需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

微图案牵引力显微镜的图案生成

2.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63628

⸱

2022年2月17日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

本文内容

摘要

我们介绍了一种对标准细胞牵引力测量方法的改进，该方法基于微接触印刷技术，通过在软性水凝胶上对细胞外基质蛋白点阵进行单步减法图案化，实现更简单且更一致的微岛图案制备，这对于控制细胞簇形态至关重要。

摘要

微图案牵引力显微技术可实现对单个细胞及细胞簇形态的控制。此外，由于该技术能够在微米尺度上进行图案化，因此可利用这些微图案化的接触区域来测量牵引力，每个微图案点可形成一个单独的黏着斑，进而使下方柔软的水凝胶发生形变。该方法已广泛应用于多种细胞类型，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板以及上皮细胞。

本文综述了将细胞外基质蛋白以预设大小和间距的规则点阵形式打印到聚丙烯酰胺水凝胶上的技术发展历程。由于微米级图案难以直接打印在柔软的基底上，因此首先在刚性玻璃盖玻片上生成图案，随后在凝胶形成过程中将该图案转移至水凝胶上。本文首先描述了在盖玻片上通过微接触印刷技术生成小点阵列的原始方法。为了在图案化点阵上控制细胞及细胞簇的形态，还需进行第二步操作，即去除大部分图案，仅保留小点组成的孤立区域。

接下来，介绍一种该方法的改进方案，该方案可通过单次减法图案化步骤实现点状岛结构的制备。这种方法大大简化了用户的操作流程，但其缺点是用于制造图案的主模板寿命有所缩短。最后，本文描述了用于分析位移点图像及细胞产生的牵引力场的计算方法，并提供了这些分析软件包的更新版本。

引言

大多数细胞表型会对周围环境施加牵引力。这些牵引力由细胞的收缩性细胞骨架产生，细胞骨架是由肌动蛋白和肌球蛋白以及其他丝状生物聚合物和交联蛋白构成的网络1,2,3,4。细胞内产生的力主要通过跨膜蛋白传递到细胞外环境或相邻细胞，例如分别通过整合素和钙黏蛋白5,6。细胞的铺展或收缩行为以及与这些运动相关的牵引力大小，是细胞与其环境之间密切相互作用的结果，这种相互作用在很大程度上取决于细胞外基质（ECM）中蛋白质的类型和数量7,8以及ECM的刚度。事实上，牵引力显微镜技术已成为理解细胞对局部刺激（如基底刚度、施加的机械应力和应变，或与其他细胞的接触）响应能力的重要工具。这些信息对于理解癌症和哮喘等疾病具有直接相关性9,10,11,12。

为了计算牵引力，需要使用一种能够测量已知材料特性基底在受力时发生形变的系统。这些形变必须随时间进行追踪，因此需要结合成像技术与图像处理方法。最早用于测定细胞牵引力的方法之一是观察并分析接种了细胞的胶原蛋白水凝胶的收缩情况，但该方法仅为半定量13。另一种更为精细的方法是通过测定单个细胞作用下薄层硅胶发生形变所产生的力，从而测量其牵引力14。随后，更定量化的测量技术被开发出来，这些方法还允许使用聚丙烯酰胺（PAA）等柔软水凝胶12,15,16。在使用这类软材料时，可通过测量嵌入水凝胶中随机分布的微珠在受力作用下的位移以及凝胶的力学特性，来确定牵引力16,17。另一项技术进步是开发出由柔软聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微柱阵列，通过测量微柱的弯曲程度，并利用梁理论将其转换为作用力18。

最后，研究人员开发了用于软性水凝胶微图形化的技术，这些方法能够控制细胞黏附的接触区域。通过测量细胞接触区域内微图形的形变，可以方便地计算牵引力，因为该方法无需力场自由的参考图像19。该技术已被广泛采用，因为它能够将规则排列的、微米尺度的、离散的荧光蛋白黏附点间接图形化至PAA凝胶上，用于细胞牵引力的测量20。为了计算这些力，已开发出一种图像处理算法，该算法可自动追踪每个微图形化点的位移，无需人工干预21。

