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方法文章

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

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DOI：

10.3791/63637

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2022年5月16日

 ,  ,  , 
1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。

摘要

在活体系统中探测金纳米颗粒（AuNPs）对于揭示AuNPs与生物组织之间的相互作用至关重要。此外，通过将非线性光学信号（如受激拉曼散射（SRS）、双光子激发荧光（TPEF）和瞬态吸收（TA））整合到成像平台中，可实现对细胞结构和AuNPs的多模态生物分子对比成像。本文介绍了一种多模态非线性光学显微技术，并将其应用于癌细胞中AuNPs的化学特异性成像。该成像平台为开发更高效的功能化AuNPs提供了新方法，并可用于判断这些颗粒是否位于肿瘤周围血管内、细胞周围或细胞内部空间。

引言

金纳米颗粒（AuNPs）作为生物相容性成像探针展现出巨大潜力，例如在多种生物医学应用中作为有效的表面增强拉曼光谱（SERS）基底。其主要应用领域包括生物传感、生物成像、表面增强光谱学以及用于癌症治疗的光热疗法1。此外，在活体系统中探测AuNPs对于评估和理解AuNPs与生物系统之间的相互作用至关重要。已有多种分析技术被成功用于研究AuNPs在组织中的分布，包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）2、激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）3和磁共振成像（MRI）4。然而，这些方法存在若干缺点，例如耗时较长、样品制备复杂3、需要较长的数据采集时间，或缺乏亚微米级空间分辨率2,4。

与传统成像技术相比，非线性光学显微技术在探测活细胞和金纳米颗粒（AuNPs）方面具有多项优势：非线性光学显微技术利用近红外超快激光，可实现更深的成像深度，并具备固有的三维光学切片能力。随着成像速度和检测灵敏度的显著提升，双光子激发荧光（TPEF）5,6,7 和二次谐波产生（SHG）8,9,10 显微技术已被证实可进一步提升对活细胞和组织中内源性生物分子的无创成像效果。此外，通过采用新型泵浦-探测非线性光学技术，如瞬态吸收（TA）11,12,13,14 和受激拉曼散射（SRS）15,16,17,18，能够获得细胞结构和金纳米颗粒（AuNPs）的无标记生化对比信息。在不使用外源性标记物的情况下对金纳米颗粒（AuNPs）进行可视化成像具有重要意义，因为对纳米颗粒的化学修饰会改变其物理性质，从而影响其在细胞中的摄取行为。

本方案介绍了用于双波长脉冲激光器的光谱聚焦定时与重组单元（SF-TRU）模块的实现方法，可实现对金纳米颗粒（AuNPs）和癌细胞的快速多模态成像。本研究旨在展示在激光扫描显微镜上集成双光子激发荧光（TPEF）、光声（TA）和受激拉曼散射（SRS）技术的详细步骤。

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方案

1. 启动激光系统

  1. 启动系统前，先打开联锁系统并选择臂激光器。
  2. 打开配备控制双输出飞秒激光器软件的计算机。
  3. 加载双输出飞秒激光器的软件；该软件可用于开启和关闭激光器，并直接控制泵浦光束的波长。
  4. 按住电源图标持续3秒，以开启激光发射。
  5. 等待激光器预热完成，直至软件中显示激光就绪的指示灯变为绿色。
  6. 泵浦光束的波长可通过软件直接调节，范围为680–1,300 nm。在进行C-H拉曼振动区域的细胞成像时，应选择802 nm。
  7. 按住光圈图像3秒，打开可调谐泵浦光束和1,045 nm斯托克斯光束的快门。
    警告：双输出飞秒激光器属于IV类红外脉冲激光器，可能对视力造成永久性损伤。因此，执行本操作时必须遵守所有当地激光安全规定：（i）仅限接受过激光安全培训的授权人员操作；（ii）实验室入口 via 采用刷卡门禁并配备房间门联锁装置；（iii）在大多数操作过程中，激光光束完全封闭；（iv）当激光光束暴露时，必须佩戴激光防护眼镜（使用LG9型激光防护眼镜，对泵浦光束和斯托克斯光束均提供OD 7+的防护等级）。

