利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

摘要

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。

摘要

在活体系统中探测金纳米颗粒（AuNPs）对于揭示AuNPs与生物组织之间的相互作用至关重要。此外，通过将非线性光学信号（如受激拉曼散射（SRS）、双光子激发荧光（TPEF）和瞬态吸收（TA））整合到成像平台中，可实现对细胞结构和AuNPs的多模态生物分子对比成像。本文介绍了一种多模态非线性光学显微技术，并将其应用于癌细胞中AuNPs的化学特异性成像。该成像平台为开发更高效的功能化AuNPs提供了新方法，并可用于判断这些颗粒是否位于肿瘤周围血管内、细胞周围或细胞内部空间。

引言

金纳米颗粒（AuNPs）作为生物相容性成像探针展现出巨大潜力，例如在多种生物医学应用中作为有效的表面增强拉曼光谱（SERS）基底。其主要应用领域包括生物传感、生物成像、表面增强光谱学以及用于癌症治疗的光热疗法¹。此外，在活体系统中探测AuNPs对于评估和理解AuNPs与生物系统之间的相互作用至关重要。已有多种分析技术被成功用于研究AuNPs在组织中的分布，包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）²、激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）³和磁共振成像（MRI）⁴。然而，这些方法存在若干缺点，例如耗时较长、样品制备复杂³、需要较长的数据采集时间，或缺乏亚微米级空间分辨率^2,4。

与传统成像技术相比，非线性光学显微技术在探测活细胞和金纳米颗粒（AuNPs）方面具有多项优势：非线性光学显微技术利用近红外超快激光，可实现更深的成像深度，并具备固有的三维光学切片能力。随着成像速度和检测灵敏度的显著提升，双光子激发荧光（TPEF）⁵

方案

1. 启动激光系统

1. 启动系统前，先打开联锁系统并选择臂激光器。
2. 打开配备控制双输出飞秒激光器软件的计算机。
3. 加载双输出飞秒激光器的软件；该软件可用于开启和关闭激光器，并直接控制泵浦光束的波长。
4. 按住电源图标持续3秒，以开启激光发射。
5. 等待激光器预热完成，直至软件中显示激光就绪的指示灯变为绿色。
6. 泵浦光束的波长可通过软件直接调节，范围为680–1,300 nm。在进行C-H拉曼振动区域的细胞成像时，应选择802 nm。
7. 按住光圈图像3秒，打开可调谐泵浦光束和1,045 nm斯托克斯光束的快门。
   警告：双输出飞秒激光器属于IV类红外脉冲激光器，可能对视力造成永久性损伤。因此，执行本操作时必须遵守所有当地激光安全规定：（i）仅限接受过激光安全培训的授权人员操作；（ii）实验室入口 via 采用刷卡门禁并配备房间门联锁装置；（iii）在大多数操作过程中，激光光束完全封闭；（iv）当激光光束暴露时，必须佩戴激光防护眼镜（使用LG9型激光防护眼镜，对泵浦光束和斯托克斯光束均提供OD 7+的防护等级）。

2. 启动光谱聚焦定时与重组单元（SF-TRU）

1. 在同一台计算机上加载ATM软件，该软件控....

结果

在双输出飞秒激光器与改装的激光扫描显微镜之间引入了光谱聚焦时序与重组单元（SF-TRU）模块。本研究中使用的可调谐超快激光系统具有两个输出端口，其中一个输出固定波长为1,045 nm的光束，另一个输出光束的波长可在680–1,300 nm范围内调节。图1展示了SF-TRU模块及多模态成像平台的详细示意图。SF-TRU用于将两束飞秒激光脉冲展宽为皮秒脉冲，并在空间和时间上实现两束光的重叠。通过扫描皮秒泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的延迟，实现高光谱受激拉曼散射（SRS）成像。

所有样品均通过改装的倒置显微镜上高数值孔径（NA）物镜，由脉冲激光进行照射。受激拉曼散射（SRS）和双光子激发荧光（TPEF）信号由高NA聚光镜在前向收集。在SRS显微成像中，可调谐（680–1,300 nm）和固定（1,045 nm）激光输出分别用作泵浦光束和斯托克斯光束。SRS成像采用大面积光电二极管结合锁相放大器实现，同时使用两个滤光片（890/210带通滤光片和950 nm短通滤光片）阻断斯托克斯光束。与基于皮秒激光的系统相比，光谱聚焦SRS方法的.......