尽管该方法在创建完整的点阵图案时较为简便，但在需要制备孤立点状区域（或称“岛状”）图案时则更为复杂。当需要控制细胞簇的形状以及在一定程度上控制其大小时，微米级图案化的岛状结构具有重要用途。为了制备这些岛状结构，前述的微接触印刷技术需要两个独立的步骤：i）使用一个PDMS印章在盖玻片上创建高保真度的点阵图案，然后ii）使用另一个不同的PDMS印章去除大部分点，仅留下孤立的点状岛21。原始方法在制备岛状结构时的难点在于，第一步中要稳定地制备一致的网格图案本身就具有挑战性。微打印印章由一系列圆形微柱阵列构成，其直径对应于所需点的大小。这些印章随后被涂覆一层均匀的蛋白质，并在精确控制的压力下压印到经过处理的盖玻片上，以形成所需的图案。一方面，对印章施加过大的压力可能导致蛋白质转移不均，由于柱体屈曲或柱间下垂而与玻璃表面发生非预期接触，从而降低图案保真度；另一方面，施加压力过小则会导致蛋白质转移量极少甚至无转移，同样造成图案保真度差。基于上述原因，人们期望开发一种仅需单步操作即可稳定、高质量地制备孤立点状岛微米图案的转移工艺。

本文介绍了一种在聚丙烯酰胺（PAA）凝胶上间接微图形化微米级荧光蛋白黏附点岛状结构的方法，该方法比先前开发的方法更具一致性和通用性。以往的间接微图形化技术依赖于将蛋白质图案从聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章转移到中间基底上，而本文所提出的方法则相反，利用PDMS印章作为去除蛋白质的工具，而非用于添加蛋白质。该方法首先从根本上改变了所用PDMS印章的结构：不同于制备由均匀分布的圆形柱状结构组成的印章，本方法中的印章由均匀分布的圆形孔洞图案构成。

采用这种新结构后，可如先前所述20,29,30，用戊二醛处理这些PDMS印章的表面，使其能够与蛋白质发生共价键合。当将经戊二醛处理的PDMS印章用于均匀涂覆了荧光蛋白的玻璃盖玻片时，可去除盖玻片表面大部分的蛋白质，仅留下由印章上微米级小孔位置预先确定的所需点阵图案。这一改进提高了仅通过一步操作即可成功生成由近乎连续的点阵网格构成图案，以及形成孤立点岛结构的效率。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 硅胶模具的制备

