助于提出科学假设并开展后续功能研究。

细胞微吸与分离示意图；从胚胎到原肠胚，通过FACS分选，实验装置。
图1：时空可扩展的蛋白质组学技术，实现发育中（青蛙）胚胎中基于细胞谱系指导的高分辨质谱蛋白质组分析。（A）使用体视显微镜（2）观察样本（1），并通过由移液台（4）控制的自制微移液管（3）对特定细胞进行注射（插图）。（B）从16细胞期胚胎中对左侧D11细胞进行亚细胞取样。（C）从16细胞期胚胎中完整分离出D11细胞。（D）利用荧光（绿色）标记追踪32细胞期胚胎中左侧和右侧D111细胞的后代，以指导在原肠胚（第10期）中神经外胚层（NE）的显微解剖，并通过FACS从蝌蚪中分离其衍生组织。比例尺：胚胎为200 µm，离心管为1.25 mm。图示经参考文献15,19,21,59许可改编。请点击此处查看此图的放大版本。

本方案实现了基于高分辨质谱（HRMS）对发育中X. laevis胚胎内已鉴定细胞/组织中大量蛋白质进行定量分析。该方法建立在精确的细胞鉴定、可重复的细胞命运图谱以及在此生物模型中已确立的细胞谱系追踪技术基础之上6,7,8。如图1所示，我们通过全细胞解剖或毛细管微量取样吸取细胞内容物，从而对单个细胞的蛋白质组进行研究。通过追踪细胞谱系，可研究在原肠胚形成过程中细胞形成组织时蛋白质组的时空动态演变。细胞后代通过注射与惰性葡聚糖偶联的荧光染料或荧光蛋白mRNA（例如绿色荧光蛋白GFP）进行荧光标记。在选定的发育时间点分离标记的细胞后代。在原肠胚形成期间，紧密聚集的细胞克隆可通过解剖法分离；原肠胚形成之后，由于细胞迁移运动，细胞克隆可能分散于胚胎中，此时可通过荧光激活细胞分选（FACS）从解离的组织中分离。这些细胞和组织中的蛋白质通过自下而上（bottom-up）蛋白质组学方法进行检测，采用HPLC或CE进行分离，并利用ESI串联高分辨质谱（HRMS）进行鉴定。基于细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学技术可扩展应用于胚胎内不同大小和类型的细胞及其谱系，具有特异性、高灵敏度和定量能力。通过本文展示的若干示例，我们还进一步证明了该方案具有良好的可扩展性，并可广泛适用于多种类型的细胞及细胞谱系。

细胞和组织解剖工作流程图，包含肽段消化、色谱分析、电喷雾高分辨质谱分析。
图2：生物分析工作流程。 通过显微解剖与毛细管抽吸，或借助荧光激活细胞分选（FACS）获取细胞及克隆来源的蛋白质样品。去除高丰度卵黄蛋白后，采用毛细管电泳（CE）或纳流液相色谱（LC）分离，结合电喷雾电离（ESI）高分辨质谱（HRMS）提高鉴定（ID）灵敏度。定量分析揭示了表达失调情况，结合基因本体（GO）已有信息，为假设驱动型研究提供新的线索。图示经参考文献15许可改编。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

所有确保人道饲养和操作成年非洲爪蟾（Xenopus laevis）的实验方案均经马里兰大学帕克分校机构动物护理和使用委员会批准（批准编号：R-DEC-17-57 和 R-FEB-21-07）。

