通过血管周围应用弹性蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤模型

摘要

本方案描述了一种标准化的手术方法，通过将弹性蛋白酶直接作用于小鼠肾下腹主动脉的外膜，以建立弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤（AAA）模型。

摘要

腹主动脉瘤（AAA）虽然主要表现为无症状，但一旦破裂通常会导致严重后果，因此具有潜在的生命危险。目前已有多种不同的AAA实验模型，每种模型侧重于AAA发病机制的不同方面。其中，弹性蛋白酶诱导的AAA模型是使用频率第二高的啮齿类动物AAA模型。该模型通过将猪胰弹性蛋白酶（PPE）直接灌注或施用于肾下腹主动脉段来建立。由于技术上的挑战，目前大多数弹性蛋白酶诱导的AAA模型采用的是外部应用PPE，而非腔内灌注。弹性蛋白酶的渗透会导致中膜层弹性板层的降解，从而破坏主动脉壁的完整性，并继而导致腹主动脉扩张。然而，该模型的一个缺点是手术操作不可避免地存在变异。具体而言，分离肾下腹主动脉段的手术技术、用于包裹主动脉和孵育PPE的材料、PPE的酶活性以及PPE作用的时间长短，均可能成为影响最终AAA形成率和动脉瘤直径的重要因素。值得注意的是，不同研究中这些因素的差异可能导致实验结果难以重复。本文详细描述了在小鼠中通过将PPE直接应用于肾下腹主动脉外膜来建立弹性蛋白酶诱导AAA模型的外科手术过程。按照此操作流程，可在雄性和雌性小鼠中实现约80%的稳定AAA形成率。通过建立标准化的手术操作程序，可显著提高采用弹性蛋白酶诱导AAA模型进行研究的一致性和可重复性。

引言

腹主动脉瘤（AAA）是指腹主动脉的节段性扩张，其血管直径至少增加50%¹腹主动脉瘤（AAA）具有潜在致命性，因为一旦破裂，即使进行干预，死亡率也极高。^2,3,4据报告，AAA 每年在美国造成约 13,000 人死亡，使其成为第 10 位^th 死亡主要原因^1,5.

目前，腹主动脉瘤（AAA）的发病机制尚未完全阐明^6,7,8。为了研究AAA的分子机制并验证潜在的治疗靶点，已建立了多种实验性AAA模型^9,10。啮齿类动物的AAA模型包括弹性蛋白酶模型、氯化钙模型、血管紧张素II模型和异种移植模型，其中弹性蛋白酶诱导的AAA模型是使用频率第二高的模型^{10,11,12,13,14,15,16,17}。该模型通过将猪胰弹性蛋白酶（PPE）直接灌注或施用于肾下腹主动脉段来建立。弹性蛋白酶穿透至主动脉中膜层后，会导致弹性板层降解和炎性细胞浸润，从而破坏主动脉壁的完整性，继而引起腹主动脉扩张^7,18。弹性蛋白酶诱导的AAA模型最早由Anidjar等人于1990年在大鼠中报道，其方法是对一段游离的主动脉进行弹性蛋白酶灌注¹⁷。随后在2012年，Bhamidipati等人报道了一种改良模型，采用PPE的外膜周围应用方式¹⁹。如今，大多数弹性蛋白酶诱导AAA模型的手术操作均借鉴Bhamidipati团队的方法，采用外部施用而非管腔内灌注PPE。尽管外部施用对精细外科技术的要求较低，但其AAA发生率相对较低，且瘤体尺寸略小于管腔内灌注法^11,19。

尽管在腹主动脉瘤（AAA）研究中广泛使用，弹力酶诱导的AAA模型仍存在某些局限性。该模型的一个注意事项是手术操作不可避免地存在差异，这可能导致可重复性问题。例如，不同实验室在手术过程中对肾下腹主动脉段的分离方式以及选择该段中哪一部分应用胰蛋白酶（PPE）可能存在差异。PPE的酶活性及其孵育时间也可能有所不同。然而，这些因素都是影响最终AAA形成率和动脉瘤直径的关键决定因素。这些关键因素的变异使得使用该模型的不同研究团队之间的数据比较非常困难。因此，需要一种标准化的手术操作流程，作为从不同机构获得可比结果的工具。

