本文旨在描述在小鼠中进行异位喉移植所需的显微外科手术步骤。与其他喉移植动物模型相比，该小鼠模型的优势在于成本效益高，并且可获得丰富的免疫学检测手段及相关数据。
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本文内容
摘要
摘要
喉部异位移植尽管在技术上具有挑战性，但与其他动物模型相比，可提供更多科学分析和成本优势。尽管该技术最早由 Shipchandler 等人于 2009 年描述，但目前尚未广泛应用，可能是因为显微外科技术的学习难度较大且掌握所需时间较长。本文详细描述了手术步骤以及需要避免的潜在问题，以促进该技术的有效应用。
在此模型中，供体喉的双侧颈动脉与受体的颈动脉和颈外静脉进行吻合，以实现移植物内的血流。术中可通过观察移植物双侧颈动脉的充血情况、移植物甲状腺组织变红以及移植物内微小血管出血来确认血流。手术成功的关键要素包括精细保护移植物血管、制作合适大小的动脉切口和静脉切口，以及在动脉-动脉和动脉-静脉吻合处使用适当数量的缝线，以确保血管牢固、无渗漏并防止闭塞。
只要有足够的训练，任何人都可以熟练掌握该模型，并在大约3小时内完成操作。如果操作成功，该模型可方便且低成本地开展免疫学研究。
引言
对于患有不可修复的喉部损伤或喉癌的患者，全喉切除术往往是唯一的选择1。全喉切除术使患者丧失自主呼吸和说话的能力，同时还会经历社会和心理方面的困扰2。需要接受全喉切除术的喉癌患者是喉移植的潜在理想候选者。尽管已有在不可修复喉部损伤情况下实施人类喉移植的先例，但由于担心肿瘤复发、慢性排斥反应以及供体来源感染等问题，目前临床上仍避免对这类患者进行喉异体移植3 。免疫抑制治疗是引发上述担忧的主要原因。首例部分喉移植患者在接受常规免疫抑制治疗后因肿瘤复发而死亡，这一悲剧性事件表明，在对喉癌患者进一步尝试移植之前，必须制定出合适的免疫抑制方案4,5。
为了更好地理解宿主对移植喉的免疫反应，Strome 于1992年建立了首个大鼠喉移植模型，并于2002年对该手术技术进行了改进6,7。尽管该模型在研究喉移植方面具有有效性，但由于缺乏大鼠特异性的免疫学试剂以及大鼠模型较高的成本，研究人员于2009年开发了一种新的小鼠模型用于喉移植研究8。
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方案
本研究严格遵守梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。选用10至12周龄的BalbC小鼠作为供体，10至12周龄的C57/BL6小鼠作为受体，因为它们的主要组织相容性复合物分别为H-2Db和H-2Kb，具有免疫学上的不相容性，因此可进一步研究对移植物的免疫反应。手术过程中使用的所有器械均经过灭菌处理（参见补充图S1和补充图S2），并根据IACUC的指导，在整个实验过程中保持手术区域的无菌状态。
1. 供体手术与移植物获取
- 在开始操作前30分钟，向供体注射缓释布托啡诺（3.25 mg/kg体重，皮下注射）。将小鼠置于啮齿类动物麻醉盒中，以1 L/min的氧气流速输送3%异氟烷进行麻醉诱导。2 流动。动物完全麻醉后，将小鼠转移至剃毛区域，并以1 L/min的氧气流速给予1.5%异氟烷2 以维持麻醉。通过夹捏脚趾确认麻醉深度。
- 剃除小鼠胸部和颈部至下颌线的毛发，并涂抹脱毛膏。30秒后，用浸水的无菌纱布擦拭去除脱毛膏，将小鼠转移至手术区域。
- 为小鼠的眼睛涂抹眼用润滑剂。将小鼠置于铺有隔巾的辅助加热垫上，以维持其正常体温。
- 固定小鼠，用聚维酮碘和酒精对手术区域进行三次消毒，然后为小鼠铺巾。
注意：通过夹捏脚趾检查麻醉深度，并维持....