1. 准备溶液

  1. 胚胎学实验
    1. 配制1倍、0.5倍和0.2倍浓度的Steinberg溶液（SS），然后按照标准操作规程进行高压灭菌（120 °C，20分钟）以确保无菌12。
    2. 按照标准操作规程，在灭菌的1倍SS中配制3%（w/v）的Ficoll溶液12。
    3. 去胶时，新鲜配制2%（w/v）的半胱氨酸溶液，并逐滴加入10 M氢氧化钠溶液调节pH至8。
      警告：接触半胱氨酸可能导致皮肤和呼吸道损伤。氢氧化钠具有腐蚀性，直接接触可对皮肤和眼睛造成严重损伤。操作这些化学品时应佩戴适当个人防护装备（PPE），如手套和实验服。
    4. 用于谱系示踪时，将荧光葡聚糖以0.5%（v/v）的比例溶于无菌去离子水中。或者，将荧光蛋白mRNA（例如GFP）配制成0.2 µg/µL的溶液于无菌去离子水中。
    5. 用于细胞解离时，配制Newport 2.0缓冲液，包含0.1 M异乙磺酸钠、20 mM焦磷酸钠和10 mM CAPS，并将pH调至10.513。
      警告：接触焦磷酸钠可能引起皮肤和眼睛刺激。操作这些化学品时应佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
  2. 自下而上蛋白质组学实验
    1. 配制细胞裂解缓冲液，成分如下：250 mM蔗糖、1%非离子型去污剂替代物（w/v）、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、10 µM细胞松弛素D和10 µM康布雷他汀4A。另配制10%（w/v）十二烷基硫酸钠储备液14,15。
      注意：选择Tris-HCl是为了在纳流液相色谱-高分辨质谱（nanoLC-HRMS）分析中尽量减少HEPES的污染。
      警告：接触非离子型去污剂替代物可能引起皮肤刺激。细胞松弛素D若摄入具有致畸性，康布雷他汀在直接接触时具有急性毒性。操作这些化学品时应佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
    2. 用于毛细管电泳分离肽段时，配制以下溶剂（v/v）：样品溶剂为含0.05%乙酸（AcOH）的75%乙腈（ACN）水溶液；鞘液为含0.05%乙酸的10%乙腈水溶液；背景电解质（BGE）为含1 M甲酸（FA）的25%乙腈水溶液。
      警告：乙酸和甲酸吸入或摄入后有毒，直接接触可导致严重的皮肤和眼睛损伤。操作这些化学品时应佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
    3. 用于反相纳流液相色谱分离肽段时，配制以下流动相（v/v）：流动相A（水相）为含0.1%甲酸的水溶液；流动相B（有机相）为含0.1%甲酸的乙腈溶液。
      ​注意：所有溶液均应使用LC-MS级溶剂配制，以尽量减少高分辨质谱检测过程中的化学干扰。

2. 准备显微注射和解剖工具

  1. 为轻柔移动和调整胚胎方向，可按照 elsewhere16 所述方法，将洁净的毛发固定在巴斯德吸管中制作毛发环。
  2. 进行显微注射时，使用拉针仪将硼硅酸盐毛细管（外径/内径分别为 1 mm/500 µm）拉制成针尖，具体方法见 elsewhere16。
    注意：本实验中使用 P-1000 拉针仪，设置参数如下：加热温度 495，拉力 30，速度 60，时间 150，压力 200。
  3. 在体视显微镜下观察，用一对锋利的镊子剪断毛细管的尖端，从而将其制成（显微）注射针（例如 Dumont #5）16。
    警告：拉制后的毛细管极为锋利，操作时应格外小心。
    注意：针尖应足够尖锐（外径 10–15 µm），以便以最小损伤刺穿细胞膜，防止细胞内含物泄漏，确保细胞能够愈合并保持活性。
  4. 为在显微注射过程中固定胚胎，需在填有塑性黏土的培养皿中制备小孔。在直径 15 mm 的培养皿中，用无毒的塑性黏土压出直径约 1 mm、深度约 0.5 mm 的小孔，方法见 elsewhere16。
  5. 进行显微解剖时，准备琼脂糖包被的培养皿。将 2% 琼脂糖溶于 1× SS 溶液中，经高压灭菌（120 °C，20 分钟）消毒。将 60 mm 培养皿填充至一半高度，静置使其凝固。使用球形巴斯德吸管工具压出直径约 1 mm、深度约 0.5 mm 的小孔，方法同前16。

3. 分离细胞谱系

注意：以下步骤用于分离已鉴定的单个细胞和/或其子代细胞谱系。通常将胚胎培养至16细胞期或32细胞期，此时每个细胞的组织命运已被可重复地绘制出来6,7,17。胚胎细胞的鉴定依据其形态、位置，并参考其命运图谱。对于单细胞分析，通过手工解剖分离已鉴定的细胞，或将其细胞内含物收集至毛细移液管中，并转移至5 μL 0.5 mM碳酸氢铵溶液中。所得样品在-80 °C保存，直至进行分析（图1）18,19,20,21。对于细胞谱系分析，向已鉴定的细胞注射谱系示踪剂，随后在发育的关键阶段分离其产生的克隆（例如，在原肠胚形成期间研究组织诱导，在神经管形成后研究组织定型）。下文将概述如何对已鉴定细胞的谱系进行荧光标记，以便通过解剖或流式细胞分选（FACS）进行分离。

