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研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

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DOI：

10.3791/63636

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2022年4月6日

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

本文内容

摘要

微孢子虫寄生虫Nematocida parisii感染Caenorhabditis elegans后，可使线虫产生的后代对该病原体具有高度抗性。这是遗传性免疫的一个实例，属于一种尚未被充分理解的表观遗传现象。本实验方案描述了在遗传学上易于操作的线虫 模型中研究遗传性免疫的方法。

摘要

遗传免疫描述了某些动物如何将先前感染的“记忆”传递给后代。这种机制可增强其子代对病原体的抵抗力，促进生存。尽管在多种无脊椎动物中已有遗传免疫的报道，但介导这一表观遗传现象的机制在很大程度上仍不清楚。该感染的 秀丽隐杆线虫 由天然微孢子虫病原体 Nematocida parisii 导致蠕虫产生的后代对微孢子虫具有强效抗性。本实验方案描述了在遗传背景简单且易于操作的模式生物中对跨代免疫的研究。 N. parisii -秀丽隐杆线虫 感染模型。本文描述了感染的方法 秀丽隐杆线虫 并产生具有免疫预激活的子代。还提供了通过染色微孢子虫并利用显微镜观察感染情况来检测抗微孢子虫感染能力的方法。特别是，遗传性免疫能够阻止微孢子虫对宿主细胞的侵入，以及荧光信号的出现。 原位 杂交（FISH）可用于量化侵染事件。通过使用几丁质结合染料对孢子进行染色，可定量测定免疫预激活后代中产生的微孢子虫孢子的相对数量。迄今为止，这些方法已揭示了遗传性免疫的动力学特征和病原体特异性，以及其潜在的分子机制。这些技术，连同现有的大量研究工具，可用于 秀丽隐杆线虫 研究将推动遗传免疫学领域的重要发现。

引言

遗传免疫是一种表观遗传现象，指亲代暴露于病原体后能够产生具有抗感染能力的子代。这种免疫记忆已在许多缺乏适应性免疫系统的无脊椎动物中得到证实，可抵御病毒、细菌和真菌性疾病1。尽管遗传免疫对于理解健康与进化具有重要意义，但介导这种保护作用的分子机制在很大程度上仍不清楚。部分原因在于，已报道存在遗传免疫的许多动物并非研究中常用的标准模式生物。相比之下，对透明线虫Caenorhabditis elegans的研究则具有诸多优势，包括丰富的遗传学与生物化学研究工具2,3、高度注释的基因组4,5以及较短的世代周期。事实上，关于C. elegans的研究已推动了表观遗传学和先天免疫领域的多项基础性进展6,7，目前它已成为研究免疫记忆的成熟模式生物8,9。

微孢子虫是一类真菌性病原体，可感染几乎所有动物，并在免疫功能低下的人群中引起致命感染

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方案

本研究使用在21 °C条件下培养的野生型C. elegans Bristol N2品系。

1. 培养基的制备

  1. 按照先前报道的方法制备M9培养基21,22.
  2. 按照先前报道的方法制备线虫生长培养基（NGM）21,22每个6厘米培养皿中加入12 mL NGM，每个10厘米培养皿中加入30 mL NGM。
  3. 准备 大肠杆菌 按照先前报道的方法使用菌株 OP50-123.
  4. 按照以下步骤制备接种OP50-1的NGM平板。
    1. 通过涡旋振荡重悬10倍浓缩的OP50-1。
    2. 使用重复移液器在培养皿中央接种。6 cm 和 10 cm 培养皿分别接种 200 µL 或 500 µL 体积。
    3. 对于10 cm的培养皿，使用玻璃涂布棒将OP50-1均匀涂布，形成细菌菌苔。细菌不要涂至培养皿的最边缘。
      注意：每涂布五个平板后，需将涂布棒浸入乙醇并过火灭菌，以确保无菌。涂布前让涂布棒冷却数秒，以免高温....