2. 启动光谱聚焦定时与重组单元（SF-TRU）

  1. 在同一台计算机上加载ATM软件，该软件控制SF-TRU单元中的延迟阶段和激光衰减器。
    注意：该单元负责确保泵浦光束和斯托克斯光束在空间上重叠，调控泵浦光束和斯托克斯光束的色散，并控制泵浦光束与斯托克斯光束之间的时间延迟。泵浦光束和斯托克斯光束的偏振方向均为垂直方向。请注意，每束光均配备一个半波片，可在光束离开SF-TRU前独立调节各自的偏振方向。
  2. 确保泵浦激光和斯托克斯激光的衰减程度均低于<10%（泵浦）和<15%（斯托克斯光束）。如果未进行衰减，激光功率可能损坏系统并灼伤生物样品。
  3. 对于细胞成像，将最佳激光设置调整为6%（泵浦）和10%（斯托克斯），对应样品处的功率为12 mW和30 mW。
  4. SF-TRU具有两种模式：飞秒（fs）模式和皮秒（ps）模式。
  5. 在飞秒模式下，将盒子两侧的旋钮推入（此举将色散光栅从光路中移除）。
  6. 在皮秒模式下，将盒子两侧的旋钮拉出（此举将色散光栅置入光路中）。
  7. 进行高光谱成像时，应选择皮秒（ps）模式。
  8. 确保延迟阶段处于正确位置，以使泵浦光束和斯托克斯光束在此系统上进行C-H成像时实现时间上的重叠。
  9. 确保泵浦光束和斯托克斯光束的色散设置正确；对于802 nm的泵浦光，泵浦光束应设为5 mm，斯托克斯光束应设为30 mm。

3. 用于SRS成像的斯托克斯光束调控

  1. 对于受激拉曼散射（SRS）检测，调节斯托克斯光束的强度。
  2. 打开信号发生器以进行光束调制。
  3. 恢复之前的设置，具体如下：
    输出1：方波：频率 = 19.5 MHz，振幅 = 1.4 V。
    输出2：方波：频率 = 19.5 MHz，振幅 = 300 mV。
  4. 打开输出1和输出2。
  5. 将输出1连接到SF-TRU盒中EOM的放大器 通过 BNC 电缆
  6. 将输出端2连接至用于SRS检测的锁相放大器 通过 BNC 电缆
  7. 打开龙门架上放大器的电源。

4. 开启锁相放大器

  1. 进行受激拉曼散射（SRS）成像时，使用包含大面积光电二极管和专用锁相放大器的SRS检测模块。
  2. 打开机架上锁相放大器的电源。
  3. 在计算机上加载锁相放大器的软件“SRS detection Module”。
  4. 在软件中选择以下设置：相位 = 0°，偏移 = -80 mW，增益 = 58 dB。
  5. 在软件中选择锁相放大器的积分时间常数：对于细胞成像，2 µs的时间常数可获得高质量图像。

5. 激光扫描显微镜的操作

  1. 打开除遥控箱外所有设备的电源开关。等待位于机架顶部的控制箱上 standby 指示灯亮起。
  2. 打开机架上的遥控盒开关，并打开盒背面的电源开关。等待遥控盒上的指示灯变为蓝色后，按下 开始操作.
  3. 打开激光扫描显微镜的计算机。
  4. 运行共聚焦显微镜软件。
  5. 检查显微镜的光路 通过 计算机软件
    注意：对显微镜进行了一些改装以使其适用于SRS成像：（i）在光路中，已在激光束进入扫描单元处的滤光轮上添加了一个775 nm短通滤光片，可在软件中选择该滤光片以阻挡残余的基频光；（ii）在扫描单元与显微镜主体之间插入了一个带通滤光片轮，用于选择性地阻挡拉曼信号之外的背景光。 光路 计算机软件中的标签页。（ii）检测未使用共聚焦显微镜内置的光电倍增管（PMT），而是在透射光路中添加了定制的探测器，从而实现受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）的检测。（iii）这些探测器的输出信号连接至龙门架上的模拟信号盒。来自光电倍增管的CARS信号已连接 通过 将BNC电缆连接至CD1，并将锁相放大器的SRS信号接入 通过 BNC 电缆连接至 CD2。
  6. 通过触摸屏、遥控旋钮或计算机软件控制焦距。
  7. 在软件中选择所需的图像设置，包括放大倍数、像素尺寸和像素驻留时间。
  8. 确保成像速度（像素驻留时间）大于锁相放大器软件中设置的积分时间。
    注意：成像时使用了数值孔径为1.2的水浸物镜。