  1. 培养胚胎
    1. 通过自然交配获取胚胎或 体外 按照既定方案进行体外受精（IVF）12.
      注意：自然交配在操作上更为简便，且无需牺牲成年雄性青蛙，可获得处于不同发育阶段的胚胎；而体外受精（IVF）则能提供发育同步的胚胎，适用于需要精确分期的实验。
    2. 去除胚胎的胶状外层。按照 elsewhere 中所述，使用去胶溶液去除包围胚胎的胶状外层。12,16.
      注意：显微注射和解剖需要接触细胞和组织，因此必须进行去胶处理 X. laevis 胚胎
    3. 选择具有典型色素沉着的2细胞胚胎16,22.
      注意：此步骤对于确保细胞及其谱系鉴定的准确性和可重复性至关重要。
    4. 将胚胎培养至所需发育阶段。将去胶膜的胚胎转移至含有1x SS的培养皿中，在14–25 °C条件下孵育，以控制发育速度。
      注意：发育的温度依赖性具有可重复性，并已绘制成图表 X. laevis，可在 Xenbase 上获取23 (www.xenbase.org)。在不同温度下培养多批胚胎可使发育阶段错开，有助于在特定时间内分散可用于实验的胚胎数量。 
    5. 观察胚胎的卵裂模式，挑选具有典型色素分布和卵裂模式的胚胎用于显微注射16.
      注意：在挑选16细胞期和32细胞期胚胎时，应确保卵裂具有对称性，以实现可重复的谱系示踪。
  2. 标记目标细胞
    1. 安装含有谱系示踪剂溶液的注射针。将显微注射针固定在由多轴显微操作器控制的微移液管持针器中。
    2. 将微量移液器固定器连接至显微注射仪。通过施加负压，将谱系示踪剂吸入针头，具体操作参见其他文献描述。16. 图1A 展示了实验装置的设置。
    3. 校准针头。根据其他地方提供的方案，在（矿物）油中测量，调整针尖大小和注射时间，以递送约1 nL的谱系示踪剂溶液。16.
      注意：尖端较宽的毛细管容易损伤细胞膜，导致细胞内含物和注入的谱系示踪剂泄漏；而尖端较细的毛细管则易发生堵塞。尖端外径约为 10 µm 的毛细管最为理想，通过约 300 ms 的 40 psi 压力脉冲可输送约 1 nL 体积。
    4. 用移液管将约10个胚胎转移至已充满3% Ficoll溶液的显微注射黏土培养皿中。使用毛细环引导每个胚胎进入凹槽，并轻轻调整其位置，使目标细胞与显微注射针成直角。
    5. 鉴定目标谱系的前体细胞 X. laevis 组织命运图谱。例如， 图1 演示基于在32细胞期胚胎（左侧和右侧D）的前体细胞注射来标记神经外胚层克隆111 细胞）
      注意：16-细胞期的详细命运图谱6 和32细胞7,8 胚胎可通过 Xenbase 在交互式平台上获取23在进行谱系追踪实验时，确保胚胎具有典型的色素沉着和卵裂模式非常重要。
    6. 按照前述方法，向目标细胞注射约 1 nL 荧光葡聚糖或约 200 pg mRNA16.
      注意：使用分子量为10,000–40,000的葡聚糖偶联物。分子量较小的葡聚糖偶联物可能通过间隙连接，而分子量较大的葡聚糖偶联物可能无法均匀扩散至注射细胞内。建议注射约10个胚胎的细胞，以获得足量组织用于蛋白质组学分析。
    7. 在体视显微镜下确认细胞标记是否成功。确保仅对目标细胞进行注射。根据机构规定，弃去含有损伤或标记错误细胞的胚胎。
      注意：由于 X. laevis 在许多非自然环境中具有侵入性，因此在丢弃胚胎前可将其冷冻以确保其死亡。
  3. 分离标记的细胞后代
    1. 将已注射的胚胎转移至含有0.5x SS的培养皿中，在14-25 °C条件下培养，直至达到所需的发育阶段。
      注意：请参考 Xenbase 上已建立的方案以确定胚胎的发育阶段。
    2. 将3-5个胚胎转移至含有0.2x SS溶液的琼脂培养皿中，用于显微解剖。
      ​注意：将SS溶液的盐浓度从0.5x降至0.2x有助于在解剖过程中分离细胞。
    3. 使用两把锋利的镊子轻轻去除包围胚胎的卵黄膜。
      注意：为避免损伤目标克隆，应从荧光标记克隆的对侧剥离膜。
    4. 通过手动解剖（步骤 3.3.5–3.3.6）或流式细胞分选（FACS）（步骤 3.3.7–3.3.8）分离标记的克隆，具体如下。
    5. 使用镊子从胚胎中解剖出标记的克隆。
      注意：其他工具，如显微手术剪、钨针或眉毛刀，也可用于标记克隆的解剖，具体方法见其他文献16.
    6. 用0.5–10 µL移液器收集解剖组织，并将其转移至微量离心管中。使用移液吸头吸取收集组织周围的培养基，以减少样品中的盐分，避免其对后续步骤中的高分辨质谱（HRMS）分析产生干扰。
      注意：使用可最大限度减少蛋白质在塑料表面吸附的微量离心管，以降低后续实验步骤中因管壁吸附导致的蛋白质损失。
    7. 通过FACS进行分离时，将约5-8个去卵黄胚胎转移至含有约5 mL Newport 2.0缓冲液的12孔板的每个孔中。在室温下以80 rpm转速振荡孵育20-30分钟，使胚胎解离。13.
      注意：22期以后的胚胎/幼体含有丰富的细胞外基质蛋白，难以解离为单个细胞。可根据其他文献所述方法，调整额外的酶解方案以解离较晚期胚胎的组织。24.
    8. 使用流式细胞术（FACS）从悬浮液中分选荧光标记的细胞，具体步骤参见其他文献描述24.
    9. 离心沉淀细胞，弃去上清液。
      注意：使用低速离心（400 × g）和温度（4 °C）以防止细胞裂解。若在流式细胞术（FACS）中使用牛血清白蛋白（BSA），需洗涤细胞沉淀，以减少BSA在高分辨质谱（HRMS）检测中的干扰。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻重悬细胞，再次离心以收集洗涤后的细胞沉淀。移除上清液PBS。
    10. 将样品管置于干冰或液氮中，迅速冷冻分离的细胞。
      注意：在处理过程中保持样品（组织或细胞）处于低温状态（例如置于冰上）。冷冻细胞时应尽量减少样品周围的培养基，以利于后续处理。
    11. 将样品储存于 −80 °C，直至进行高分辨质谱（HRMS）分析。

