本文介绍了一种针对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的RNA干扰浸泡法，以促进基因功能研究。
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摘要
摘要
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是全球最具破坏性的入侵物种之一，可导致松树萎蔫并最终死亡。尽管人们已认识到植物寄生性线虫（PPNs）在经济和环境方面的重要性，但迄今为止，尚无法利用传统的正向遗传学和转基因方法深入研究其基因功能。然而，作为一种反向遗传学技术，RNA干扰（RNAi）为研究线虫（包括B. xylophilus）的功能基因提供了有效途径。
本文概述了一种新的RNAi实验方案，用于 ppm-1 基因在 B. xylophilus，据报道在其他致病性线虫的发育与繁殖过程中发挥关键作用。进行RNA干扰（RNAi）时，通过聚合酶链式反应（PCR）将T7启动子连接至目标片段的5′端，并利用体外转录合成双链RNA（dsRNA） 体外 转录。随后，通过将线虫浸泡在含有合成神经刺激剂的dsRNA溶液中实现dsRNA递送。同步的幼虫 B. xylophilus （约20,000个个体）用dsRNA（0.8 µg/μL）溶于浸泡缓冲液中，在25 °C避光浸泡24 h。
将等量的线虫置于不含dsRNA的浸泡缓冲液中作为对照。同时，将另一份等量的线虫置于含有绿色荧光蛋白（gfp）基因dsRNA的浸泡缓冲液中作为对照。浸泡处理后，采用实时定量PCR检测目标转录本的表达水平。随后通过显微镜观察表型特征，并比较各组成虫体长，以验证RNA干扰的效果。本实验方案有助于推动研究深入理解松材线虫（B. xylophilus）及其他寄生性线虫基因的功能，进而为通过基因工程手段开发防控策略提供支持。
引言
植物寄生性线虫（PPNs）持续威胁着粮食安全和森林生态系统。它们每年造成约1000亿美元的经济损失1，其中最主要的问题来自根结线虫、胞囊线虫和松材线虫。松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是一种迁移性内寄生线虫，是松树萎蔫病的致病病原体2。该线虫已对全球松林造成严重危害3。根据Van Megen等人的术语分类4，B. xylophilus属于小杆目下的寄生滑刃科（Parasitaphelenchidae），位于进化分支10（clade 10），而大多数其他主要植物寄生线虫则属于分支12（clade 12）。
作为一种独立且近期进化的植物寄生线虫，B. xylophilus 是进行比较研究的理想模型。迄今为止，针对属于第12进化枝的根结线虫和胞囊线虫已开展了大量研究，这些线虫为专性、定居型的内寄生线虫，也是被研究最为深入的线虫类群之一。然而，在这一重要领域开展进一步研究面临一个主要挑战：寄生相关基因的功能研究已成为该领域的研究瓶颈。功能研究通常包括异位表达和基因敲低/敲除实验，但这些研究依赖于高效的线虫遗传转化技术。因此，植物寄生线虫的反向遗传学研究几乎完全依赖于RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默。
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方案
本研究经浙江农业大学动物实验委员会批准。 & 林业大学。该 B. xylophilus 分离株NXY61最初从患病个体中分离获得 马尾松 中国浙江省宁波市11.
1. 基因克隆
注意：有关本实验方案中所用引物的详细信息，请参见材料表。
- 收集线虫。
- 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，于25 °C条件下，将B. xylophilus菌株接种于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌丝上，培养3–5天。
- 采用贝尔曼漏斗法收集线虫14。
- 在漏斗下方连接一段带夹子的橡胶管，在漏斗口放置两层滤纸。将真菌培养物转移至漏斗中，并加入水浸没菌丝垫。静置2小时后，收集线虫。
- 使用总RNA提取试剂（参见材料表）11，按照以下步骤从线虫中提取总RNA。
- 在2 mL离心管中加入500 µL提取试剂和100 µL磁珠。吸....