本文介绍了一种标准化的手术方案，通过将猪胰弹性蛋白酶（PPE）直接应用于小鼠肾下腹主动脉的外膜，以诱导弹性蛋白酶型腹主动脉瘤（AAA）模型。同时还将讨论使用该模型在小鼠中成功且稳定地诱导AAA所必需的手术材料与操作细节。

方案

动物实验方案已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（PRO00010092）的批准。实验使用约7周龄的雄性和雌性C57BL/6J野生型（WT）小鼠。

1. 动物准备

1. 用标准饲料喂养小鼠（参见 材料表手术前后
   ​注意：可使用不同品系和年龄的小鼠，但建议使用5.5至12周龄的小鼠，以获得最高的发病率。
2. 每只小鼠在麻醉诱导前30分钟，皮下注射5 mg/kg的卡洛芬。
3. 30分钟后，给予100 mg/kg的氯胺酮和5 mg/kg的赛拉嗪 通过 腹腔注射以诱导麻醉。

2. 手术准备

1. 准备手术材料。
   1. 将丁腈手套剪成 4 cm × 4 mm 的条状，将棉垫剪成 3 cm × 2 mm 的小片。将这些材料与其他手术器械（包括手术剪、组织镊和哈尔斯泰德-蚊式止血钳）一同进行高压灭菌（参见材料表）。
2. 将小鼠仰卧置于无菌吸水敷料垫上，用手术胶带固定其前肢和后肢。
3. 使用棉签（参见材料表）将脱毛乳液涂抹于腹部中下区域，然后用外科纱布擦拭以去除毛发。
4. 使用70%酒精和含碘或氯己定的消毒液交替擦拭手术区域，以环形方式至少消毒三次 ，然后静置晾干。

3. 手术步骤

1. 执行以下步骤以进入腹腔。
   1. 在切开皮肤前，测试小鼠是否无脚趾夹捏反应。
   2. 使用手术剪沿中下腹部正中线做一条2.5 cm的纵向皮肤切口。
   3. 轻轻提起下方肌肉组织，沿腹白线做一条2.5 cm的纵向切口，以进入腹腔。
2. 暴露腹主动脉。
   1. 使用湿润的棉签将小鼠的肠道和胃向右侧移位。
      注：理想情况下，这将暴露主动脉的肾下段。若难以定位主动脉，可通过右肾和右肾动脉来识别主动脉（因为右肾的解剖位置略低于左肾）。
   2. 使用镊子轻轻去除覆盖在腹主动脉和下腔静脉（IVC）上的结缔组织。
      注：腹主动脉和下腔静脉位于同一血管鞘内。无需完全去除所有结缔组织，因为彻底清除会增加损伤这两条血管的风险。
   3. 使用镊子轻轻分离腹主动脉和下腔静脉背侧与下方肌肉组织的连接。
      注：镊子尖端应横向插入血管鞘背侧，在连接鞘与下方肌肉的筋膜上制造一个小孔。一旦形成小孔，通过缓慢张开镊子将其扩大。
   4. 将一段4 cm × 4 mm的手套条带（如前所述，步骤2.1.1）从腹主动脉和下腔静脉背侧穿过，然后拉直条带，将其置于距右肾动脉约0.5 cm处。
      注：确保小孔足够大，以免周围筋膜扭曲条带。
   5. 在条带上方，将一块3 cm × 2 mm的棉垫从腹主动脉和下腔静脉背侧穿过，然后拉直棉垫。
3. 孵育弹性蛋白酶。
   1. 使用移液器将30 µL猪胰弹性蛋白酶（总酶活性为1.8单位，参见材料表）滴加到棉垫上方的主动脉段上，然后将棉垫和条带包裹在主动脉和下腔静脉周围。用无菌0.9%生理盐水冲洗一块10 cm × 10 cm的纱布，并将其覆盖在腹部。
      ​注：纱布仅需部分润湿，过度润湿可能导致稀释下方的弹性蛋白酶。
   2. 30分钟后，用镊子移除条带和棉垫。
4. 按照以下步骤关闭腹腔。
   1. 用500 µL无菌0.9%生理盐水冲洗主动脉和腹腔。使用10 cm × 10 cm的纱布吸除残留盐水。
   2. 使用连续缝合的6-0不可吸收单丝缝线对合肌层。
   3. 使用3–4针间断的6-0不可吸收单丝缝线缝合皮肤。