4. 通过质谱分析蛋白质

分离组织或细胞的蛋白质组学表征基于高分辨质谱（HRMS）中一系列既定步骤。图2展示了生物分析工作流程的各个步骤。此处所用的样本采集方案可兼容自下而上11、中等尺度25或自上而下26的蛋白质组学工作流程。下文描述了本研究采用的自下而上策略，该方法已被证明具有高灵敏度、定量准确，并可适配多种类型的质谱仪。在提取蛋白质并进行酶解消化后，所得肽段被分离，随后进行高分辨质谱（HRMS）分析。

  1. 处理组织/单细胞
    1. 对于毛细管电泳（CE）的单细胞分析，将样品在 60 °C 加热约 15 分钟以变性蛋白质，然后在室温（RT，约 5 分钟）下平衡样品18,21。
      注意：与组织样品处理不同，为减少单细胞样品制备过程中的蛋白质损失，省略还原和烷基化步骤。可采用滤膜辅助样品制备（FASP）27,28、其他单管策略29以及微流控方法30，以最大限度减少样品制备过程中的蛋白质损失。
    2. 对于纳米液相色谱（nanoLC）分析，将最多 5 个解剖获得的组织裂解于 50 µL 裂解缓冲液中（总蛋白约 100 µg）。通过反复吹打数次以促进裂解过程。
    3. 在 4 °C 下孵育裂解液 10 分钟，然后在 4 °C 下以 4,500 × g 离心，沉淀细胞碎片和卵黄小板。将上清液转移至洁净的微量离心管中，并加入 10% SDS，使裂解液中 SDS 的终浓度为 1%（v/v）。
    4. 对于组织样品，执行步骤 4.1.5–4.1.7。
    5. 向裂解液中加入 0.5 M 二硫苏糖醇（dithiothreitol），使终浓度约为 25 mM（例如，向 50 µL 裂解液中加入 2.5 µL 0.5 M 二硫苏糖醇），并在 60 °C 下孵育 30 分钟，以化学还原蛋白质中的二硫键。
    6. 加入 0.5 M 碘乙酰胺，使裂解液中终浓度约为 75 mM，并在避光条件下于室温孵育 15 分钟（图 2）。
    7. 加入与初始体积相同的 0.5 M 二硫苏糖醇（例如，向 50 µL 裂解液中加入 2.5 µL 0.5 M 二硫苏糖醇），以淬灭烷基化反应中残留的反应物。
      警告：碘乙酰胺和二硫苏糖醇在直接接触时可能造成严重的皮肤和眼睛损伤。操作这些化学品时应使用适当的个人防护装备（PPE）。
    8. 通过沉淀法纯化蛋白质。氯仿-甲醇沉淀法效果良好31。本方案也可适配于其他类型的沉淀方法32。
      注意：对于单细胞分析，若关注蛋白质损失问题，可省略毛细管电泳-高分辨质谱（CE-HRMS）的沉淀步骤。
    9. 在真空浓缩仪中（4–37 °C）干燥蛋白质沉淀，然后将提取的蛋白质组重悬于 50 µL 50 mM 碳酸氢铵溶液中。使用总蛋白比色法测定蛋白浓度，以确定消化所需酶的用量（例如，双辛可宁酸蛋白测定法）。
    10. 将蛋白质酶解为肽段。加入胰蛋白酶（1 µg/µL 储液），使蛋白酶与蛋白质的比例为 1:50，并在 37 °C 下孵育，单细胞样品孵育时间最长为 5 小时，组织样品最长为 14 小时。请参考供应商提供的具体反应条件建议。
      注意：胰蛋白酶消化时间超过 14 小时或使用更高浓度可能导致非特异性切割，从而影响蛋白质鉴定33。
    11. 使用比色法测定总肽段浓度。
    12. 可选：为实现多重定量，根据供应商说明，使用不同的同重质量标签对各样品的肽段进行标记。将条形码标记的肽段按等比例混合。
      注意：确保准确标记和混合，以避免定量偏差。对于样品量有限或单细胞样品，可加入由组织/细胞混合物构成的 TMT 载体通道，以减少后续分离步骤中的样品损失，并提高低丰度蛋白质的检测灵敏度34。
    13. 可选：使用 C18 反相离心柱/吸头对肽段进行脱盐，以去除盐分和污染物（例如未反应的同重质量标签试剂），从而保护液相色谱-质谱（LC-MS）系统。
    14. 可选：通过手动或自动平台对肽段混合物进行分级（例如中性或高 pH 反相分级），以实现对蛋白质组的更深度检测。使用含 C18 固定相的吸头对少量（1–10 µg）肽段消化物进行分级。
