本文旨在描述在小鼠中进行异位喉移植所需的显微外科手术步骤。与其他喉移植动物模型相比，该小鼠模型的优势在于成本效益高，并且可获得丰富的免疫学检测手段及相关数据。
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摘要
摘要
喉部异位移植尽管在技术上具有挑战性，但与其他动物模型相比，可提供更多科学分析和成本优势。尽管该技术最早由 Shipchandler 等人于 2009 年描述，但目前尚未广泛应用，可能是因为显微外科技术的学习难度较大且掌握所需时间较长。本文详细描述了手术步骤以及需要避免的潜在问题，以促进该技术的有效应用。
在此模型中，供体喉的双侧颈动脉与受体的颈动脉和颈外静脉进行吻合，以实现移植物内的血流。术中可通过观察移植物双侧颈动脉的充血情况、移植物甲状腺组织变红以及移植物内微小血管出血来确认血流。手术成功的关键要素包括精细保护移植物血管、制作合适大小的动脉切口和静脉切口，以及在动脉-动脉和动脉-静脉吻合处使用适当数量的缝线，以确保血管牢固、无渗漏并防止闭塞。
只要有足够的训练，任何人都可以熟练掌握该模型，并在大约3小时内完成操作。如果操作成功，该模型可方便且低成本地开展免疫学研究。
引言
对于患有不可修复的喉部损伤或喉癌的患者，全喉切除术往往是唯一的选择1。全喉切除术使患者丧失自主呼吸和说话的能力，同时还会经历社会和心理方面的困扰2。需要接受全喉切除术的喉癌患者是喉移植的潜在理想候选者。尽管已有在不可修复喉部损伤情况下实施人类喉移植的先例，但由于担心肿瘤复发、慢性排斥反应以及供体来源感染等问题，目前临床上仍避免对这类患者进行喉异体移植3 。免疫抑制治疗是引发上述担忧的主要原因。首例部分喉移植患者在接受常规免疫抑制治疗后因肿瘤复发而死亡，这一悲剧性事件表明，在对喉癌患者进一步尝试移植之前，必须制定出合适的免疫抑制方案4,5。
为了更好地理解宿主对移植喉的免疫反应，Strome 于1992年建立了首个大鼠喉移植模型，并于2002年对该手术技术进行了改进6,7。尽管该模型在研究喉移植方面具有有效性，但由于缺乏大鼠特异性的免疫学试剂以及大鼠模型较高的成本，研究人员于2009年开发了一种新的小鼠模型用于喉移植研究8。
该技术的主要应用是研究喉移植中不同的免疫抑制药物方案。改进现有的免疫抑制治疗可能扩大候选人群，并使癌症患者的安全移植成为可能。该小鼠模型的优势在于成本效益高，且免疫学数据和试剂来源广泛。
进行喉移植免疫抑制治疗方案研究的团队可利用该方法收集大量免疫学数据，并快速测试和比较不同的药物治疗方案。此外，该模型还可用于评估其他可能调节机体对移植组织免疫反应的潜在治疗方式，例如干细胞注射。最后，通过延长随访时间，可设计实验以观察喉移植后的长期全身性影响。
本文所述技术采用端侧吻合方式，为异位喉移植体提供动脉和静脉血流。该移植体为喉气管食管（LTE）复合体，包含供体的喉、甲状腺、甲状旁腺、气管和食管，并保留双侧颈动脉及其血管蒂。将供体的一侧颈动脉与受体的颈动脉进行吻合，以提供动脉血供；而供体的另一侧颈动脉则与受体的颈外静脉进行吻合，以实现静脉回流（图1）。
为了确保在小鼠模型中取得成功，对大鼠模型的手术技术进行了多项改进。例如，采用吸入性麻醉剂替代注射性麻醉剂，以更好地控制麻醉深度并减少并发症。在大鼠的动脉-动脉吻合中通常采用连续缝合；然而，由于小鼠血管更细小，该技术操作困难，可能导致血管腔狭窄7。因此，在小鼠模型中采用间断缝合，从而提高了血管通畅率。此外，在大鼠模型中，需游离并显露甲状腺上动脉（STA）血管蒂；但鉴于小鼠的STA更细小，此类游离操作可能导致STA损伤甚至横断。因此，在小鼠模型中不进行该步骤的解剖，而是保留邻近筋膜，以确保STA保持完整。
该技术的主要潜在风险包括损伤供体LTE复合体的蒂部、动脉切口或静脉切口大小不当、吻合部位血管闭塞，或吻合部位存在间隙而导致出血。为避免这些失误，在获取供体移植物时应小心操作，于STA蒂周围保留一圈组织袖状结构。动脉切口和静脉切口应足够大以保证血流畅通，但又不宜过大以免引起渗漏。吻合时应使用适当数量的缝线以闭合任何间隙，但缝线不宜过多以免导致血管闭塞。
如果已掌握显微外科技术，该手术大约可在3小时内完成。这种喉部移植模型可在小鼠中稳定实施，用于研究血管化复合异体移植后宿主的免疫反应。
