方法文章

微图案牵引力显微镜的图案生成

DOI：

10.3791/63628

⸱

2022年2月17日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了一种对标准细胞牵引力测量方法的改进，该方法基于微接触印刷技术，通过在软性水凝胶上对细胞外基质蛋白点阵进行单步减法图案化，实现更简单且更一致的微岛图案制备，这对于控制细胞簇形态至关重要。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微图案牵引力显微技术可实现对单个细胞及细胞簇形态的控制。此外，由于该技术能够在微米尺度上进行图案化，因此可利用这些微图案化的接触区域来测量牵引力，每个微图案点可形成一个单独的黏着斑，进而使下方柔软的水凝胶发生形变。该方法已广泛应用于多种细胞类型，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板以及上皮细胞。

本文综述了将细胞外基质蛋白以预设大小和间距的规则点阵形式打印到聚丙烯酰胺水凝胶上的技术发展历程。由于微米级图案难以直接打印在柔软的基底上，因此首先在刚性玻璃盖玻片上生成图案，随后在凝胶形成过程中将该图案转移至水凝胶上。本文首先描述了在盖玻片上通过微接触印刷技术生成小点阵列的原始方法。为了在图案化点阵上控制细胞及细胞簇的形态，还需进行第二步操作，即去除大部分图案，仅保留小点组成的孤立区域。

接下来，介绍一种该方法的改进方案，该方案可通过单次减法图案化步骤实现点状岛结构的制备。这种方法大大简化了用户的操作流程，但其缺点是用于制造图案的主模板寿命有所缩短。最后，本文描述了用于分析位移点图像及细胞产生的牵引力场的计算方法，并提供了这些分析软件包的更新版本。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大多数细胞表型会对周围环境施加牵引力。这些牵引力由细胞的收缩性细胞骨架产生，细胞骨架是由肌动蛋白和肌球蛋白以及其他丝状生物聚合物和交联蛋白构成的网络1,2,3,4。细胞内产生的力主要通过跨膜蛋白传递到细胞外环境或相邻细胞，例如分别通过整合素和钙黏蛋白5,6。细胞的铺展或收缩行为以及与这些运动相关的牵引力大小，是细胞与其环境之间密切相互作用的结果，这种相互作用在很大程度上取决于细胞外基质（ECM）中蛋白质的类型和数量7,8以及ECM的刚度。事实上，牵引力显微镜技术已成为理解细胞对局部刺激（如基底刚度、施加的机械应力和应变，或与其他细胞的接触）响应能力的重要工具。这些信息对于理解癌症和哮喘等疾病具有直接相关性9,10,11,12。

为了计算牵引力，需要使用一种能够测量已知材料特性基底在受力时发生形变的系统。这些形变必须随时间进行追踪，因此需要结合成像技术与图像处理方法。最早用于测定细胞牵引力的方法之一是观察并分析接种了细胞的胶原蛋白水凝胶的收缩情况，但该方法仅为半定量13。另一种更为精细的方法是通过测定单个细胞作用下薄层硅胶发生形变所产生的力，从而测量其牵引力14。随后，更定量化的测量技术被开发出来，这些方法还允许使用聚丙烯酰胺（PAA）等柔软水凝胶12,15,16。在使用这类软材料时，可通过测量嵌入水凝胶中随机分布的微珠在受力作用下的位移以及凝胶的力学特性，来确定牵引力16,17。另一项技术进步是开发出由柔软聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微柱阵列，通过测量微柱的弯曲程度，并利用梁理论将其转换为作用力18。

最后，研究人员开发了用于软性水凝胶微图形化的技术，这些方法能够控制细胞黏附的接触区域。通过测量细胞接触区域内微图形的形变，可以方便地计算牵引力，因为该方法无需力场自由的参考图像19。该技术已被广泛采用，因为它能够将规则排列的、微米尺度的、离散的荧光蛋白黏附点间接图形化至PAA凝胶上，用于细胞牵引力的测量20。为了计算这些力，已开发出一种图像处理算法，该算法可自动追踪每个微图形化点的位移，无需人工干预21。