    15. 在真空浓缩仪中于 60 °C 下干燥肽段混合物。
    16. 将肽段混合物储存于 −80 °C，直至检测。
  2. 分离肽段
    注意：在提取并酶解蛋白质后，所得肽段通过纳米液相色谱（nanoLC）或毛细管电泳（CE）分离，并通过电喷雾电离（ESI）进行离子化，随后由串联高分辨质谱（tandem HRMS）进行测序。反相 nanoLC 分离适用于每次分析含 ~150 ng 至 ~1 µg 肽段的样品。CE 在检测飞克至 <100 ng 范围的肽段时具有互补的高灵敏度。多种定制和商用 CE-ESI 接口可实现 CE 与 HRMS 的便捷耦合，并具有稳定性能35，目前正越来越多地用于单细胞分析18,36,37。
    1. 如需使用 CE 进行分离，请执行步骤 4.2.2–4.2.7。
      注意：以下描述使用定制 CE 平台测量肽段的方法。此前已提供该 CE 仪器的构建与使用方案38，以及用于小分子检测的可视化实验20。此外，也可使用商用 CE 系统，例如 AB SCIEX CESI、Agilent 7100 或同等设备。
    2. 将蛋白质消化产物重悬于 1–2 µL 样品溶剂中，涡旋混匀，然后在 10,000 × g 下离心 2 分钟，以沉淀细胞碎片。
      注意：去除细胞碎片可降低毛细管堵塞的风险，从而延长分离系统的使用寿命并提高检测通量。
    3. 通过用背景电解质（BGE）冲洗 CE 毛细管，启动 CE-ESI 仪器。
    4. 使用已知标准品（例如细胞色素 C 或 BSA 消化物、血管紧张素肽段）验证仪器性能。
      注意：在检测珍贵样品前，建议评估仪器的质量准确性、检测灵敏度、重复性以及定量的线性动态范围。有关 CE-ESI-MS 性能验证和故障排除的更多说明见其他文献18,20,38。
    5. 将约 1–10 nL 样品注入 CE 分离毛细管中。
      注意：本研究使用长约 1 米的熔融石英毛细管（内径/外径：40/110 µm），配备电动泵驱动的鞘流装置。商用 CE 仪器通常要求将 5–10 µL 样品置于微量样品瓶中用于进样。定制 CE 平台18,38 可兼容 250 nL 至 1 µL 样品体积，置于样品加载微量瓶中。
    6. 将 CE 分离毛细管的进样端转移至 BGE 中。
    7. 通过逐步升高 CE 分离电压（例如在 1 分钟内逐步升高）启动电泳分离。20–28 kV 的电压和低于 ~10 µA 的电流可确保仪器在分析过程中稳定且可重复运行。
    8. 如需使用 nanoLC 进行分离，请执行步骤 4.2.9–4.2.12。
    9. 将肽段样品重悬于流动相 A 中。样品浓度和进样体积取决于所用 LC 系统和色谱柱。本研究中，将约 250 ng–1 µg 蛋白质消化物溶于 1–20 µL 样品体积，注入 C18 填充柱（内径 75 µm，粒径 2 µm，孔径 100 Å，分离柱长度 25 cm）。
    10. 将样品转移至 LC 样品瓶中。
      注意：确保样品瓶中无气泡，以免损坏分析柱。对于低体积组织或单细胞样品，可使用带插件的样品瓶。
    11. 将约 200 ng 至 2 µg 肽段样品加载至 C18 分析柱上。
      注意：可选地，可在分析分离前将肽段加载至捕获柱进行脱盐。例如，使用 C18 捕获柱（内径 0.1 mm，粒径 5 µm，孔径 100 Å，长度 20 mm）。在分离梯度开始前，以 5 µL/min 流速用 100% 缓冲液 A 对肽段进行 5 分钟脱盐。
    12. 采用梯度洗脱分离肽段。在 300 nL/min 流速下，本研究使用的 120 分钟梯度如下：0–5 分钟 2% B，5–85 分钟 2–35% B，86–90 分钟 70% B，91–120 分钟 2% B。
  3. 通过电喷雾电离（ESI）使肽段离子化
    注意：CE 或 nanoLC 毛细管通常与 ESI 源耦合以实现离子化。此前已开发出用于超灵敏检测的微流（平头）和纳流（锥形尖端39 及电动泵驱动的鞘流36 设计）CE-ESI 接口。