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结果

在本研究中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）的亲代群体（P0）在L1阶段以低剂量的N. parisii孢子进行感染。这种感染条件通常用于通过亲本漂白法获得大量微孢子虫抗性F1子代。感染的亲代群体与未感染的对照组均在感染后72小时（72 hpi）固定，并用DY96染色以观察线虫胚胎和微孢子虫孢子（图1A）。感染个体体型较小，含有大量微孢子虫孢子，且产生的胚胎数量少于健康的未感染对照组。对线虫生殖力的评估显示，约95%的未感染个体可产生后代，而感染个体中该比例低于80%（图1B）。定量分析表明，约90%的微孢子虫处理群体已被感染，依据为含有DY96染色孢子的线虫数量（图1C）。为了获得免疫预激活的F1子代，使用微孢子虫剂量至关重要：剂量需足够高以确保大多数亲本被感染，但又足够低以保证群体仍能产生后代。本研究中所用微孢子虫剂量的详细信息见（表1）。

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讨论

本方案描述了在一种简单且遗传学上易于操作的微孢子虫 N. parisii 与 C. elegans 感染模型中研究微孢子虫及遗传免疫的方法。

孢子制备是一项耗时的实验流程，通常可获得足够未来6个月实验使用的孢子，具体产量取决于产孢效率24重要的是，每一批新孢子都必须测定其感染性 "批次" 在用于实验之前，由于不同孢子制备物之间的感染性存在差异，必须在实验的所有重复中持续使用同一批次的孢子。单个分装样品不应反复冻融，因为解冻可能导致孢子萌发并降低其感染性。因此，孢子仅可在感染前立即从-80 °C冰箱中取出，并在操作过程中始终保持在冰上。

在步骤5-6中概述了感染实验。在进行感染实验时，必须避免动物受到污染或饥饿，因为这可能导致额外的跨代效应，从而干扰F1代的免疫表型。遗传性免疫实验的一个重要局限性在于，感染程度更高的亲代产生的F1后代数量更少。因此，必须在亲代感染程度足够以传递免疫力，同时又保持足够健康以产生可供检测的后代之间，取.......

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

感谢赵Winnie和Wan Yin Chen对本文手稿提供的有益评论。本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（资助号：522691522691）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2.0 mm 氧化锆珠Biospec Products Inc.11079124ZX
10 mL 注射器Fisher Scientific1482613
5 μm 滤膜Millipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Zeiss-用于在显微镜载玻片上对 DY96 和 FISH 染色的线虫进行成像的荧光显微镜
Axio Zoom V.16 荧光体视变倍显微镜Zeiss-用于活体荧光转基因动物的成像以观察 IPR
Baked EdgeGARD 水平气流洁净工作台Baker-
珠磨破碎仪，Genie SI-D238 模拟型细胞破碎仪，120 VGlobal IndustrialT9FB893150
Cell-VU 载片，Millennium Sciences 一次性精子计数板Fisher ScientificDRM600
直接黄 96（Direct Yellow 96）Sigma-AldrichS472409-1G
含 DAPI 的 EverBrite 封片剂Biotium23001
不含 DAPI 的 EverBrite 封片剂Biotium23002
Fiji/ImageJ 软件ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
机械旋转器Thermo Scientific415110 / 1834090806873用于旋转装有漂白后胚胎的离心管，以实现过夜孵化
MicroB FISH 探针Biosearch Technologies Inc.-以 Quasar 570（Cy3）进行 5' 修饰并经 HPLC 纯化合成，序列：CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2野生型，Bristol 品系默认品系秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-AldrichL3771-100G
氢氧化钠溶液（5 N）Fisher ChemicalFLSS256500
次氯酸钠溶液（6%）Fisher ChemicalSS290-1
Stemi 508 体视显微镜Zeiss-用于线虫日常维护以及实验设置时 L1 期线虫的计数
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500

参考文献

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al.

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Nematocida parisii DY96

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