尽管该方法在创建完整的点阵图案时较为简便，但在需要制备孤立点状区域（或称“岛状”）图案时则更为复杂。当需要控制细胞簇的形状以及在一定程度上控制其大小时，微米级图案化的岛状结构具有重要用途。为了制备这些岛状结构，前述的微接触印刷技术需要两个独立的步骤：i）使用一个PDMS印章在盖玻片上创建高保真度的点阵图案，然后ii）使用另一个不同的PDMS印章去除大部分点，仅留下孤立的点状岛21。原始方法在制备岛状结构时的难点在于，第一步中要稳定地制备一致的网格图案本身就具有挑战性。微打印印章由一系列圆形微柱阵列构成，其直径对应于所需点的大小。这些印章随后被涂覆一层均匀的蛋白质，并在精确控制的压力下压印到经过处理的盖玻片上，以形成所需的图案。一方面，对印章施加过大的压力可能导致蛋白质转移不均，由于柱体屈曲或柱间下垂而与玻璃表面发生非预期接触，从而降低图案保真度；另一方面，施加压力过小则会导致蛋白质转移量极少甚至无转移，同样造成图案保真度差。基于上述原因，人们期望开发一种仅需单步操作即可稳定、高质量地制备孤立点状岛微米图案的转移工艺。

本文介绍了一种在聚丙烯酰胺（PAA）凝胶上间接微图形化微米级荧光蛋白黏附点岛状结构的方法，该方法比先前开发的方法更具一致性和通用性。以往的间接微图形化技术依赖于将蛋白质图案从聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章转移到中间基底上，而本文所提出的方法则相反，利用PDMS印章作为去除蛋白质的工具，而非用于添加蛋白质。该方法首先从根本上改变了所用PDMS印章的结构：不同于制备由均匀分布的圆形柱状结构组成的印章，本方法中的印章由均匀分布的圆形孔洞图案构成。

采用这种新结构后，可如先前所述20,29,30，用戊二醛处理这些PDMS印章的表面，使其能够与蛋白质发生共价键合。当将经戊二醛处理的PDMS印章用于均匀涂覆了荧光蛋白的玻璃盖玻片时，可去除盖玻片表面大部分的蛋白质，仅留下由印章上微米级小孔位置预先确定的所需点阵图案。这一改进提高了仅通过一步操作即可成功生成由近乎连续的点阵网格构成图案，以及形成孤立点岛结构的效率。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 硅胶母模的制备