注意：硅胶母版的设计、制备及用于重复模塑PDMS印章的故障排除过程的大部分内容此前已有报道21，因此本文仅描述该新方法中的关键差异。

  1. 使用 AutoCAD 或类似的设计软件创建光掩模的设计。将光掩模（一块薄玻璃）的一面涂覆一层薄铬层，以控制紫外光的散射。设计光掩模时应确保将紫外光照射通过该掩模投射到所选光刻胶上后，能够形成与最终 PDMS 印模所需特征相反的硅模板。光掩模的设计参见图1。
    注意：光掩模上应使所需特征区域还是其周围区域透明，取决于所选用的光刻胶类型。此处使用的光刻胶为 SU-8 2005（注意：易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；应远离热源/火焰/火花，操作时需佩戴防护手套和护目镜），这是一种负性光刻胶，可形成高度为 5 µm、侧壁接近垂直的微结构。
    1. 通过紫外光照射使负性光刻胶固化，并用化学溶剂去除未固化的 SU-8。因此，应将掩模的主要特征区域设计为透明，而周围区域为不透明。
    2. 针对这种新型去除方法，设计光掩模包含两个 1.5 × 1.5 cm 的正方形区域（图1A），其中一个为均匀排列的 2 µm 直径圆点阵列，点间距中心到中心为 6 µm；另一个则由多个较小且独立的相同网格图案组成的方形“岛”结构（图1B）。设计以下尺寸的“岛”：6 × 6 点、12 × 12 点、25 × 25 点和 42 × 42 点。
      注意：黏附点的直径（2 µm）是基于先前测量细胞牵引力的研究结果选定的22,23。此处使用的光掩模尺寸为 101.6 × 101.6 mm，单面涂有 0.06 µm 厚的铬层，该厚度推荐用于具有微小特征的模板。本实验所用光掩模由外部专业光掩模制作公司定制。
  2. 在洁净室内，将选定的硅片均匀涂覆光刻胶。可选步骤：在涂胶前，使用等离子体灰化仪对硅片进行表面处理。
    注意：本实验使用直径为 100 mm 的硅片。经等离子体灰化处理后，硅片表面更有利于与 SU-8 结合，有助于防止 SU-8 从硅片表面剥离。
  3. 按照光刻胶制造商提供的说明执行以下步骤：
    1. 旋转涂覆后的硅片，以获得所需特征厚度，根据所需厚度和光刻胶类型调整旋转时间。对于 5 µm 厚的 SU-8 2005，将推荐的旋涂程序分为以下三个步骤：
      1. 以 100 RPM/s 的加速度在 500 RPM 转速下旋转 10 秒，完成光刻胶的初始涂覆。
      2. 以 300 RPM/s 的加速度在 3,000 RPM 转速下旋转 30 秒，将光刻胶厚度减至约 5 µm。
      3. 旋涂结束后，以 500 RPM/s 的减速度在 1 秒内将转速缓慢降至 0 RPM。
    2. 将涂覆后的硅片在 95 °C 热板上短暂烘烤，以准备进行紫外光曝光。根据光刻胶所需厚度调整烘烤时间；对于 5 µm 厚的 SU-8 2005，烘烤时间为 2 分钟。
    3. 用紫外光照射光刻胶，使目标特征完全固化。注意避免过度曝光，否则会导致 SU-8 变脆，影响最终模板的整体质量。
      1. 对于 5 µm 厚的 SU-8 2005，使用 105 mJ/cm2 的曝光能量。根据可用紫外灯的功率，通过将曝光能量除以灯的功率（单位为 mW）来计算曝光时间。
        注意：由于本实验所用紫外灯功率为 8 mW，曝光时间应为 13.1 秒。
    4. 显影后，再次在 95 °C 热板上烘烤 3 分钟，以固定 SU-8 微结构。若曝光适当，在此烘烤过程中约 1 分钟内即可观察到模板的目标特征显现。
    5. 使用 SU-8 显影液去除硅片上未固化的 SU-8。去除时应彻底，因为未固化的 SU-8 可能残留在硅片上微米级间距的结构之间。
      注意：SU-8 显影液易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；应远离热源/火焰/火花，操作时需佩戴防护手套和护目镜。
    6. 显影完成后，用丙酮冲洗以去除硅片上残留的显影液，并用氮气喷枪彻底吹干。
      注意：丙酮易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；应远离火焰/火花，操作时需佩戴防护手套和护目镜。
    7. 可选步骤：对于 SU-8 2005，可在 200 °C 热板上烘烤 10 分钟。
      注意：此高温烘烤可增强光刻胶的机械强度。
  4. 待硅片冷却后，将其放入硅片载具托盘中，随后进行 PDMS 浇铸。首先，对硅片进行硅烷化处理，以降低硅模板上 SU-8 微结构与 PDMS 之间的结合力，从而减少微结构在脱模过程中从硅片表面被剥离的风险。
    1. 完成硅烷化表面处理时，将模板和一小块玻璃盖玻片放入专用于硅烷试剂的干燥器中。在盖玻片上滴加 1–2 滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷，关闭干燥器，并在 4,500 Pa 压力下抽真空 30 分钟24。
      注意：三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；应远离热源/火焰/火花，操作时需佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱中进行。
    2. 关闭真空泵，将模板和盖玻片继续留在干燥器中静置 30 分钟。
      注意：此时模板已准备好用于 PDMS 浇铸。