讨论

本研究展示了SF-TRU模块与超快双输出激光系统的结合，并证明了其在多模态显微光谱学中的应用。该多模态成像平台能够检测金纳米颗粒（AuNPs）被癌细胞的摄取情况，当激光束被AuNPs吸收时，可实现对癌细胞热疗过程中细胞响应的可视化观察。

此外，通过采用光谱聚焦技术，利用两组光栅对分别控制每束激光的啁啾，可实现快速的化学特异性成像和高光谱分辨率。与使用固定长度的玻璃棒进行啁啾调节相比，光栅对能够更好地匹配目标拉曼谱线的光谱分辨率和谱线宽度¹⁹。

此外，通过使用专门设计的手动滑块将光栅从光路中移除而不影响显微镜内部的光路准直，该系统可轻松在飞秒与啁啾皮秒模式之间切换。为了实现高灵敏度和高光谱分辨率，受激拉曼散射（SRS）通常采用窄带皮秒泵浦光和斯托克斯光脉冲来实施。然而，对于需要更高峰值功率的多光子激发而言，皮秒激光器并不足够，而飞秒激光器能够达到所需的峰值功率水平。该系统的多模态功能使其可用于多种应用，例如多光子成像²⁰、相干拉曼散射.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APE SRS 检测单元	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE 锁定模块	包含大面积硅光电二极管的集成系统，用于检测泵浦光束，同时配备锁相放大器以检测光束调制
共聚焦扫描单元	奥林巴斯	FV 3000	用于成像的共聚焦扫描单元
CML 乳胶微球，4% w/v，1.0 µm	Invitrogen	C37483	聚苯乙烯微球
盖玻片	Thorlabs	CG15CH2	用于细胞接种的 22 mm × 22 mm 盖玻片
FBS	Gibco	10500-064	胎牛血清（经热灭活）
Flouview	奥林巴斯	FV31S-SW	激光扫描显微镜控制软件
函数发生器	BX precision	40543	用于生成方波信号，输入至 SF-TRU 中的电光调制器（EOM），以实现斯托克斯光束的调制
金纳米颗粒	Nanopartz	A11-60	球形金纳米颗粒，直径 60 nm
输入输出接口	奥林巴斯	FV30 ANALOG	该单元可将来自 PMT 和锁相放大器的电压读数输入共聚焦扫描软件，并可在奥林巴斯显微镜与 SF-TRU 单元之间传输时序脉冲
InSight X3	纽波特	Spectra-Physics	双输出飞秒脉冲激光器。具有可调谐（680–1300 nm）和固定（1045 nm）激光输出，重复频率为 80 MHz
显微镜主体	奥林巴斯	IX83	倒置显微镜
小鼠 4T1 细胞	ATCC	CRL-2539	小鼠乳腺癌细胞
NA 1.2 水浸物镜	奥林巴斯	UPLSAPO60XW/IR	多光子 60 倍物镜，工作距离为 0.28 mm。其他类似物镜也可使用
NA 1.4 聚光镜	尼康	CSC1003	也可使用数值孔径高于激发物镜的其他聚光镜
PMT	滨松	R3896	用于检测 CARS 显微成像中的反斯托克斯光子的光电倍增管
PMT 连接器	滨松	C13654-01-Y002	PMT 专用连接器
电源	RS	RSPD-3303 C	可编程电源，用于为 PMT 提供合适的电压
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640 培养基已被证实适用于多种哺乳动物细胞
SF-TRU	纽波特 Spectra Physics	SF-TRU	用于控制两束激光输出的时间延迟和色散，并执行 SRS 所需光束调制的系统