注意：关于用于重复模制PDMS印章的硅胶母版的设计、制作和故障排除的大部分过程此前已有报道21，因此本文仅描述这一新方法中的关键差异。

  1. 使用 AutoCAD 或类似的设计软件创建光掩模的设计。将光掩模（一块薄玻璃）的一面涂覆一层薄铬层，以控制紫外光的散射。设计光掩模时应确保将紫外光照射通过该掩模投射到所选光刻胶上后，能够形成与最终 PDMS 印模所需特征相反的硅模板。光掩模的设计参见图1。
    注意：光掩模上应使所需特征区域还是其周围区域透明，取决于所选用的光刻胶类型。此处使用的光刻胶为 SU-8 2005（注意：易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；操作时应远离热源/火焰/火花，并佩戴防护手套和护目镜），这是一种负性光刻胶，可形成高度为 5 µm、侧壁接近垂直的微结构。
    1. 通过紫外光照射使负性光刻胶固化，并用化学溶剂去除未固化的 SU-8。因此，应将掩模的主要特征区域设计为透明，而周围区域为不透明。
    2. 针对这种新型去除方法，设计光掩模包含两个 1.5 × 1.5 cm 的正方形区域（图1A），其中一个为均匀排列的 2 µm 直径圆形阵列，圆心间距为 6 µm；另一个则由多个较小的独立方形“岛”组成，这些“岛”是相同网格图案的缩小版（图1B）。设计以下尺寸的“岛”：6 × 6 点、12 × 12 点、25 × 25 点和 42 × 42 点。
      注意：黏附点的直径（2 µm）是基于先前测量细胞牵引力的研究结果选定的22,23。此处使用的光掩模尺寸为 101.6 × 101.6 mm，单面涂有 0.06 µm 厚的铬层，该厚度推荐用于具有微小特征的模板。本实验所用光掩模由外部专业光掩模打印公司定制。
  2. 在洁净室内，将选定的硅片均匀涂覆光刻胶。可选步骤：在涂胶前，使用等离子体灰化仪对硅片进行表面处理。
    注意：本实验使用直径为 100 mm 的硅片。等离子体灰化处理可增强硅片表面与 SU-8 的结合能力，有助于防止 SU-8 从硅片上剥离。
  3. 按照光刻胶制造商的说明执行以下步骤：
    1. 旋转涂有光刻胶的硅片，以获得所需特征厚度，根据所需厚度和光刻胶类型调整旋转时间。对于厚度为 5 µm 的 SU-8 2005，将推荐的旋转程序分为以下三个步骤：
      1. 以 100 RPM/s 的加速度在 500 RPM 转速下旋转 10 秒，完成光刻胶的初始涂布。
      2. 以 300 RPM/s 的加速度在 3,000 RPM 转速下旋转 30 秒，将光刻胶厚度减至约 5 µm。
      3. 旋转结束后，以 500 RPM/s 的减速度在 1 秒内将转速缓慢降至 0 RPM。
    2. 将涂覆后的硅片在 95 °C 热板上短暂烘烤，以准备进行紫外光曝光。根据光刻胶所需厚度调整烘烤时间；对于 5 µm 厚的 SU-8 2005，烘烤时间为 2 分钟。
    3. 用紫外光照射光刻胶，使目标特征完全固化。注意避免过度曝光，否则会导致 SU-8 变脆，影响最终模板的整体质量。
      1. 对于 5 µm 厚的 SU-8 2005，使用 105 mJ/cm2 的曝光能量。根据可用紫外灯的功率，通过将曝光能量除以灯的功率（单位为 mW）来计算曝光时间。
        注意：由于本实验所用紫外灯功率为 8 mW，曝光时间应为 13.1 秒。
    4. 显影后，再次在 95 °C 热板上烘烤 3 分钟，以固定 SU-8 微结构。若曝光适当，在此烘烤过程中应在 1 分钟内观察到模板的目标特征显现。
    5. 使用 SU-8 显影液去除硅片上未固化的 SU-8。去除时应彻底，因为未固化的 SU-8 可能残留在硅片上微米级间距的结构之间。
      注意：SU-8 显影液易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；操作时应远离热源/火焰/火花，并佩戴防护手套和护目镜。
    6. 显影完成后，用丙酮冲洗硅片以去除残留显影液，并用氮气喷枪彻底吹干。
      注意：丙酮易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；操作时应远离火焰/火花，并佩戴防护手套和护目镜。
    7. 可选步骤：对于 SU-8 2005，可在 200 °C 热板上烘烤 10 分钟。
      注意：此高温烘烤可增强光刻胶的机械强度。
  4. 待硅片冷却后，将其放入硅片载具托盘中，随后进行 PDMS 浇铸。首先，对硅片进行硅烷化处理，以降低硅模板上 SU-8 微结构与 PDMS 之间的结合力，从而减少微结构在脱模过程中从硅片表面被剥离的风险。
    1. 完成硅烷化表面处理时，将模板和一小块玻璃盖玻片放入专用于硅烷试剂的干燥器中。在盖玻片上滴加 1–2 小滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷，关闭干燥器，并在 4,500 Pa 压力下抽真空 30 分钟24。
      注意：三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷易燃，对皮肤和眼睛有刺激性；操作时应远离热源/火焰/火花，佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱中进行。
    2. 关闭真空泵，将模板和盖玻片继续留在干燥器中静置 30 分钟。
      注意：此时模板已准备好用于 PDMS 浇铸。