2. 消减式微接触印刷

  1. 根据制造商说明，按正确的固化剂与基础剂比例混合PDMS。在室温和常压下静置15分钟，然后在真空条件下脱气15分钟。
  2. 将PDMS倒入模具中，并置于设定为37 °C的培养箱中过夜固化。
  3. 从培养箱中取出模具，使其冷却至室温。
  4. 在模具冷却期间，将25 mm盖玻片在乙醇中超声处理10分钟。使用的盖玻片数量应与准备制作的印模数量相同。
  5. 用去离子水（DI水）彻底冲洗25 mm盖玻片，并使用过滤空气枪吹干。
  6. 在真空条件下使用等离子清洗仪以高功率（射频功率30 W）对盖玻片进行1分钟的等离子处理。处理后务必缓慢释放真空，以防止盖玻片在腔室内移动。
    注意：对玻璃表面进行等离子处理具有两个作用：一是清洁玻璃表面以去除污染物，二是在玻璃表面生成基于氧的极性基团，使其更具亲水性25。这种亲水性使玻璃表面更有利于蛋白质结合。
  7. 在无直射阳光或强顶光的环境中，将浓度不低于100 µg/mL的荧光标记蛋白溶液各100 µL涂布于每片盖玻片上，加盖以进一步避光，静置20分钟。
    注意：此处使用的是从人血浆中分离并用AlexaFluor 488标记的纤连蛋白。
    1. 为标记纤连蛋白，将已知浓度和体积的未标记纤连蛋白与适量荧光染料加入1.5 mL离心管中。用铝箔包裹管子以避光，在室温下孵育1小时，每隔10分钟轻轻混匀一次，通过将管子倒置5–10次实现混匀。
      注意：所需染料的量取决于所用染料种类及蛋白质量。参见补充文件1中的计算器，用于确定Alexa 488标记纤连蛋白所需的合适染料用量。根据制造商说明，过量染料可通过脱盐柱过滤去除（见材料表）。
  8. 用去离子水彻底冲洗每片盖玻片，并通过轻轻将盖玻片边缘轻触纸巾或其他吸水材料的方式去除表面多余水分。将盖玻片敞口置于暗处至少30分钟，使其完全干燥。
  9. 在蛋白包被的盖玻片干燥过程中，使用手术刀或其他锋利刀片从模具上小心切下PDMS印模。
    注意：首次切割时最好不要一次性完全切透PDMS，因为施加过大的压力可能导致硅晶片开裂，从而损坏模具。
  10. 在真空条件下以高功率（射频功率30 W）对PDMS印模进行2分钟的等离子处理。
  11. 在通风橱内，将印模放入带盖容器中，并在每个印模表面涂布一层极薄的（<100 µL）10%（3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（3-APTMS）乙醇溶液（用100%乙醇稀释）。
    警告：3-APTMS为易燃物，对皮肤和眼睛具有刺激性；应远离火焰或火花，操作时佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱中进行。3-APTMS溶液过量涂布会导致后续工艺中形成橙色薄膜。该3-APTMS表面处理可将氨基官能团引入PDMS印模表面，为后续进一步衍生化印模表面提供可能26。
  12. 盖上装有印模的容器，使其在室温下静置5分钟。
  13. 使用去离子水彻底冲洗每个印模的两面。
  14. 将印模放入洁净容器中，并用2.5%戊二醛的去离子水溶液充分覆盖。
    警告：戊二醛具有毒性，操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱中进行。该戊二醛处理与之前的3-APTMS处理共同在PDMS印模表面引入醛基官能团，这些醛基可与蛋白质中的氨基反应形成仲胺键，这对后续的蛋白质转移过程至关重要27。
  15. 盖上容器，让印模在室温下静置30分钟，然后再次用去离子水彻底冲洗。以与处理盖玻片相同的方式去除印模表面多余水分，并将印模敞口干燥约30分钟。
  16. 30分钟后，检查蛋白包被的盖玻片和印模是否均已干燥。若任一未完全干燥，使用过滤空气枪彻底吹干，同时确保盖玻片不长时间暴露于光照下。
  17. 当盖玻片和印模均干燥后，将印模图案面朝下压在盖玻片上，施加足够压力以确保印模与盖玻片表面完全接触。保持接触15分钟。
    注意：由于戊二醛处理的印模与玻璃盖玻片上的蛋白层之间形成了共价酰胺键，其强度远高于蛋白层与玻璃盖玻片之间的弱疏水相互作用，因此当印模被揭下时，蛋白应按照PDMS印模的图案从玻璃表面剥离。
  18. 15分钟后，小心地将PDMS印模从盖玻片上揭下。
    注意：若转移过程成功，印模揭下时应有一定阻力，但不应过于牢固以致需施加过大外力才能剥离。
  19. 使用荧光显微镜上合适的滤光片（根据蛋白质所标记的荧光染料类型选择）检查图案化盖玻片的图案保真度。
  20. 立即使用图案化盖玻片，或避光保存以备后续使用。

