我们介绍了一种对标准细胞牵引力测量方法的改进，该方法基于微接触印刷技术，通过在软性水凝胶上对细胞外基质蛋白点阵进行单步减法图案化，实现更简单且更一致的微岛图案制备，这对于控制细胞簇形态至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
微图案牵引力显微技术可实现对单个细胞及细胞簇形态的控制。此外，由于该技术能够在微米尺度上进行图案化，因此可利用这些微图案化的接触区域来测量牵引力，每个微图案点可形成一个单独的黏着斑，进而使下方柔软的水凝胶发生形变。该方法已广泛应用于多种细胞类型，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板以及上皮细胞。
本文综述了将细胞外基质蛋白以预设大小和间距的规则点阵形式打印到聚丙烯酰胺水凝胶上的技术发展历程。由于微米级图案难以直接打印在柔软的基底上，因此首先在刚性玻璃盖玻片上生成图案，随后在凝胶形成过程中将该图案转移至水凝胶上。本文首先描述了在盖玻片上通过微接触印刷技术生成小点阵列的原始方法。为了在图案化点阵上控制细胞及细胞簇的形态，还需进行第二步操作，即去除大部分图案，仅保留小点组成的孤立区域。
接下来，介绍一种该方法的改进方案，该方案可通过单次减法图案化步骤实现点状岛结构的制备。这种方法大大简化了用户的操作流程，但其缺点是用于制造图案的主模板寿命有所缩短。最后，本文描述了用于分析位移点图像及细胞产生的牵引力场的计算方法，并提供了这些分析软件包的更新版本。
引言
大多数细胞表型会对周围环境施加牵引力。这些牵引力由细胞的收缩性细胞骨架产生，细胞骨架是由肌动蛋白和肌球蛋白以及其他丝状生物聚合物和交联蛋白构成的网络1,2,3,4。细胞内产生的力主要通过跨膜蛋白传递到细胞外环境或相邻细胞，例如分别通过整合素和钙黏蛋白5,6。细胞的铺展或收缩行为以及与这些运动相关的牵引力大小，是细胞与其环境之间密切相互作用的结果，这种相互作用在很大程度上取决于细胞外基质（ECM）中蛋白质的类型和数量7,8以及ECM的刚度。事实上，牵引力显微镜技术已成为理解细胞对局部刺激（如基底刚度、施加的机械应力和应变，或与其他细胞的接触）响应能力的重要工具。这些信息对于理解癌症和哮喘等疾病具有直接相关性9,10,11,
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方案
1. 硅胶模具的制备
注意：硅胶母版的设计、制备及用于重复模塑PDMS印章的故障排除过程的大部分内容此前已有报道21，因此本文仅描述该新方法中的关键差异。
- 使用 AutoCAD 或类似的设计软件创建光掩模的设计。将光掩模（一块薄玻璃）的一面涂覆一层薄铬层，以控制紫外光的散射。设计光掩模时应确保将紫外光照射通过该掩模投射到所选光刻胶上后，能够形成与最终 PDMS 印模所需特征相反的硅模板。光掩模的设计参见图1。
注意：光掩模上应使所需特征区域还是其周围区域透明，取决于所选用的光刻胶类型。此处使用的光刻胶为 SU-8 2005（注意：易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；应远离热源/火焰/火花，操作时需佩戴防护手套和护目镜），这是一种负性光刻胶，可形成高度为 5 µm、侧壁接近垂直的微结构。- 通过紫外光照射使负性光刻胶固化，并用化学溶剂去除未固化的 SU-8。因此，应将掩模的主要特征区域设计为透明，而周围区域为不透明。
- 针对这种新型去除方法，设计光掩模包含两个 1.5 × 1.5 cm 的正方形区域（图1A），其中一个为均匀排列的 2 µm 直径圆点阵列，点间距中心到中心为 6 µm；另一个则由多个较小且独立的相....
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结果
采用减法微图案化方法制备了具有 3.6 kPa 杨氏模量（E）和 0.445 泊松比（ν）的 PAA 水凝胶。水凝胶的厚度约为 100 µm，该厚度既允许使用本文所用成像装置进行观察，又能防止细胞感知凝胶下方刚性盖玻片的存在，从而避免对细胞刚性感知研究造成干扰23,33。已有多种不同刚度（最高达 30 kPa）的凝胶成功通过间接微图案化方法制备并成像34，因此该方法并不局限于仅使用 3.6 kPa 的水凝胶。盖玻片在使用前经戊二醛预处理，以确保在移除上层图案化盖玻片时，凝胶仍能牢固固定在下层盖玻片上（图 2C、D）。
为了可视化并测量细胞簇内的细胞牵引力，将3.6 kPa的水凝胶通过间接方式用荧光标记的纤连蛋白进行图案化（图2A
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讨论
本文描述了一种改进的间接图案化聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶的方法。该方法在先前已使用的技术基础上进行了优化20,35,36,37,38,39,40,41,42。主要改进之处在于，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章去除蛋白质，从而在中间基底上留下所需的图案，而不是将图案直接印制到基底上。这种方法能够更一致地生成高保真度的微图案，并可一步形成孤立的微图案化岛状结构，而此前这类结构的制备需要两个独立步骤。与之前的两步法相比，本方法所制备的岛状图案在.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢波士顿大学机械工程系的 Paul Barbone 博士在数据处理和分析方面的有益讨论与帮助。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）CMMI-1910401 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (3-氨基丙基)三甲氧基硅烷 | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL 锥形管 | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 英寸 × 4 英寸 0.060 英寸低电阻铬光刻掩模 | Advance Reproductions Corporation | N/A | 定制设计的掩模 |
| 6 孔板 | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| 丙酮 | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| 丙烯酰胺溶液，40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| 过硫酸铵 | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| 双丙烯酰胺 | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| 乙醇 | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| 玻璃盖玻片，25 mm 圆形 | Fisher Scientific | #12-545-102 | |
| 玻璃盖玻片，30 mm 圆形 | Warner | #64-1499 | |
| 滨松 ORCA-R2 相机 | 滨松 | #C10600-10B | |
| 人血浆 | Valley Biomedical | #HP1051P | 用于分离纤连蛋白 |
| 盐酸，1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| 可更换盖玻片培养皿套装 | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes 擦拭纸 | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| 掩模对准仪 | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺酯 | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue 活细胞染色剂 | Thermo Fisher | #R37605 | |
| 奥林巴斯 IX2-ZDC 倒置显微镜 | 奥林巴斯 | #IX81 | |
| PD-10 脱盐柱 | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| 光刻胶旋转涂布通风罩 | Headway Research | #PWM32 | |
| 等离子清洗仪 | Harrick | #PDC-001 | |
| 等离子刻蚀仪 | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro 光源 | Prior Scientific | #L200 | |
| 硅片，100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 显影液 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体 | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| 四甲基乙二胺 | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 物镜 | 奥林巴斯 | #N2709300 | |
| 紫外泛光曝光系统 | Newport | #69910 | |
| 晶圆载片托盘，110 × 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
参考文献
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.
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