2. 减法微接触印刷

  1. 根据制造商的说明，按正确的固化剂与基础剂比例混合PDMS。在室温和常压下静置15分钟，然后在真空条件下脱气15分钟。
  2. 将PDMS倒入模具中，并置于设定为37 °C的培养箱中过夜固化。
  3. 从培养箱中取出模具，使其冷却至室温。
  4. 在模具冷却期间，将25 mm盖玻片在乙醇中超声处理10分钟。使用的盖玻片数量应与准备制作的印模数量相同。
  5. 用去离子水（DI水）彻底冲洗25 mm盖玻片，并使用过滤空气枪吹干。
  6. 在真空条件下使用等离子清洗仪以高功率（射频功率30 W）对盖玻片进行1分钟的等离子处理。处理后务必缓慢释放真空，以防止盖玻片在腔室内移动。
    注意：玻璃表面的等离子处理具有两个作用：一是清洁玻璃表面以去除污染物，二是在玻璃表面生成含氧的极性基团，使其更具亲水性25。这种亲水性使玻璃表面更有利于蛋白质的结合。
  7. 在无直射阳光或强顶光的环境中，将浓度不低于100 µg/mL的荧光标记蛋白溶液100 µL滴加至每片盖玻片上，加盖以进一步避光，静置20分钟。
    注意：此处使用的是从人血浆中分离的纤维连接蛋白，并用AlexaFluor 488标记。
    1. 为标记纤维连接蛋白，将已知浓度和体积的未标记纤维连接蛋白与适量荧光染料加入1.5 mL离心管中。用铝箔包裹管子以避光，在室温下孵育1小时，每隔10分钟轻轻混匀一次，通过将管子倒置5–10次实现混匀。
      注意：所需染料的量取决于所用染料种类及蛋白质量。参见补充文件1中的计算器，用于确定Alexa 488标记纤维连接蛋白所需的染料量。根据制造商说明，可使用脱盐柱过滤去除过量染料（见材料表）。
  8. 用去离子水彻底冲洗每片盖玻片，并通过轻轻将盖玻片边缘轻触纸巾或其他吸水材料的方式去除表面多余水分。将盖玻片在黑暗中敞开放置至少30分钟，使其完全干燥。
  9. 在蛋白包被的盖玻片干燥期间，使用手术刀或其他锋利刀片从模具上小心切下PDMS印模。
    注意：首次切割时不宜用力过猛一次性切透PDMS，否则施加的压力可能导致硅晶片开裂，从而损坏模具。
  10. 在真空条件下以高功率（射频功率30 W）对PDMS印模进行2分钟的等离子处理。
  11. 在通风橱内，将印模放入带盖容器中，并在每个印模表面涂覆一层极薄的10%（3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（3-APTMS）溶液（<100 µL），该溶液用100%乙醇稀释。
    警告：3-APTMS为易燃物，对皮肤和眼睛具有刺激性；应远离火焰或火花，操作时佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱中进行。3-APTMS溶液涂覆过量会导致后续步骤中形成橙色薄膜。该3-APTMS表面处理将氨基官能团引入PDMS印模表面，为后续进一步修饰印模表面提供可能26。
  12. 盖上容器，让印模在室温下静置5分钟。
  13. 使用去离子水彻底冲洗每个印模的两面。
  14. 将印模放入洁净容器中，并充分覆盖2.5%戊二醛的去离子水溶液。
    警告：戊二醛具有毒性，操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱中进行。此戊二醛处理与之前的3-APTMS处理共同在PDMS印模表面引入醛基官能团，这些醛基可与蛋白质中的氨基反应形成仲胺键，这对后续的蛋白质转移过程至关重要27。
  15. 盖上容器，让印模在室温下静置30分钟，然后再次用去离子水彻底冲洗。以与处理盖玻片相同的方式去除印模表面多余水分，并将印模敞开放置约30分钟使其干燥。
  16. 30分钟后，检查蛋白包被的盖玻片和印模是否均已完全干燥。若任一未完全干燥，使用过滤空气枪彻底吹干，同时确保盖玻片不长时间暴露于光照下。
  17. 当盖玻片和印模均干燥后，将印模带有图案的一面朝下，施加适当压力使其完全贴合盖玻片表面。保持接触15分钟。
    注意：由于戊二醛处理的印模与玻璃盖玻片上的蛋白层之间形成了共价酰胺键，其强度远高于蛋白层与玻璃盖玻片之间的弱疏水相互作用，因此当印模被揭下时，蛋白应按照PDMS印模的图案从玻璃表面剥离。
  18. 15分钟后，小心地将PDMS印模从盖玻片上揭下。
    注意：若操作成功，印模揭下时应有一定阻力，但不应过于牢固以致需施加过大外力才能剥离。
  19. 使用荧光显微镜上适当的滤光片（根据蛋白质所标记的荧光染料类型选择）检查图案化盖玻片的图案保真度。
  20. 立即使用图案化盖玻片，或避光保存以备后续使用。