3. 活化盖玻片

注意：此步骤用于制备PAA凝胶实验腔室所用的底部盖玻片。该底部盖玻片经过特殊处理，可在图案化过程中当顶部图案化盖玻片被移除时，仍确保PAA凝胶牢固地附着于其上。类似的技术在其他文献中也有描述10,12,15,28。

  1. 将30 mm盖玻片在100%乙醇中进行超声处理10分钟，用去离子水冲洗，然后用过滤空气枪彻底干燥。每次可在6孔板中分批处理最多6个盖玻片。
  2. 将盖玻片在高功率下进行等离子体处理1分钟（射频功率为30 W），然后将每个盖玻片放入6孔板的各个孔中。
  3. 在通风橱中，用乙醇中5% APTMS的极薄层对每个盖玻片进行包被。
    注意：若此步骤中包被过量，会形成橙色残留物。
  4. 盖上6孔板，让盖玻片静置5分钟。
  5. 彻底用去离子水冲洗盖玻片（两面）以及每个孔的内壁，并去除孔内的多余水分。
  6. 将盖玻片重新放回6孔板中，每孔加入约2 mL含0.5%戊二醛的去离子水溶液。
  7. 盖上6孔板，让盖玻片在戊二醛溶液中静置30分钟；然后，用去离子水彻底冲洗盖玻片及各孔。
  8. 将处理后的盖玻片保存在6孔板内的去离子水中，最多可保存两周，或立即使用。使用前需确保盖玻片完全干燥。

4. PAA 凝胶的制备与图案转移

注意：一旦制备好图案化盖玻片，必须尽快将其上的蛋白图案转移至PAA水凝胶上（<24小时）1,29,30。以下配方用于制备杨氏模量为3.6 kPa的PAA凝胶。可通过调整双丙烯酰胺、丙烯酰胺和去离子水的用量来调节PAA凝胶的刚度12。

  1. 在开始制备PAA水凝胶前体之前，先将丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯从冰箱中取出，使其在打开前升至室温。使用70%乙醇对可更换盖玻片培养皿套装进行灭菌，并在生物安全柜中用紫外光照射至少30分钟，以备使用。
    警告：NHS为有毒的皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    1. 将1.25 mL的40%丙烯酰胺水溶液加入一个15 mL锥形管中。
      警告：丙烯酰胺为有毒的皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    2. 向同一管中（步骤4.1.1）加入175 µL双丙烯酰胺水溶液。
      警告：双丙烯酰胺为有毒的皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    3. 加入500 µL的10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。
      警告：PBS为眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜。
    4. 加入2.915 mL去离子水。
  2. 用移液器将969 µL该前体转移至一个1.5 mL微量离心管中，其余部分储存于4 °C，最多可保存两周。
  3. 在另一微量离心管中称取约50–100 mg过硫酸铵（APS），并用去离子水稀释至100 mg/mL，放置备用。在通风橱中打开已升至室温的NHS酯，小心称取最多3 mg NHS至微量离心管中，用1×PBS将其稀释至1 mg/mL。
    警告：APS为皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。APS和NHS酯均会随时间发生水解，导致储存溶液中化学物质的活性发生变化。因此，这两种溶液必须每次新鲜配制（与前体其余组分不同）。
  4. 在通风橱中执行以下三个步骤：
    1. 向含有969 µL PAA前体的微量离心管中加入2 µL四甲基乙二胺（TEMED）。
      警告：TEMED为易燃的皮肤和眼睛刺激物；应远离热源、火焰和火花，操作时佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行。TEMED是PAA水凝胶聚合过程中两种关键交联剂之一，另一种为APS。
    2. 加入15 µL 1 M盐酸，以降低水凝胶溶液的pH值，防止NHS酯水解。
      警告：盐酸为腐蚀性皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    3. 向管中加入10 µL NHS酯溶液。
      注：NHS对图案化过程至关重要。它将与图案化盖玻片上蛋白质中的氨基反应，形成稳定的酰胺键，从而使图案在PAA凝胶聚合过程中从玻璃盖玻片转移至凝胶表面31。
  5. 在生物安全柜中执行以下最终步骤：
    1. 小心将30 mm盖玻片放入盖玻片培养皿套装的金属部分中（3-APTMS和戊二醛处理面朝上），并旋紧顶部塑料环。将图案化盖玻片放置妥当，以便下一步操作时易于取用，同时尽可能避免光照。
    2. 向微量离心管中剩余的PAA前体中加入5 µL APS溶液，轻轻颠倒混匀，然后立即移取35 µL该溶液至30 mm盖玻片上。
    3. 将图案化盖玻片的蛋白面朝下轻轻覆盖在溶液上，注意避免在水凝胶中产生气泡。保护水凝胶免受光照，并使其聚合90分钟。
    4. 水凝胶聚合完成后，使用刀片或手术刀小心移除上层盖玻片，确保盖玻片在移除后不会滑落或重新掉落到凝胶表面，以免破坏凝胶表面的图案。
      注：切勿将凝胶暴露在气流较大的环境中（如生物安全柜内）。
    5. 为钝化水凝胶中残留的NHS酯，向凝胶中加入2 mL无菌PBS，在37 °C孵育45分钟。随后立即用于实验，或在4 °C的无菌PBS中过夜保存，待用。