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结果
分析 ppm-1 表达 B. xylophilus RNAi 处理后
相对表达水平 ppm-1 基因的 B. xylophilus 分别用GFP dsRNA和目标基因dsRNA浸泡处理的样本值为0.92和0.52（该 ppm-1 ddH 的基因表达水平2O-处理对照组设定为1）（图1因此，外源性dsRNA对 ppm-1 表达 B. xylophilus；然而， ppm-1 dsRNA 可有效抑制目的基因的表达。
效应 ppm-1 生长和发育中的表达
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讨论
尽管松材线虫（B. xylophilus）的生活史和寄生环境与其他线虫不同，但针对这种植物病原体的分子致病机制研究仍十分有限。尽管CRISPR/Cas9基因组编辑技术在秀丽隐杆线虫（C. elegans）及其他线虫中的应用已取得显著进展，但截至目前，仅有关于RNAi技术在松材线虫（B. xylophilus）中应用的报道17。RNAi是研究线虫基因功能最强大的工具之一，已广泛应用于松材线虫（B. xylophilus）的基因功能解析、信号转导通路研究以及基因治疗等领域18,19,20。与无脊椎动物模型中常用的基因敲除方法相比，RNAi介导的靶基因表达下调能够实现对基因功能的快速评估。
进行RNAi有三种方法 秀丽隐杆线虫注射6.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（31870637，31200487）资助，并由浙江省重点研发计划（2019C02024，LGN22C160004）联合资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 贝尔曼漏斗 | n/a | n/a | 用于分离线虫 |
| Beacon Designer 7.9 | 上海康昱盛信息科技有限公司 | n/a | 用于设计qPCR引物 |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | 作为线虫的食物 |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | 其编号为NXY61，最初从中国浙江省宁波市患病的 马尾松中分离获得。 |
| 恒温培养箱 | 上海精宏实验设备有限公司 | H1703544 | 用于培养线虫 |
| 电泳装置 | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | 用于实现电泳分析 |
| 75%乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80176961 | 用于提取RNA |
| Ex Taq聚合酶预混液 | Takara Bio Inc. | RR030A | 用于PCR |
| Ex Taq聚合酶预混液 | Takara Bio Inc. | RR390A | 用于PCR |
| 凝胶成像系统 | 杭州朗基科学仪器有限公司 | LG2020 | 用于使核酸条带可视化 |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | 用于数据分析和绘图 |
| 高速离心机 | 杭州艾本森仪器有限公司 | AS0813000 | 用于离心 |
| 高通量组织研磨仪 | Bertin | 用于提取RNA | |
| ImageJ软件 | 美国国立卫生研究院 | n/a | 用于测量虫体长度 |
| 异丙醇 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 | L1909022 | 用于提取RNA |
| Leica DM4B显微镜 | 徕卡显微系统公司 | 用于观察线虫 | |
| 磁珠 | 奥然科技有限公司 | 150010C | 用于提取RNA |
| MEGAscript T7高产转录试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司 | AM1333 | 用于体外合成dsRNA |
| NanoDrop ND-2000分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司 | NanoDrop 2000/2000C | 用于分析dsRNA的质量 |
| PCR扩增仪 | Bio-Rad生命医学产品有限公司 | 1851148 | 用于扩增核酸序列 |
| 培养皿 | n/a | n/a | 用于培养线虫 |
| pGEM-T Easy载体 | Promega公司 | A1360 | 用于克隆 |
| 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） | n/a | n/a | 用于培养Botrytis cinerea |
| 含gDNA清除剂的Prime Script反转录试剂盒 | Takara Bio Inc. | RR047B | 用于合成cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | 用于设计PCR引物 |
| 引物：ppm-1-F/R | 青克生物技术有限公司 | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | 青克生物技术有限公司 | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| 实时荧光定量PCR仪 qTOWER 2.2 | Analytik Jena仪器（北京）有限公司 | 用于qPCR | |
| 摇床 | 上海智城分析仪器制造有限公司 | 用于浸泡线虫 | |
| 体视显微镜 | 重庆奥特光学仪器有限公司 | 1814120 | 用于观察线虫 |
| T7-GFP-F/R | 青克生物技术有限公司 | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7启动子 | 青克生物技术有限公司 | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 | Takara Bio Inc. | 9762 | 用于回收DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus） | Takara Bio Inc. | RR820A | 用于qPCR |
| 三氯乙烷 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 用于提取RNA | |
| TRIzol试剂 | 赛默飞世尔科技公司 | 15596026 | 总RNA提取试剂，用于提取RNA |
参考文献
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. <....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/63645-v
