基于石墨烯的三维生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征及其在外周神经工程中的应用

摘要

在本论文中，我们展示了含有石墨烯的生物杂化水凝胶生物墨水的制备方法，用于外周组织工程。利用这种3D生物杂化材料，实施干细胞的神经分化方案。这可能是将类似生物材料推向临床应用的重要一步。

摘要

周围神经病变可能由轴突损伤引起，偶尔也由脱髓鞘疾病导致。周围神经损伤是一个全球性问题，在急诊患者中的发生率为1.5%至5%，可能导致严重的劳动力丧失。如今，随着三维（3D）生物打印技术的发展，基于组织工程的方法——包括支架材料、合适的细胞系以及生物信号分子——已变得更加可行。目前常通过将多种水凝胶生物材料与干细胞、外泌体或生物信号分子相结合，以克服周围神经再生中存在的现有难题。因此，通过各种生物打印方法制备的可注射系统（如水凝胶）或可植入导管结构，在周围神经工程领域日益受到重视。正常情况下，干细胞是机体的再生细胞，其数量和功能不会随时间推移而显著下降，以维持其种群稳定；这类细胞本身未分化，但在损伤发生时，可在适当刺激下分化为特定细胞类型。干细胞系统受其微环境——即干细胞生态位（stem cell niche）——的调控。在周围神经损伤中，尤其是神经断伤（neurotmesis）情况下，即使通过手术将断裂的神经末端重新连接，该微环境仍难以完全恢复。复合生物材料与联合细胞治疗策略可提升材料在生物可降解性、生物相容性和可加工性等方面的性能与适用性。因此，本研究旨在展示基于石墨烯的生物杂化水凝胶图案化的制备与应用，并评估干细胞向神经细胞分化的效率，以期为神经再生提供一种有效解决方案。

引言

神经系统是连接生物体内部结构与外界环境的机制，分为中枢神经系统和周围神经系统两部分。周围神经损伤是一个全球性问题，占急诊科就诊患者的1.5%–5%，常由多种创伤引起，可导致严重的劳动力丧失^1,2,3。

目前，细胞方法在周围神经工程领域备受关注。在这些方法中，干细胞居于首位。在正常情况下，干细胞是机体的再生细胞，其数量和功能不会随着时间推移而减少，以维持其种群的稳定性；这些细胞具有特化性，但在受到适当刺激时可响应损伤而发生分化^4,5。根据干细胞假说，干细胞系统受其微环境（称为干细胞生态位）的影响。若缺乏其微环境，干细胞的维持和分化将无法实现⁶，而通过组织工程结合细胞与支架材料可重建该微环境⁷。组织工程是一门多学科交叉领域，融合了工程学与生物学原理。组织工程为人工组织的构建提供了工具，可用于替代活体组织，并通过移除受损组织、提供功能性组织来实现组织再生⁸。组织支架是组织工程的三大支柱之一，可通过天然和合成材料以不同方法制备

方案

1. 华通氏胶间充质干细胞的培养

1. 从 −80 °C 冰箱中取出华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs，来自 ATCC）。按照 Yurie 等人²⁰所述方法，在室温下的无菌层流环境中，将 WJ-MSCs 培养于含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen-Strep）和 1% L-谷氨酰胺的 DMEM-F12 培养基中。
2. 用含有 35% FBS、55% DMEM-F12 和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的冻存液，以 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度对部分细胞进行冷冻保存。操作时，在 Thoma 细胞计数板上计数 1 × 10⁶ 个细胞，并逐滴加入冻存液。迅速将细胞转移至液氮容器中。
3. 当培养瓶中的细胞融合度达到 80% 时，倒出培养基，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。加入 5 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 2.21 mM EDTA-4Na 的溶液，在 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
4. 向从培养箱中取出的细胞中加入 10 mL 含 10% FBS 的 DMEM-F12 培养基。充分重悬细胞，收集培养基，并将细胞悬液转移至离心管中。
5. 在室温下以 101 ×g 的转速离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重新接种至新的培养瓶中，使用含 10% FBS 的新鲜营....