5. 成像

  1. 在进行细胞实验前，于计划实验的前一下午开启显微镜的加热（37 °C）和湿度控制（70%），使显微镜腔室内的设备有足够时间达到设定温度并保持稳定。
    注意：此步骤可最大限度减少因温度波动引起的焦平面漂移（z-drift）。
  2. 在实验开始前立即开启腔室的 CO2 气源。
  3. 为防止实验过程中因显微镜载物台反复移动导致的x-y方向漂移，使用双面胶带将承载细胞接种水凝胶的可更换盖玻片培养皿固定在载物台上。
  4. 观察凝胶，选择需要成像的感兴趣区域，并保存每个待成像区域的载物台位置。
  5. 在明场成像视图和对应标记蛋白的荧光成像视图下，设置显微镜软件每5分钟对每个视野成像一次，持续2小时。

6. 图像分析

注意：已开发出一种系统，可通过确定牵引点的位置、插值变形点的初始位置，然后计算每个位置的细胞牵引力，来测量图案化 PAA 凝胶的形变。任何能够执行图像处理和数值计算的软件系统均可使用。该程序旨在快速确定牵引力，消除用户输入和预处理步骤，从而减少人为误差。此处使用的代码作为补充文件 2-10提供，这些文件以及一对练习图像可在 www.bu.edu/mml/downloads 获取。