6. 将样品安装到显微镜载物台上

  1. 按如下步骤准备用于成像的细胞样品。
    1. 将4T1小鼠乳腺癌细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中。每2天更换一次培养基，并在细胞融合度达到70%–80%时进行传代。
      注意：本研究所述实验均使用第8–10代细胞。
    2. 进行成像实验时，将1 × 105个细胞接种于方形盖玻片上，在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。随后用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并在细胞培养基中加入金纳米颗粒（按1:100稀释，储存浓度：2.3 × 1010 粒子/mL，直径：60 nm），继续孵育4小时。
    3. 成像前，用预冷的PBS洗涤细胞，然后在室温（RT）下用含4%多聚甲醛的PBS固定15分钟。用PBS洗涤3次后，将样品夹在两片盖玻片之间用于成像。
  2. 在水浸物镜顶部滴加一滴蒸馏水，该物镜用于将激光束聚焦至物镜与样品之间的样本中。然后将样品放置在显微镜载物台上。
  3. 使用数值孔径（NA）为1.4的聚光镜收集前向传播的光。在聚光镜与样品之间滴加一滴水以进行成像。调节聚光镜高度，使其位于样品上方约1 mm处，以收集最大量的光信号。
  4. SRS探测器安装在可移动支架上，可从光路中滑入或滑出。若需使用白光对样品进行聚焦，请先将SRS探测器移出光路。
  5. 将探测器重新放回光路中，准备进行SRS成像。

7. 改变拉曼位移并采集高光谱数据集

注意：成像所对应的拉曼位移取决于SF-TRU盒中延迟阶段的位置以及激光系统泵浦光束的波长。

  1. 对于拉曼位移的大幅变化，应改变激光波长。例如，成像 2,800–3,100 cm⁻¹ 范围内的 CH 振动时-1，选择802 nm，而用于1,600 cm附近的成像时-1 对于酰胺 I 峰，选择波长为 898 nm 的泵浦光束。调节此 通过 软件。
  2. 为实现拉曼位移的微小调整，请扫描SF-TRU单元中的延迟台。
  3. SF-TRU 以毫米（mm）为单位给出延迟台位置。将延迟台位置从毫米（mm）转换为厘米（cm）-1，使用聚苯乙烯微珠样品进行校准高光谱扫描，并将校准扫描中获得的峰位与自发拉曼装置测得的峰位进行比较。该步骤将得到一个线性方程，用于将延迟台位置（单位：mm）转换为拉曼位移（单位：cm⁻¹）。-1.
  4. 通过在不同的延迟阶段位置采集一系列时间序列图像，生成高光谱扫描。
  5. 为同步图像采集与延迟台的运动，使用模拟单元向SF-TRU系统发送和接收TTL信号。
    注意：为此，模拟箱具有以下连接：(i) TRIG OUT VD1——此接口连接至 SF-TRU 通过 一个BNC发送TTL信号，指示延迟阶段向前移动+1个增量。（ii）触发输入1——此处接收信号 通过 当延迟阶段完成其运动时，BNC用于触发光学时间序列中的下一张图像。
  6. 对于高光谱数据集，在共聚焦显微镜软件中选择以下设置：
    1. 在 触发器 标签，选择 从 TTL 触发开始 （开启）和 触发 （每一帧）
    2. 在 系列 标签，设置时间序列 开启 以及z系列 关闭.
    3. 将时间序列中的帧数设置为与ATM软件中的步数相匹配（此处使用101步）。
  7. 在 ATM 软件中，前往 运行 表。
    1. 将延迟阶段的起始和停止位置设置为高光谱扫描的毫米单位值。对于CH高频区，起始位置设为90.25 mm，停止位置设为92.25 mm。
    2. 确保步骤数量与共聚焦显微镜软件中的帧数相匹配。
  8. 检查正确设置后，首先在共聚焦显微镜软件中启动高光谱扫描序列。前往 获取 并点击 开始扫描然后，在ATM软件中，点击 开始这将启动一系列图像的采集，在选定的起始位置和终止位置之间，延迟阶段的位置逐步增加。
  9. 将高光谱图像序列导出为多帧 .tif 文件，并使用合适的软件包进行校准。
  10. 校准完成后，使用线性校准方程将延迟台位置转换为拉曼位移。
  11. 在CH振动区域（2,800–3,100 cm⁻¹）成像切换时-1) 至酰胺 I 振动区 1,500–1,700 cm⁻¹-1），执行以下操作。
    1. 将激光器软件中的泵浦波长从 802 nm 更改为 898 nm。
    2. 将ATM软件中的斯托克斯色散设置从30 mm更改为5 mm。
    3. 在SF-TRU箱内泵浦光束色散光路中，对反射镜进行微调。通过调节镜架下方的旋钮，可逐级改变反射镜的角度。
    4. 进行酰胺I区的高光谱扫描时，在ATM软件中将起始和终止位置分别设置为89 mm和91 mm
      警告：此步骤中激光束将暴露，必须佩戴激光防护眼镜。