3. 活化盖玻片

注意：本步骤用于制备实验腔室中聚丙烯酰胺（PAA）凝胶所用的底部盖玻片。该底部盖玻片经过特殊处理，可在图案化过程中当顶部图案化盖玻片被移除时，仍确保PAA凝胶牢固附着。类似技术在其他文献中也有描述10,12,15,28。

  1. 将30 mm盖玻片在100%乙醇中进行超声处理10分钟，用去离子水冲洗，然后用过滤的压缩空气彻底吹干。每次最多可批量处理6个盖玻片，置于6孔板中。
  2. 在高功率（射频功率30 W）下对盖玻片进行等离子处理1分钟，然后将每个盖玻片放入6孔板的各个孔中。
  3. 在通风橱内，用乙醇中5% APTMS的极薄层对每个盖玻片进行包被。
    注意：若此步骤中包被过量，会形成橙色残留物。
  4. 盖上6孔板，让盖玻片静置5分钟。
  5. 用去离子水彻底冲洗盖玻片（两面）以及每个孔的内壁，并去除孔内的多余水分。
  6. 将盖玻片重新放回6孔板中，每孔加入约2 mL含0.5%戊二醛的去离子水溶液。
  7. 盖上6孔板，使盖玻片在戊二醛溶液中孵育30分钟；然后，用去离子水彻底冲洗盖玻片及各孔。
  8. 将处理后的盖玻片保存在6孔板内的去离子水中，最多可保存两周，或立即使用。使用前务必确保盖玻片完全干燥。

4. PAA 凝胶的制备与图案转移

注意：一旦制备好图案化盖玻片，必须尽快将其上的蛋白图案转移至PAA水凝胶上（<24 小时）1,29,30。以下配方用于制备杨氏模量为3.6 kPa的PAA凝胶。可通过调整双丙烯酰胺、丙烯酰胺和去离子水的用量来调节PAA凝胶的刚度12。