  1. 在图像处理软件中，按顺序打开延时实验期间从所用的每种显微镜视野中拍摄的所有单张图像，从第一张到最后一张，并将其合并为一个单一的图像堆栈（点击 图像 | 图像序列 | 待合并的图像）。确保获得两个独立的图像堆栈：一个是细胞的明场图像，另一个是细胞所附着图案的荧光图像。
    1. 如果荧光图像中存在漂移（即感兴趣区域在每帧之间的 x 和/或 y 方向上发生移动），则 >1-2 µm），首先使用 StackReg 插件（P. Thévenaz，洛桑瑞士联邦理工学院）对图像序列进行处理，以第一幅图像的位置为基准重新校正序列中每幅图像的位置（点击 插件 | StackReg | 平移 | 确定).
      注意：这一点至关重要，因为即使是亚阈值的µm 漂移会显著影响牵引力计算的最终结果，尤其是在较硬的凝胶上，这种x-y方向的漂移超出了预期噪声的范围。该代码将在去除漂移后保存图像，随后可将这些图像组成新的图像堆栈用于进一步分析。
  2. 将明场和荧光图像序列输入至 CTFTimelapse.m 中补充文件 2).
    1. 在第7行指定图像堆栈所在的文件目录。
    2. 在第8行和第9行，分别指定荧光图像堆栈和相应的明场荧光堆栈的名称。
    3. 指定PAA凝胶硬度（Pa）：
      1. 在第11-14行中，包含最常使用的几种PAA水凝胶的弹性模量，将其注释掉（类型 % 在分析图像时，注释掉除凝胶弹性模量外的所有参数。或者，若尚未包含弹性模量，则添加该参数并注释掉其余参数（测试图像为 3658.19 Pa）。
    4. 在第15行指定点的半径（m）（1 × 10-6 m 用于测试图像。
    5. 指定最大可能的点直径（µm) 在第 16 行（2.5 µm 用于测试图像）。
    6. 指定像素比（µm/pixel):
      1. 在第17-20行中，包含基于先前使用过的成像设置的几种不同图像像素比例，将这些行注释掉（类型 % 在分析图像时，保留像素比例，其余参数均不保留（在行首用注释符号标记）。或者，若尚未包含所用像素比例，则添加该参数，并将其余部分用注释符号标记。0.1613 µm/pixe用于测试图像的 l。
    7. 在第 35 行和第 87 行，指定必要图像处理文件所在的文件目录。
      注意：根据荧光图像序列，该程序确定每个荧光点的位置，并追踪每个点在序列中各图像间的移动。20微接触印刷点的初始位置是已知的，因为它们在被正确转移至水凝胶时不会发生形变32.
  3. 等待程序识别出点后，会出现两个图和一个对话框。使用 图1 以确保程序已正确识别出所有点，并且未在无点区域误识别出大量点。使用 图2 选择矩形网格，以帮助程序定位并计算细胞牵引力。
    注意： 图1 是程序识别出的细胞亮点（将以红色显示）叠加于其上的明场图像（参见 图 3A). 图2 显示与之前相同点状结构的图像 图1 但不包含背景中的明场图像。
    1. 等待对话框提示 选择点后按 Enter 键- 其中每个点是程序找到的红色圆点之一，且每个点内包含一个标有“Enter”的大按钮。
    2. 选择四个不同的点 图2 在该模式下围绕并包含该细胞/簇创建一个矩形网格。逐一选择每个点 左键单击 小鼠的确认通过按压来完成 输入 单击上述对话框中的按钮。在选择完四个角点后，程序会要求输入这些数值，因此请统计第一个点与第二个点之间以及第一个点与第三个点之间的点数。将这些数值输入命令窗口（类型 点的数量并单击 进入 当系统提示时，按下键盘上的按钮。
  4. 选择矩形网格后，等待脚本根据荧光点的位置计算该网格内的牵引力。注意，脚本首先计算位移矢量（u每个点的几何中心坐标，并计算相应的牵引力矢量（F）使用公式（1):
    静力平衡力公式 F=πEau/(2+ν−ν²) 阐明了流体动力学原理。    (1)
    何处 E 是PAA基底的杨氏模量， a 是荧光点标记的半径，且 ν 是PAA基底的泊松比32. Eq (1) 假设基底为无限弹性半空间，牵引力施加于每个圆形点状标记的中心，且点状标记之间的间距足够大，使得各自的位移互不干扰23.
    注意：在本实验中，点状标记物的半径为 a = 1 µm 和 6 µm 中心到中心间距被使用。细胞/细胞簇内部应存在指向细胞中心的向内牵引力箭头，而细胞/细胞簇外部区域不应出现牵引力箭头（参见 图3C-细胞/细胞簇内部向外指的牵引力箭头，或细胞外部存在大量牵引力箭头，表明所选矩形网格不恰当。
  5. 一旦确定了正确的牵引力场，使用光标选择围绕细胞/细胞簇的适当感兴趣区域（ROI），该区域需包含细胞内的所有牵引力箭头。
    1. 绘制感兴趣区域（ROI）， 左键单击 根据需要重复多次，以绘制出具有任意所需边数的多边形形状；绘制完成后，可通过以下方式调整形状或移动感兴趣区域（ROI）： 左键单击 分别位于角落或边缘。ROI 绘制完成后， 双击左键 移动到堆栈中的下一张图像。对明场图像堆栈中的所有图像重复此操作。
      注意：该代码会将每个时间点的牵引力和位移数据保存在与原始图像堆栈相同的文件夹中，以便进一步分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用减法微图案化方法制备了具有 3.6 kPa 杨氏模量（E）和 0.445 泊松比（ν）的 PAA 水凝胶。水凝胶的厚度约为 100 µm，该厚度既允许使用本文所用成像装置进行观察，又能防止细胞感知凝胶下方刚性盖玻片的存在，从而避免对细胞刚性感知研究造成干扰23,33。已有多种不同刚度（最高达 30 kPa）的凝胶成功通过间接微图案化方法制备并成像34，因此该方法并不局限于仅使用 3.6 kPa 的水凝胶。盖玻片在使用前经戊二醛预处理，以确保在移除上层图案化盖玻片时，凝胶仍能牢固固定在下层盖玻片上（图 2C、D）。