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结果
移植成功的确证
采用上述方案，可通过移除血管夹后观察供体颈动脉的搏动来评估LTE复合体的血流情况。通常可见搏动，且供体动脉迅速呈现鲜红色，表明存在活跃的血流（图 4A）。如果吻合效果不佳，则动脉无搏动、外观部分塌陷且颜色苍白（图 4B）。
另一种确认动脉通畅性的技术是在移除夹钳后观察供体甲状腺的颜色变化；甲状腺颜色由苍白转为红色，这一变化在数分钟内即可观察到。供体甲状腺右叶也会随着动脉血流而变红。相比之下，左叶距离动脉侧较远，需要更长时间才能获得充分的血流灌注。此外，可通过观察供体LTE复合体上细小游离血管末端的血流情况，作为进一步的确认依据。
移植喉气管复合体的获取
移植15天后，获取受体及移植的喉气管复合体。可通过将喉气管复合体从周围受体组织中游离解剖，并观察端侧吻合口，以评估吻合动脉的通畅性（
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讨论
在过去三十年中，喉癌的发病率和患病率分别上升了12%和24%，其中许多患者需要接受喉切除术进行治疗10。该手术会显著降低患者的生活质量，因此迫切需要替代性治疗方案。喉部带血管复合组织异体移植可改善患者的呼吸和言语功能；然而，在该技术能够临床应用于此类患者之前，仍需开展进一步研究。本文提供了一种经济高效的喉移植小鼠模型，可用于探索多种免疫抑制治疗方案。
该手术过程中有几个关键步骤，可能决定手术的成败。对于供体而言，分离时必须远离甲状腺上动脉，以避免损伤血管蒂。获取喉部时，还需在甲状腺上动脉周围保留一圈筋膜袖，以保护血管蒂并防止血管扭曲。灌注移植物生理盐水时，应检查血管蒂的完整性。若获取操作正确，血液应从对侧颈动脉及覆盖移植物的小毛细血管中流出。
接下来的关键步骤是创建动脉切口和静脉切口。在将缝线穿过血管以 tent（牵起）血管壁时，应确保缝线穿入和穿出的是血管腔，而不仅仅是外膜。这样，单一切口的动脉切口和静脉切口才能暴露血管腔，从而允许血液流通。在制作动脉切口和静脉切口时，切口应足.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。Egehan Salepci 的科研差旅及生活费用由土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）资助。
致谢
我们感谢 Randall Raish 在视频拍摄和编辑方面提供的出色帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #1 回形针 | 订书钉 | OP-7404 | 回形针需手工弯制成形，用作牵开器 |
| 1 cc 胰岛素注射器 | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon 尼龙缝线 | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide 针头 | BD | 305125 | 1 英寸 |
| 3 mL 鲁尔锁头注射器 | BD | 309657 | |
| 30 G 无菌标准钝头针 | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl 缝线 | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon 尼龙缝线 | Ethicon | 2815G | |
| Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11027-12 | 直型，1×2 齿 |
| 外膜剪 | S&T | SAS-10 | 19 mm，10 cm，直型 |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| 人工泪液润滑性眼用软膏 | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| 邦迪织物指端创可贴 | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| 聚维酮碘溶液棉签棒 | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| 布托啡诺注射液 | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| 无锁止夹持镊 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| 棉签 | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey 镊子 | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| 解剖板 | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon 无菌一次性培养皿 | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14029-10 | 弯型尖钝头，10 cm |
| Golden A5 两速刀头电推剪 | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| 敏感肌肤脱毛剂 | Nair | 2260000033 | |
| 肝素 | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 每 10 mL 含 10,000 USP 单位 |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| 低温微细尖电凝器 | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian 可视化背景材料 | Synovis Micro Companies | VB3 | 绿色 |
| 无框架微血管近合夹 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 适用于血管直径 0.4–1 mm |
| 小鼠面罩套件 | Xenotec | XRK-S | 小型 |
| 持针器 | S&T | C-14 W | 5.5"，8 mm，0.4 mm |
| Press n' Seal 保鲜膜 | Glad | 70441 | |
| 手术刀 | Braun | BA210 | 10 号刀片 |
| 单个微型血管夹 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31（8 mm），3×1 mm 圆钝头，黑色配对 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| 无菌酒精擦拭垫 | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| 无菌一次性手术洞巾 | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| 无菌纱布垫 | Dukal | 1212 | |
| 无菌生理盐水 | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| 无菌外科手套 | Gammex | 851_A | |
| 直型镊子 | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| 组织镊 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm，8 mm，0.3 mm |
| Vannas 图案剪 | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm，8 mm，弯型 7 mm 刀刃 |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm 切割刃，弯型 |
| 血管扩张器头端 | Fine Science Tools | 00126-11 | 直径 0.1 mm/弯头 10/11 cm |
| 经典系列血管扩张器 | S&T | D-5a.3 W | 9 mm，0.3 mm，弯头 10 |
参考文献
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of t....
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