  1. 在开始制备PAA水凝胶前体之前，先将丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯从冰箱中取出，使其在打开前升至室温。使用70%乙醇对可更换盖玻片培养皿套装进行灭菌，并在生物安全柜中用紫外光照射至少30分钟，以备使用。
    警告：NHS为有毒的皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    1. 将1.25 mL的40%丙烯酰胺水溶液加入一个15 mL锥形管中。
      警告：丙烯酰胺为有毒的皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    2. 向同一管中（步骤4.1.1）加入175 µL双丙烯酰胺水溶液。
      警告：双丙烯酰胺为有毒的皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    3. 加入500 µL的10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。
      警告：PBS为眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜。
    4. 加入2.915 mL去离子水。
  2. 用移液器将969 µL该前体溶液转移至一个1.5 mL微量离心管中，其余部分储存于4 °C，可保存最多两周。
  3. 在另一微量离心管中称取约50–100 mg过硫酸铵（APS），用去离子水稀释至100 mg/mL，放置备用。在通风橱中打开已升至室温的NHS酯，小心称取最多3 mg NHS至微量离心管中，用1×PBS将其稀释至1 mg/mL。
    警告：APS为皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。APS和NHS酯均会随时间发生水解，导致储备液中化学物质的活性发生变化。因此，这两种溶液必须每次现配（不同于前体的其他组分）。
  4. 在通风橱中进行以下三个步骤：
    1. 向含有969 µL PAA前体溶液的微量离心管中加入2 µL四甲基乙二胺（TEMED）。
      警告：TEMED为易燃的皮肤和眼睛刺激物；应远离热源、火焰和火花，操作时佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行。TEMED是PAA水凝胶聚合过程中两种关键交联剂之一，另一种为APS。
    2. 加入15 µL 1 M盐酸，以降低水凝胶溶液的pH值，防止NHS酯水解。
      警告：盐酸为腐蚀性皮肤和眼睛刺激物；操作时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。
    3. 向管中加入10 µL NHS酯溶液。
      注：NHS对图案化过程至关重要。它将与图案化盖玻片上蛋白质中的氨基反应，形成稳定的酰胺键，从而使图案在PAA凝胶聚合过程中从玻璃盖玻片转移至凝胶表面31。
  5. 在生物安全柜中进行以下最终步骤：
    1. 小心将30 mm盖玻片放入盖玻片培养皿套装的金属部分中（3-APTMS和戊二醛处理面朝上），并旋紧顶部塑料环。将图案化盖玻片放置妥当，以便下一步操作时易于取用，同时尽可能避免光照。
    2. 向微量离心管中剩余的PAA前体溶液中加入5 µL APS溶液，轻轻颠倒混匀，然后立即移取35 µL该溶液至30 mm盖玻片上。
    3. 将图案化盖玻片的蛋白面朝下轻轻覆盖在溶液上，注意避免在水凝胶中产生气泡。避光保护水凝胶，并使其聚合90分钟。
    4. 水凝胶聚合完成后，使用剃刀刀片或手术刀小心移除上层盖玻片，确保盖玻片在移除后不会滑落或重新掉落到凝胶表面，以免破坏凝胶表面的图案。
      注：不要将凝胶暴露在有显著气流的环境中（如生物安全柜内）。
    5. 为钝化水凝胶中残留的NHS酯，向凝胶中加入2 mL无菌PBS，在37 °C孵育45分钟。随后立即用于实验，或在4 °C的无菌PBS中过夜保存，以备后续使用。

5. 成像

  1. 在进行细胞实验前，于计划实验的前一天下午开启显微镜的加热（37 °C）和加湿（70%）功能，使显微镜腔室内的设备有足够时间达到设定温度并平衡。
    注意：此步骤可最大限度减少因温度波动引起的轴向漂移（z-drift）。
  2. 在实验开始前立即开启腔室的 CO2 气源。
  3. 为防止实验过程中因显微镜载物台反复移动而导致的 x-y 方向漂移，使用双面胶带将承载细胞接种水凝胶的可更换盖玻片培养皿固定在载物台上。
  4. 观察凝胶，选择需要成像的感兴趣区域，并保存每个待成像区域的载物台位置。
  5. 在明场成像模式和对应标记蛋白的荧光成像模式下，设置显微镜软件每 5 分钟对每个视野成像一次，持续 2 小时。

6. 图像分析

注意：已开发出一种系统，可通过确定牵引点的位置、插值计算变形点的初始位置，进而计算每个位置的细胞牵引力，来测量图案化PAA凝胶的形变。任何能够执行图像处理和数值计算的软件系统均可使用。该程序旨在快速确定牵引力，消除用户输入和预处理步骤，从而避免由用户引起的相关误差。此处使用的代码作为补充文件2-10提供，这些文件以及一对练习图像可在 www.bu.edu/mml/downloads 获取。