    1. 使用商用或定制 ESI 接口，将分离中的肽段送入电喷雾离子源进行离子化。在 Xenopus 胚胎的单细胞 CE-ESI-MS 分析中，使用电动泵驱动的低流速接口，其中 CE 毛细管出口被包裹在拉制的硼硅酸盐发射器内。
    2. 使用摄像头检查电喷雾发射器中的液体流动，并目视检查装置是否存在可能的泄漏。
    3. 将电喷雾电压设为约 2.5 kV，以启动 ESI 源（相对于接地）。
    4. 通过监测总离子流，确保 HRMS 分析中纳喷雾的稳定性。调节电喷雾电压和发射器与 HRMS 进样口之间的距离，以获得稳定的喷雾（总强度的相对标准偏差 <15%）。
  4. 检测肽段
    注意：肽段的检测需根据是否使用同重质量标签以及可用质谱仪类型，采用不同的仪器设置。本研究使用轨道阱三合一质谱仪，按以下步骤操作。
    1. 以以下参数采集 MS1 事件：分析器，轨道阱；分辨率，120,000 半峰全宽（FWHM）；最大注入时间（IT），50 ms；自动增益控制（AGC），4 × 105 计数；微扫描次数，1。
    2. 为测序肽段，使用以下参数在离子阱分析器中对前体离子进行碎裂检测：碎裂模式，高能碰撞解离（HCD）；碰撞气，氮气；碰撞能量，32% 归一化碰撞能量（NCE）；最大 IT，70 ms；AGC，1 × 104 计数；微扫描次数，1。
    3. 可选：使用串联/多级高分辨质谱（MS2/MS3）对 TMT 标记肽段进行定量。对于采用同步前体选择的 MS3，典型仪器设置如下：单级（MS1）扫描检测最丰富的离子，通过数据依赖采集进行解离，参数为：MS2 碎裂模式，碰撞诱导解离（CID）；碰撞气，氦气；碰撞能量，35% NCE；碎片离子分析器，离子阱，参数为：最大 IT，50 ms；AGC，5 × 104 计数；微扫描次数，1。选择 10 个 MS2 碎片离子，并在氮气中以 HCD（65% NCE）进行二次碎裂。使用以下参数检测 MS3 碎片离子：轨道阱分辨率 15,000 FWHM，最大 IT，120 ms；AGC，1 × 105 计数；微扫描次数，1。
      注意：对于标记样品，可依据供应商建议采用其他 MS 采集方法和参数，详见其他文献11,40。
  5. 数据分析
    注意：使用先进的生物信息学软件包进行蛋白质鉴定和定量。通过诱饵数据库计算鉴定的可靠性，并以肽段和蛋白质水平的假阳性发现率（FDR）表示。
    1. 使用商业或开源软件包处理数据（参见参考文献41 的综述）。将原始数据与数据库进行比对，该数据库由 Xenopus 蛋白质组 9.2 版本与 mRNA 衍生的 PHROG 数据库42 拼接而成。
      注意：搜索参数包括：消化酶，胰蛋白酶；漏切位点，最多 2 个；可变修饰，甲硫氨酸氧化；固定修饰，半胱氨酸羧甲基化；前体离子质量容差，10 ppm；碎片离子质量容差，0.6 Da；最短肽段长度，5；鉴定可靠性，肽段和蛋白质水平的 FDR <1%。若肽段未进行烷基化处理，则在数据库搜索中排除羧甲基化作为固定修饰（例如单细胞分析）。
    2. 通过非标记43 或基于标记的策略44,45 进行蛋白质丰度定量。
    3. 可选：对蛋白质进行基因本体（gene ontology）注释。可使用 PantherDB46、Reactome47 或 Xenbase23。
    4. 可选：使用软件包或网络工具（如 Trans-Proteomic Pipeline48、Perseus49 和 Orange50）对不同细胞/组织类型中的蛋白质丰度及其差异进行定量。
      注意：有关实验设计和软件选择的其他考虑因素，参见其他文献综述41,51。
    5. 可选：使用知识库进一步评估结果，例如使用 STRING52 和 BioPlex Display53 分析已知的蛋白质-蛋白质相互作用，使用 PhosphoSiteplus54 分析磷酸化修饰。为分析蛋白质组中包含的基序和结构域，可使用 Simple Modular Architecture Research（SMART）55 等网络工具。