4. 术后护理

1. 术后第1天皮下注射5mg/kg的卡洛芬。
2. 术后第10天拆除皮肤缝线。

5. 腹主动脉瘤直径的测量

1. 在术后第14天通过过量二氧化碳（CO₂）实施安乐死。此时间点代表最大扩张状态。
2. 按照步骤3.1所述方法进入腹腔。
3. 通过左心室向循环系统注入10 mL 0.9%生理盐水，进行血管灌注。
4. 按照步骤3.1–3.2所述方法暴露腹主动脉的肾下段。仔细清除周围结缔组织，并将腹主动脉与下腔静脉（IVC）分离。
5. 使用卡尺测量腹主动脉的直径。

结果

共使用23只7周龄野生型（WT）小鼠，包括12只雌性和11只雄性，按照本方案进行手术操作。术后存活率为100%（不包括手术死亡率）。使用游标卡尺测量腹主动脉的最大直径。

AAA 定义为腹主动脉扩张，其血管直径增加50%。因此，选择腹主动脉最大直径增加50%作为成功诱导AAA的临界值。根据此标准，术后第14天雌性动物的AAA发生率为91.7%，接受手术的12只动物中有11只发生AAA；而雄性动物的发生率为72.7%，接受手术的11只动物中有8只发生AAA（图1A）。在共19只发生AAA的动物中，雌性和雄性动物的腹主动脉最大直径分别较未手术对照组增加了1.7倍和1.6倍（图1B）。术后第14天未手术组和手术组主动脉的代表性图像如图1C所示。

讨论

1990年，Anidjar等人首次报道了使用大鼠建立的弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤（AAA）模型¹⁷。在过去的三十年中，该模型出现了多种改良版本，同时手术技术也得到了显著改进^19,20,21,22。目前，全球数百家研究机构采用弹性蛋白酶诱导的AAA模型作为AAA研究中使用频率第二高的啮齿类动物实验模型¹²。由于不同研究团队在实施该模型手术时难免存在细微差异，因此该模型存在一个固有的局限性，即手术操作的不一致性，这使得使用该模型的不同研究组之间的数据比较极为困难。这些差异包括但不限于：如何暴露腹主动脉的肾下段、对覆盖主动脉的筋膜层清理的程度、孵育时间的长短，以及用于包裹主动脉和进行弹性蛋白酶孵育的材料种类和所添加弹性蛋白酶的体积。然而，上述每一个因素都是影响最终AAA发生率和瘤体直径的关键决定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-0 非吸收性单丝缝合线	Pro Advantage	P420697
卡洛芬	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
普通饲料	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
棉签	Dynarex	4303
棉垫	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		版本 8.4.3
格拉夫镊	Fine Science Tools	11051-10
哈尔斯特德蚊式止血钳	Fine Science Tools	13009-12
氯胺酮	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
丁腈手套	Fisherbrand	19-130-1597
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140122
猪胰弹性蛋白酶	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
剪刀	Fine Science Tools	14068-12
无菌 0.9% 氯化钠溶液	Baxter	2B1324X
赛拉嗪	Akorn	NDC: 59399-110-20