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方案
本研究严格遵守梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。选用10至12周龄的BalbC小鼠作为供体，10至12周龄的C57/BL6小鼠作为受体，因为它们的主要组织相容性复合物分别为H-2Db和H-2Kb，具有免疫学上的不相容性，因此可进一步研究对移植物的免疫反应。手术过程中使用的所有器械均经过灭菌处理（参见补充图S1和补充图S2），并根据IACUC的指导，在整个实验过程中保持手术区域的无菌状态。
1. 供体手术与移植物获取
- 在开始操作前30分钟，向供体注射缓释布托啡诺（3.25 mg/kg体重，皮下注射）。将小鼠置于啮齿类动物麻醉盒中，以1 L/min的氧气流速输送3%异氟烷进行麻醉诱导。2 流动。动物完全麻醉后，将小鼠转移至剃毛区域，并以1 L/min的氧气流速给予1.5%异氟烷2 以维持麻醉。通过夹捏脚趾确认麻醉深度。
- 剃除小鼠胸部和颈部至下颌线的毛发，并涂抹脱毛膏。30秒后，用浸水的无菌纱布擦拭去除脱毛膏，将小鼠转移至手术区域。
- 为小鼠的眼睛涂抹眼用润滑剂。将小鼠置于铺有隔巾的辅助加热垫上，以维持其正常体温。
- 固定小鼠，用聚维酮碘和酒精对手术区域进行三次消毒，然后为小鼠铺巾。
注意：通过夹捏脚趾检查麻醉深度，并维持麻醉在 1.5% 异氟烷和 1 L/min 氧气2 流 通过 在整个操作过程中佩戴口罩。 - 在胸骨上切迹上方略作一小的横向切口。使用精细剪刀，经由此切口将皮肤向两侧掀起至下颌骨。切除一块梯形皮肤区域，暴露双侧唾液腺、胸锁乳突肌、二腹肌及胸骨上部。图2A).
- 使用电灼法在可见一条小静脉穿行的腺体上部切除双侧唾液腺图2A).
注意：如果在切除腺体前未小心地对血管进行电凝止血，此步骤中可能会出现明显出血。 - 轻轻向外侧牵拉淋巴组织和脂肪组织，以暴露胸锁乳突肌和带状肌。从周围组织中分离双侧胸锁乳突肌，并使用牵开器将其向外侧牵开。
注意：该操作将完全暴露喉气管食管复合体及带状肌，并为颈动脉的解剖提供充足的操作空间（图2B). - 在带状肌之间做正中切口，并双侧切除带状肌，注意避免损伤下方的甲状腺，将其保留在喉气管食管复合体上。
注意：此步骤之后，应能观察到双侧颈总动脉（图2C). - 沿纵轴解剖颈总动脉，向下至锁骨水平，向上至颈动脉分叉处。将迷走神经和颈内静脉从颈总动脉周围分离，获取移植物时不得包含这些结构。
注意：甲状腺上动脉位于分叉处稍上方，向内侧走行，可见于此处。保留围绕该血管的薄层筋膜，不要尝试对其进行环周解剖。此血管为喉-甲状腺-食管复合体（LTE复合体）供血，移植后将作为血管蒂。保护此血管至关重要。 - 向上充分游离颈内动脉和颈外动脉，以便结扎并切断。若血管显露困难，可使用另一拉钩将二腹肌向侧方牵开。
注意：避免在靠近分叉处解剖颈外动脉，以防损伤甲状腺上动脉。在此步骤中，可能会遇到自颈外动脉发出并平行于颈内动脉走行的枕动脉，应注意不要将其与更大且位置更深的颈内动脉混淆。图 2D). - 使用8-0尼龙缝线，在颈动脉分叉上方2至3 mm处结扎颈内动脉。在甲状腺上动脉分支点上方至少3 mm处结扎颈外动脉。
注意：完成这些吻合后，LTE 复合体将带有蒂部 通过 甲状腺上动脉至双侧颈动脉。 - 在胸骨水平结扎双侧颈总动脉，并在两侧切断所有已结扎的血管。保留LTE复合体上方的血管蒂，以避免在后续解剖过程中造成意外损伤。为防止气体泄漏或麻醉意外丢失，务必确认动物已死亡，然后再进行气道切割。
- 在舌骨水平横断舌骨下肌群。在舌骨下方稍作前正中咽部切开，将切口向下延伸至椎前筋膜，以松解喉气管食管复合体的上方部分。
- 在第五气管环下方横断气管，并将切口延伸通过食管至椎前筋膜，以松解喉气管食管复合体的下部。由下向上游离气管和食管与其下方的椎前筋膜。
注意：将血管蒂置于LTE复合体上方，以避免在后续解剖过程中意外损伤。 - 在舌骨下方稍低处做一前咽切开术。将切口向下延伸至椎前筋膜，以游离上方的下咽缩肌复合体。切断下咽缩肌复合体与周围组织之间任何残留的淋巴样组织或结缔组织连接。取出移植物。
注意：移植物包含供体的喉、气管、甲状腺、甲状旁腺、食管以及喉部肌肉，作为一个复合结构图2E).