  1. 在图像处理软件中，按时间序列实验中各显微镜视野所拍摄图像的先后顺序，从第一张到最后一张，依次打开所有单张图像，并将其合并为一个图像栈（点击 图像 | 栈 | 图像到栈）。确保生成两个独立的图像栈：一个是细胞的明场图像栈，另一个是细胞所附着图案的荧光图像栈。
    1. 如果荧光图像中存在漂移现象（即感兴趣区域在相邻帧之间的 x 和/或 y 方向上移动超过 >1–2 µm），则首先使用 StackReg 插件（P. Thévenaz，洛桑瑞士联邦理工学院）对图像栈进行处理，以第一帧图像中的位置为基准，重新对齐栈中每幅图像的位置（点击 插件 | StackReg | 平移 | 确定）。
      注意：此步骤至关重要，因为即使是亚微米级的漂移也会显著影响最终的牵引力计算结果，尤其是在较硬的凝胶上，此时 x-y 方向的漂移已超出预期噪声范围。该代码将在去除漂移后保存图像，这些图像可重新组成新的图像栈用于后续分析。
  2. 将明场图像栈和荧光图像栈输入至 CTFTimelapse.m 文件（补充文件 2）。
    1. 在第 7 行指定图像栈所在文件目录。
    2. 在第 8 和第 9 行，分别指定荧光图像栈及其对应的明场图像栈的文件名。
    3. 指定 PAA 凝胶的刚度（Pa）：
      1. 在第 11–14 行中列出了几种常用的 PAA 水凝胶弹性模量，请注释掉（在行首添加 %）除待分析图像所用凝胶弹性模量外的所有其他选项。若所需模量未列出，可自行添加并注释掉其余选项（测试图像使用 3658.19 Pa）。
    4. 在第 15 行指定荧光点半径（m）（测试图像使用 1 × 10-6 m）。
    5. 在第 16 行指定荧光点最大可能直径（µm）（测试图像使用 2.5 µm）。
    6. 指定像素比例（µm/像素）：
      1. 在第 17–20 行中列出了基于先前成像系统设置的几种不同像素比例，请注释掉（在行首添加 %）除待分析图像所用像素比例外的所有其他选项。若所用比例未列出，可自行添加并注释掉其余选项（测试图像使用 0.1613 µm/像素）。
    7. 在第 35 和第 87 行，指定必要的图像处理文件所在目录。
      注意：程序将从荧光图像栈中识别每个荧光点的位置，并追踪栈中各帧之间每个点的位移20。微接触印刷点的初始位置是已知的，因为当其被正确转移至水凝胶表面时不会发生形变32。
  3. 当程序完成点识别后，等待两个图像窗口和一个对话框出现。使用图 1确认程序是否正确识别了荧光点，且未在无点区域误检出大量点。使用图 2选择一个矩形网格，以辅助程序定位并计算细胞牵引力。
    注意：图 1为细胞的明场图像，叠加了程序识别出的荧光点（以红色显示）（参见图 3A）。图 2显示与图 1相同的荧光点，但背景中不包含明场图像。
    1. 等待弹出对话框提示“选择点后按 Enter 键”——其中每个点即程序识别出的一个红色荧光点——该对话框内含一个标有“Enter”的大按钮。
    2. 在图 2中选择四个不同的点，围绕并包含该图案上的细胞/细胞簇，形成一个矩形网格。使用鼠标左键单击依次选择每个点，并通过点击上述对话框中的Enter按钮确认。记录第一个点与第二个点之间、以及第一个点与第三个点之间的点数，因为程序在四个角点选定后会要求输入这些数值。在命令窗口中输入这些数值（输入数字，并在提示时按下键盘上的回车键）。
  4. 选定矩形网格后，等待脚本基于荧光点位置计算该网格内的细胞牵引力。注意，脚本首先计算每个荧光点几何中心的位移矢量（u），然后根据公式（1）计算对应的牵引力矢量（F）：
    静力平衡公式 F=πEau/(2+ν−ν²)，用于弹性变形分析。    （1）
    其中 E 为 PAA 基底的杨氏模量，a 为荧光点标记物的半径，ν 为 PAA 基底的泊松比32。公式（1）假设基底为无限弹性半空间，牵引力作用于每个圆形点标记的中心，且点标记之间的间距足够大，使得各自的位移互不干扰23。
    注意：在本实验中，使用半径为 a = 1 µm 的点标记，点中心间距为 6 µm。细胞/细胞簇内部的牵引力箭头应指向细胞中心，而细胞/细胞簇外部区域不应出现牵引力箭头（参见图 3C–E）。若细胞内部出现向外的牵引力箭头，或细胞外部出现大量大尺寸牵引力箭头，则表明所选矩形网格不恰当。
  5. 当获得正确的牵引力场后，使用光标选择一个合适的感兴趣区域（ROI），该区域应包围整个细胞/细胞簇，并包含其内部所有牵引力箭头。
    1. 绘制 ROI 时，可多次左键单击以绘制任意边数的多边形；绘制完成后，可通过左键单击角点或边来调整形状或移动 ROI。完成绘制后，双击左键进入栈中的下一张图像。对明场图像栈中的所有图像重复此操作。
      注意：程序将把每个时间点的牵引力和位移数据保存在与原始图像栈相同的文件夹中，以便后续进一步分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用减法微图案化方法制备了具有 3.6 kPa 杨氏模量（E = 3.6 kPa）和 0.445 泊松比（ν = 0.445）的 PAA 水凝胶。水凝胶厚度约为 100 µm，该厚度既可兼容本实验所用成像装置的观察需求，又能防止细胞感知凝胶下方刚性盖玻片的存在，从而避免干扰聚焦于细胞刚度感知的研究23,33。已有研究成功利用间接微图案化方法制备并成像多种其他刚度水平（最高达 30 kPa）的水凝胶34，因此该方法并不局限于仅使用 3.6 kPa 的水凝胶。盖玻片在使用前经戊二醛处理，以确保在移除上方图案化盖玻片时，水凝胶仍能牢固固定于下方盖玻片上（图 2C、D）。