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结果

该方案使得在单细胞及其谱系形成组织的过程中对蛋白质进行研究成为可能 X. laevis 胚胎 图1 展示了该方法在研究神经组织命运细胞及胚胎中新诱导的神经外胚层中蛋白质的一种应用。如图所示 图1A生物分析工作流程结合了细胞与发育生物学的传统工具，用于识别、注射/吸取细胞以及采集样本。 图1B 显示对左侧背侧动物极（D11) 16细胞胚胎中的细胞 体内 使用显微注射仪；实验结束后，胚胎成功发育为具有正常解剖结构的蝌蚪56. 大型胚胎细胞（约100-250 µm 直径）也适用于手工显微解剖。对右侧背侧-动物极中线（D11) 细胞从16细胞期胚胎中示出 图1C该装置还允许通过向已鉴定的前体细胞注射荧光示踪剂来追踪克隆轨迹。如图所示

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讨论

本方案可实现对爪蟾（Xenopus）物种胚胎中已鉴定细胞谱系的蛋白质表达进行表征。该方法源于高分辨质谱（HRMS），结合了分子鉴定的极高特异性、无需分子探针即可同时检测多种蛋白质（通常为数百至数千种不同蛋白质）的能力，以及定量分析能力。该技术可与细胞和发育（神经）生物学中的经典工具和工作流程相兼容，从而将HRMS蛋白质组学拓展至一系列引人注目的应用，包括对脊椎动物非洲爪蟾（X. laevis）胚胎中干细胞分化的整体性表征。

本步骤描述了在X. laevis胚胎中进行的细胞谱系导向蛋白质组学研究。作为示例，我们展示了神经命运单细胞及其谱系的分析，并通过公共数据存储库提供了相应的毛细管电泳和纳米液相色谱高分辨质谱数据集（参见PRIDE）。该方法可轻松适用于多种细胞类型（及谱系）中蛋白质时空调控的研究。在发育胚胎中进行的时空导向蛋白质组学还可拓展至转录组学和代谢组学研究，以促进对细胞分化及关键器官（如神经系统）发育的分子系统生物学理解。