结果

石墨烯毒性与二维成像
采用统计分析软件对获得的 MTT 结果进行单因素方差分析（ANOVA），并结合 Tukey 检验进行统计学分析，所得图表如图2所示。与对照组相比，仅在 0.001% 石墨烯浓度下观察到细胞活力显著下降（**p < 0.01）。其余各组与对照组之间均无显著性差异（p > 0.05）。因此，根据 MTT 检测结果及拼接图像分析，确定最佳石墨烯浓度为 0.1%，因为该浓度处理后的细胞存活率最高。

图2

讨论

与传统二维方法相比，采用工程化三维支架进行治疗的优势正日益凸显。在周围神经再生中，单独使用干细胞或将其与生物相容性和可降解性较低的各种生物材料制成的支架联合使用，通常效果有限。华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）似乎是一种合适的候选细胞系，尤其考虑到其获取方案的优化潜力、增殖能力以及分化潜能²⁹。在本研究中，我们考察了干细胞在二维和三维培养条件下与石墨烯的相互作用，并比较了所构建的生物杂化水凝胶组与二维环境中的成神经分化情况。我们通过免疫荧光染色证实了生物墨水中神经球的形成。在后续研究中，我们利用扫描电镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FT/IR）方法对候选原型进行了表征，该原型可作为神经导管进行注射或植入。本研究表征了所制备生物材料的特性、细胞与生物材料之间的相互作用，以及干细胞在该生物材料存在下的神经分化行为。在后续阶段，将进一步考察其对细胞迁移的影响。

通过结合两种或多种生物相容性材料形成的生物杂化材料，其结构性能相较于均质材料展现出越来越多的优势³⁰。在之前的一项研究中，将基于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心	日立		用于细胞培养和生物材料步骤
0.1N CaCl₂	HD 生物墨水		用作交联剂
0.22 µm 膜滤器	Aιsιmo		用于灭菌
0.45 µm 注射器滤器	Aιsιmo		用于灭菌
1.5 mL 圆底离心管	Eppendorfa		用于生物墨水液滴
15 mL Falcon管	Nest		用于细胞培养步骤
25 cm² 细胞培养瓶（Falcon，TPP 组织培养瓶）	Nest		用于细胞培养
3D生物打印	Axolotl Biosystems Bio A2（土耳其）		生物打印步骤
50 mL Falcon管	Nest		用于细胞培养步骤
6/24/48/96 孔板（Falcon，TPP 微孔板）	默克密理博		用于细胞培养步骤
75 cm² 细胞培养瓶（Falcon，TPP 细胞培养瓶）	Nest		用于细胞培养
抗小鼠IgG-FITC-兔	Santa Cruz Biotechnology	J1514	二抗，用于染色
抗小鼠IgG-SC2781-山羊	Santa Cruz Biotechnology	C3109	二抗，用于染色
Au 涂层设备 EM ACE600	Leica		用于 SEM 成像前生物材料部分的镀金处理
高压灭菌	NUVE-OT 90L		用于灭菌过程。
高压灭菌	NUVE-OT 90L		用于灭菌过程。
细胞培养箱	Hera Safe KS		用于细胞培养过程
杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12	Sigma	RNBJ7249	用作细胞培养基
FEI QUANTA 450 FEG ESEM 扫描电镜	Quanta	FEG 450	用于 SEM
胎牛血清-FBS	山羊座	FBS-16A	通过添加至细胞培养基中使用。
-80 冰箱°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	我们曾用于储存细胞及所产生的外泌体
明胶-海藻酸钠生物墨水粉末	HD 生物墨水		用于制备生物墨水的步骤
GFP标记的WJ-MSCs	Virostem		用于成像细胞-生物墨水相互作用
石墨烯纳米片（Graphene-IGP2）	Grafen Chemical Industries Co.		用于制备3D-G生物墨水
免疫荧光抗体（N-CAD； β-III 微管蛋白)	细胞信号传导与圣克鲁斯		用于染色
JASCO 6600	四面体		用于FTIR
MTT 检测	Sigma		活力检测
青霉素/链霉素溶液	山羊座	PB-S	添加至培养基中以防止细胞培养污染。
托马载玻片	Isolab		用于细胞计数
延时成像系统	Zeiss Axio.Observer.Z1		成像
胰蛋白酶-EDTA	多细胞		使用烧瓶去除覆盖在表面的细胞。
Vorteks	生物基地		对于所制备的生物墨水步骤
WJ-MSCs	ATCC		用于细胞培养过程