为了可视化并测量细胞簇内的牵引力，将3.6 kPa的水凝胶通过间接方式用荧光标记的纤连蛋白进行图案化（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种改进的间接图案化聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶的方法。该方法在先前已使用的技术基础上进行了优化20,35,36,37,38,39,40,41,42。主要改进之处在于，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章去除蛋白质，从而在中间基底上留下所需的图案，而不是将图案直接印制到基底上。这种方法能够更一致地生成高保真度的微图案，并可一步形成孤立的微图案化岛状结构，而此前这类结构的制备需要两个独立步骤。与之前的两步法相比，本方法所制备的岛状图案在...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者谨此感谢波士顿大学机械工程系的 Paul Barbone 博士在数据处理和分析方面的有益讨论与帮助。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）CMMI-1910401 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷Sigma Aldrich#281778
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific#05-408-129
15 mL 锥形管Fisher Scientific#05-539-12
4 英寸 × 4 英寸 0.060 英寸低电阻铬光刻掩模Advance Reproductions CorporationN/A定制设计的掩模
6 孔板Fisher Scientific#07-200-83
丙酮Fisher Scientific#A18P-4
丙烯酰胺溶液，40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
过硫酸铵Fisher Scientific#BP179-25
双丙烯酰胺Fisher Scientific#PR-V3141
乙醇Greenfield Global#111000200C1GL
玻璃盖玻片，25 mm 圆形Fisher Scientific#12-545-102
玻璃盖玻片，30 mm 圆形Warner#64-1499
滨松 ORCA-R2 相机滨松#C10600-10B
人血浆Valley Biomedical#HP1051P用于分离纤连蛋白
盐酸，1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
可更换盖玻片培养皿套装Bioptechs#190310-35
Kim Wipes 擦拭纸Fisher Scientific#06-666-11C
掩模对准仪Karl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-羟基琥珀酰亚胺酯Sigma Aldrich#130672-5G
NucBlue 活细胞染色剂Thermo Fisher#R37605
奥林巴斯 IX2-ZDC 倒置显微镜奥林巴斯#IX81
PD-10 脱盐柱GE Healthcare#52-1308-00
光刻胶旋转涂布通风罩Headway Research#PWM32
等离子清洗仪Harrick#PDC-001
等离子刻蚀仪TePla#M4L
Prior Lumen 200Pro 光源Prior Scientific#L200
硅片，100 mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9463827
SU-8 显影液Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9901158
Sylgard 184 硅橡胶弹性体Essex Brownell#DC-184-1.1
四甲基乙二胺Fisher Scientific#BP150-20
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷Sigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 物镜奥林巴斯#N2709300
紫外泛光曝光系统Newport#69910
晶圆载片托盘，110 × 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40

参考文献

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