2. 移植物制备
- 将获取的移植物置于无菌培养皿中，用生理盐水冲洗以去除任何血凝块。使用显微镊子轻轻挤出双侧颈动脉内的血液和血凝块。使用1 mm显微扩张器扩张双侧颈动脉。
- 使用30 G钝头针，向每侧颈动脉注入约2 mL肝素化生理盐水以冲洗移植物。
注意：可见血液和盐水从对侧颈动脉及小的游离血管断端流出，这表明上甲状腺动脉完整无损。 - 剥离动脉断端周围的外膜，使其边缘清晰，便于吻合。
注意：移植物可保存在肝素化生理盐水中，在移植到受体前可短暂中断操作，最长可达3小时9。
3. 受体手术与血管吻合
- 在麻醉诱导、剃毛和手术准备步骤后，以与供体相同的方式准备受体小鼠。在手术开始前30分钟，皮下注射缓释镇痛剂至受体小鼠体内。
- 使用手术刀，从下颌线向上至胸骨向下做一条正中颈部切口。将左侧皮肤抬起并向外侧牵拉。
- 切除左侧唾液腺，并如前所述电凝上方血管。使用低温电凝分离任何可见血管，切除脂肪组织和淋巴样组织，注意避免损伤下方的颈外静脉（图3A）。
- 环周游离颈外静脉。用于吻合的血管应至少保留5 mm的无遮挡长度。使用低温电凝处理或结扎并切断从颈静脉分出的相对较大的静脉分支。
- 游离胸锁乳突肌并向外侧牵拉。将已游离的静脉置于该肌肉后方加以保护，避免与牵开器直接接触。
- 切除左侧带状肌以暴露受体颈总动脉。从下方锁骨水平至上方颈动脉分叉处，环周游离颈总动脉（图3B）。
- 将背景材料置于颈外静脉下方，并安装双夹式V3血管夹。
- 在预定静脉切开部位的颈外静脉前壁穿入一根10-0尼龙缝线，利用此缝线向前牵拉并 tent 起血管。
- 用显微剪刀沿缝线位置剪开，深度仅需形成适当大小的单一切口式静脉切开，并确保切口完全穿透静脉壁。
- 使用30 G钝头针，以肝素化生理盐水冲洗静脉内部。
- 将供体LTE复合体置于受体左侧颈总动脉与左侧颈外静脉之间。使供体左侧颈总动脉的游离端朝向受体左侧颈外静脉，并用锐利剪刀将两血管断端斜面修整。
- 使用四针10-0尼龙间断缝合，以端侧方式吻合供体左侧颈总动脉与受体左侧颈外静脉。
- 将背景材料置于受体颈总动脉下方，在受体颈总动脉上安装双夹式A3血管夹。以与静脉切开相同的方式制作动脉切口。
注意：确保动脉切口大小与供体颈总动脉管腔一致。若过大，去除血管夹后将发生大量出血；若过小，则会阻碍移植物的血流。 - 使用六针10-0尼龙间断缝合，以端侧方式将供体右侧颈总动脉与受体左侧颈总动脉吻合。
注意：在整个血管吻合过程中应遵循正确的微血管操作技术。缝合穿透血管后壁将显著限制血流，危及移植物存活。由于血管尺寸极小，重新缝合极为困难。 - 移除静脉侧的血管夹。如出现出血，使用棉签轻压止血。
- 移除动脉侧血管夹，并立即使用棉签轻压止血。
注意：此步骤中预期会有少量出血，通常在轻压1分钟后停止。 - 检查动脉和静脉的血流完整性。
注意：当动脉血流通畅时，通常可见供体颈总动脉搏动，供体甲状腺颜色由充血透明状恢复为原本的红色。LTE复合体上小血管的红色充盈亦可观察到。 - 用肝素化生理盐水冲洗手术区域，并以5-0单股缝线连续缝合关闭皮肤切口。在切口处涂抹抗生素软膏或使用皮肤粘合剂。
- 皮下注射1 mL温生理盐水，以补偿术中液体丢失。
- 停止麻醉，将小鼠转移至恢复笼中。将其置于加热垫上观察直至完全清醒，以防低体温发生。
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结果
移植成功的确证
采用上述方案，可通过移除血管夹后观察供体颈动脉的搏动来评估LTE复合体的血流情况。通常可见搏动，且供体动脉迅速呈现鲜红色，表明存在活跃的血流（图 4A）。如果吻合效果不佳，则动脉无搏动、外观部分塌陷且颜色苍白（图 4B）。
另一种确认动脉通畅性的技术是在移除夹钳后观察供体甲状腺的颜色变化；甲状腺颜色由苍白转为红色，这一变化在数分钟内即可观察到。供体甲状腺右叶也会随着动脉血流而变红。相比之下，左叶距离动脉侧较远，需要更长时间才能获得充分的血流灌注。此外，可通过观察供体LTE复合体上细小游离血管末端的血流情况，作为进一步的确认依据。
移植喉气管复合体的获取
移植15天后，获取受体及移植的喉气管复合体。可通过将喉气管复合体从周围受体组织中游离解剖，并观察端侧吻合口，以评估吻合动脉的通畅性（
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讨论
在过去三十年中，喉癌的发病率和患病率分别上升了12%和24%，其中许多患者需要接受喉切除术进行治疗10。该手术会显著降低患者的生活质量，因此迫切需要替代性治疗方案。喉部带血管复合组织异体移植可改善患者的呼吸和言语功能；然而，在该技术能够临床应用于此类患者之前，仍需开展进一步研究。本文提供了一种经济高效的喉移植小鼠模型，可用于探索多种免疫抑制治疗方案。
该手术过程中有几个关键步骤，可能决定手术的成败。对于供体而言，分离时必须远离甲状腺上动脉，以避免损伤血管蒂。获取喉部时，还需在甲状腺上动脉周围保留一圈筋膜袖，以保护血管蒂并防止血管扭曲。灌注移植物生理盐水时，应检查血管蒂的完整性。若获取操作正确，血液应从对侧颈动脉及覆盖移植物的小毛细血管中流出。
接下来的关键步骤是创建动脉切口和静脉切口。在将缝线穿过血管以 tent（牵起）血管壁时，应确保缝线穿入和穿出的是血管腔，而不仅仅是外膜。这样，单一切口的动脉切口和静脉切口才能暴露血管腔，从而允许血液流通。在制作动脉切口和静脉切口时，切口应足...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。Egehan Salepci 的科研差旅及生活费用由土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）资助。
致谢
我们感谢 Randall Raish 在视频拍摄和编辑方面提供的出色帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #1 回形针 | 订书钉 | OP-7404 | 回形针需手工弯制成形，用作牵开器 |