为了可视化并测量细胞簇内的细胞牵引力，将3.6 kPa的水凝胶通过间接方式用荧光标记的纤连蛋白进行图案化（图2A

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文描述了一种改进的间接图案化聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶的方法。该方法在先前已使用的技术基础上进行了优化20,35,36,37,38,39,40,41,42。主要改进之处在于，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章去除蛋白质，从而在中间基底上留下所需的图案，而不是将图案直接印制到基底上。这种方法能够更一致地生成高保真度的微图案，并可一步形成孤立的微图案化岛状结构，而此前这类结构的制备需要两个独立步骤。与之前的两步法相比，本方法所制备的岛状图案在...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢波士顿大学机械工程系的 Paul Barbone 博士在数据处理和分析方面的有益讨论与帮助。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）CMMI-1910401 项目资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷Sigma Aldrich#281778
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific#05-408-129
15 mL 锥形管Fisher Scientific#05-539-12
4 英寸 × 4 英寸 0.060 英寸低电阻铬光刻掩模Advance Reproductions CorporationN/A定制设计的掩模
6 孔板Fisher Scientific#07-200-83
丙酮Fisher Scientific#A18P-4
丙烯酰胺溶液，40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
过硫酸铵Fisher Scientific#BP179-25
双丙烯酰胺Fisher Scientific#PR-V3141
乙醇Greenfield Global#111000200C1GL
玻璃盖玻片，25 mm 圆形Fisher Scientific#12-545-102
玻璃盖玻片，30 mm 圆形Warner#64-1499
滨松 ORCA-R2 相机滨松#C10600-10B
人血浆Valley Biomedical#HP1051P用于分离纤连蛋白
盐酸，1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
可更换盖玻片培养皿套装Bioptechs#190310-35
Kim Wipes 擦拭纸Fisher Scientific#06-666-11C
掩模对准仪Karl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-羟基琥珀酰亚胺酯Sigma Aldrich#130672-5G
NucBlue 活细胞染色剂Thermo Fisher#R37605
奥林巴斯 IX2-ZDC 倒置显微镜奥林巴斯#IX81
PD-10 脱盐柱GE Healthcare#52-1308-00
光刻胶旋转涂布通风罩Headway Research#PWM32
等离子清洗仪Harrick#PDC-001
等离子刻蚀仪TePla#M4L
Prior Lumen 200Pro 光源Prior Scientific#L200
硅片，100 mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9463827
SU-8 显影液Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9901158
Sylgard 184 硅橡胶弹性体Essex Brownell#DC-184-1.1
四甲基乙二胺Fisher Scientific#BP150-20
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷Sigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 物镜奥林巴斯#N2709300
紫外泛光曝光系统Newport#69910
晶圆载片托盘，110 × 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40

参考文献

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172(2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572(2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173(2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923(2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503(2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065(2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

蛋白质微图案微接触印刷聚丙烯酰胺水凝胶牵引力测量PDMS印章细胞外基质图案化细胞簇形态荧光显微镜黏着斑
微图案牵引力显微镜的图案生成
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。