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结果

在双输出飞秒激光器与改装的激光扫描显微镜之间引入了光谱聚焦时序与重组单元（SF-TRU）模块。本研究中使用的可调谐超快激光系统具有两个输出端口，其中一个输出固定波长为1,045 nm的光束，另一个输出光束的波长可在680–1,300 nm范围内调节。图1展示了SF-TRU模块及多模态成像平台的详细示意图。SF-TRU用于将两束飞秒激光脉冲展宽为皮秒脉冲，并在空间和时间上实现两束光的重叠。通过扫描皮秒泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的延迟，实现高光谱受激拉曼散射（SRS）成像。

所有样品均通过改装的倒置显微镜上高数值孔径（NA）物镜，由脉冲激光进行照射。受激拉曼散射（SRS）和双光子激发荧光（TPEF）信号由高NA聚光镜在前向收集。在SRS显微成像中，可调谐（680–1,300 nm）和固定（1,045 nm）激光输出分别用作泵浦光束和斯托克斯光束。SRS成像采用大面积光电二极管结合锁相放大器实现，同时使用两个滤光片（890/210带通滤光片和950 nm短通滤光片）阻断斯托克斯光束。与基于皮秒激光的系统相比，光谱聚焦SRS方法的...

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讨论

本研究展示了SF-TRU模块与超快双输出激光系统的结合，并证明了其在多模态显微光谱学中的应用。该多模态成像平台能够检测金纳米颗粒（AuNPs）被癌细胞的摄取情况，当激光束被AuNPs吸收时，可实现对癌细胞热疗过程中细胞响应的可视化观察。

此外，通过采用光谱聚焦技术，利用两组光栅对分别控制每束激光的啁啾，可实现快速的化学特异性成像和高光谱分辨率。与使用固定长度的玻璃棒进行啁啾调节相比，光栅对能够更好地匹配目标拉曼谱线的光谱分辨率和谱线宽度19。

此外，通过使用专门设计的手动滑块将光栅从光路中移除而不影响显微镜内部的光路准直，该系统可轻松在飞秒与啁啾皮秒模式之间切换。为了实现高灵敏度和高光谱分辨率，受激拉曼散射（SRS）通常采用窄带皮秒泵浦光和斯托克斯光脉冲来实施。然而，对于需要更高峰值功率的多光子激发而言，皮秒激光器并不足够，而飞秒激光器能够达到所需的峰值功率水平。该系统的多模态功能使其可用于多种应用，例如多光子成像20、相干拉曼散射...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了工程与物理科学研究委员会（EPSRC）资助项目的支持：拉曼纳米诊疗学（EP/R020965/1）和 CONTRAST 设施（EP/S009957/1）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APE SRS 检测单元APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)APE 锁定模块包含大面积硅光电二极管的集成系统，用于检测泵浦光束，同时配备锁相放大器以检测光束调制
共聚焦扫描单元奥林巴斯FV 3000用于成像的共聚焦扫描单元
CML 乳胶微球，4% w/v，1.0 µmInvitrogenC37483聚苯乙烯微球
盖玻片ThorlabsCG15CH2用于细胞接种的 22 mm × 22 mm 盖玻片
FBSGibco10500-064胎牛血清（经热灭活）
Flouview奥林巴斯FV31S-SW激光扫描显微镜控制软件
函数发生器BX precision40543用于生成方波信号，输入至 SF-TRU 中的电光调制器（EOM），以实现斯托克斯光束的调制
金纳米颗粒NanopartzA11-60球形金纳米颗粒，直径 60 nm
输入输出接口奥林巴斯FV30 ANALOG该单元可将来自 PMT 和锁相放大器的电压读数输入共聚焦扫描软件，并可在奥林巴斯显微镜与 SF-TRU 单元之间传输时序脉冲
InSight X3纽波特Spectra-Physics双输出飞秒脉冲激光器。具有可调谐（680–1300 nm）和固定（1045 nm）激光输出，重复频率为 80 MHz
显微镜主体奥林巴斯IX83倒置显微镜
小鼠 4T1 细胞ATCCCRL-2539小鼠乳腺癌细胞
NA 1.2 水浸物镜奥林巴斯UPLSAPO60XW/IR多光子 60 倍物镜，工作距离为 0.28 mm。其他类似物镜也可使用
NA 1.4 聚光镜尼康CSC1003也可使用数值孔径高于激发物镜的其他聚光镜
PMT滨松R3896用于检测 CARS 显微成像中的反斯托克斯光子的光电倍增管
PMT 连接器滨松C13654-01-Y002PMT 专用连接器
电源RSRSPD-3303 C可编程电源，用于为 PMT 提供合适的电压
RPMI-1640GibcoA10491-01罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640 培养基已被证实适用于多种哺乳动物细胞
SF-TRU纽波特 Spectra PhysicsSF-TRU用于控制两束激光输出的时间延迟和色散，并执行 SRS 所需光束调制的系统

参考文献

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