| 1 cc 胰岛素注射器 | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon 尼龙缝线 | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide 针头 | BD | 305125 | 1 英寸 |
| 3 mL 鲁尔锁头注射器 | BD | 309657 | |
| 30 G 无菌标准钝头针 | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl 缝线 | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon 尼龙缝线 | Ethicon | 2815G | |
| Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11027-12 | 直型，1×2 齿 |
| 外膜剪 | S&T | SAS-10 | 19 mm，10 cm，直型 |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| 人工泪液润滑性眼用软膏 | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| 邦迪织物指端创可贴 | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| 聚维酮碘溶液棉签棒 | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| 布托啡诺注射液 | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| 无锁止夹持镊 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| 棉签 | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey 镊子 | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| 解剖板 | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon 无菌一次性培养皿 | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14029-10 | 弯型尖钝头，10 cm |
| Golden A5 两速刀头电推剪 | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| 敏感肌肤脱毛剂 | Nair | 2260000033 | |
| 肝素 | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 每 10 mL 含 10,000 USP 单位 |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| 低温微细尖电凝器 | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian 可视化背景材料 | Synovis Micro Companies | VB3 | 绿色 |
| 无框架微血管近合夹 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 适用于血管直径 0.4–1 mm |
| 小鼠面罩套件 | Xenotec | XRK-S | 小型 |
| 持针器 | S&T | C-14 W | 5.5"，8 mm，0.4 mm |
| Press n' Seal 保鲜膜 | Glad | 70441 | |
| 手术刀 | Braun | BA210 | 10 号刀片 |
| 单个微型血管夹 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31（8 mm），3×1 mm 圆钝头，黑色配对 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| 无菌酒精擦拭垫 | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| 无菌一次性手术洞巾 | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| 无菌纱布垫 | Dukal | 1212 | |
| 无菌生理盐水 | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| 无菌外科手套 | Gammex | 851_A | |
| 直型镊子 | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| 组织镊 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm，8 mm，0.3 mm |
| Vannas 图案剪 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm，8 mm，弯型 7 mm 刀刃 |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm 切割刃，弯型 |
| 血管扩张器头端 | Fine Science Tools | 00126-11 | 直径 0.1 mm/弯头 10/11 cm |
| 经典系列血管扩张器 | S&T | D-5a.3 W | 9 mm，0.3 mm，弯头 10 |
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