本方案为生物分析增添了新的维度。细胞培养，...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢马里兰大学帕克分校的 Jie Li 在胚胎解离和流式细胞分选（FACS）方面的宝贵讨论。感谢 Vi M. Quach 和 Camille Lombard-Banek 在先前研究中对样本制备和数据收集提供的帮助，这些研究展示了本实验方案中重点介绍的蛋白质组学应用。本工作的部分内容得到了美国国家科学基金会 IOS-1832968 CAREER 项目（授予 P.N.）、美国国立卫生研究院 R35GM124755 项目（授予 P.N.）、马里兰大学与美国国家癌症研究所合作项目（授予 P.N.）以及 COSMOS Club Foundation 研究奖（授予 A.B.B. 和 L.R.P.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈（LC-MS级）Fisher ScientificA955
琼脂糖ThermoFisher ScientificR0492
碳酸氢铵Fisher ScientificA643-500
分析柱Thermo Scientific164941
分析型微量天平Mettler-ToledoXSE105DU
自动肽段分离平台Agilent1260 Infinity II
硼硅酸盐毛细管Sutter Instruments Co.B100-50-10
硼硅酸盐毛细管（用于制作Emmitter）Sutter InstrumentsB100-75-10
C18离心柱（用于脱盐）ThermoFisher Scientific89870
电喷雾监测相机Edmund Optics Inc.EO-2018C
康普拉他汀A4Millipore SigmaC7744
商用CESI系统AB SCIEXCESI
环己氨基丙磺酸（CAPS）VWR97061-492
细胞松弛素DMillipore SigmaC8273
葡聚糖，Alexa Fluor 488标记；分子量10,000，阴离子型，可固定ThermoFisher ScientificD22910
二硫苏糖醇Fisher ScientificFERR0861
Dumont #5镊子Fine Science Tools11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
落射荧光光源LumencoreAURA III
Eppendorf LoBind微量离心管：蛋白用 Fisher Scientific13-698-793
甲酸（LC-MS级）Fisher ScientificA117-50
冷冻冰箱（-20 °C）Fisher Scientific97-926-1 
超低温冰箱（-80 °C）Thermo ScientificTSX40086A
熔融石英毛细管Molex1088150596
加热金属块BenchmarkBSH300
高效液相色谱系统ThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
高压电源SpellmanCZE1000R
高分辨率质谱仪ThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC瓶盖Thermo ScientificC4013-40A
HPLC小瓶Thermo ScientificC4013-11
照明装置（例如鹅颈灯）NikonC-FLED2
Ingenuity通路分析软件Qiagen
碘乙酰胺Fisher ScientificAC122275000
甲醇（LC-MS级）Fisher ScientificA456
甲醇（LC-MS级）Fisher ScientificA456-4
微毛细管拉制仪Suttor InstrumentsP-2000
显微注射器Warner Instrument, Handem, CTPLI-100A
微量移液器拉制仪Sutter Instruments Co.P-1000
质谱数据分析软件，商业版ProteomeDiscoverer
质谱数据分析软件，开源版MaxQuant
非离子型去污剂替代物NP-40Millipore Sigma11754599001
培养皿（60 mm和80 mm）Fisher ScientificS08184
Pierce 10 µL填料Zip-tip（用于脱盐）ThermoFisher Scientific87782
Pierce二辛可宁酸蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23225
Pierce定量比色肽检测试剂盒ThermoFisher Scientific23275
Pierce胰蛋白酶（质谱级）Fisher ScientificPI90058
蛋白LoBind样品瓶Eppendorf0030108434
, 0030108442
制冷离心机Eppendorf5430R
制冷培养箱Thermo ScientificPR505755R/3721
异乙磺酸钠Millipore Sigma220078
焦磷酸钠Sigma Aldrich221368-100G
不锈钢BGE样品瓶定制
不锈钢样品瓶定制
体视显微镜（10倍物镜）NikonSMZ 1270, SZX18
蔗糖VWR97063-790
注射泵（2台）Harvard Apparatus704506
气密性注射器：500–1000 µLHamilton1750TTL
移液管（塑料，一次性）Fisher Scientific13-711-7M
捕获柱Thermo Scientific164750
Tris-HCl（1 M溶液）Fisher ScientificAAJ22638AP
可在4–10 °C运行的真空浓缩仪Labconco7310022
涡旋混合器BenchmarkBS-VM-1000
水（LC-MS级）Fisher ScientificW6
水（LC-MS级）Fisher ScientificW6
XYZ三维平移台ThorlabsPT3
XYZ三维平移台定制

参考文献

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