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方法文章

RNA干扰技术在松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 中的应用

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DOI：

10.3791/63645

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2022年3月9日

 ,  ,  ,  , 
1College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry University

本文内容

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摘要

本文介绍了一种针对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的RNA干扰浸泡法，以促进基因功能研究。

摘要

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是全球最具破坏性的入侵物种之一，可导致松树萎蔫并最终死亡。尽管人们已认识到植物寄生性线虫（PPNs）在经济和环境方面的重要性，但迄今为止，尚无法利用传统的正向遗传学和转基因方法深入研究其基因功能。然而，作为一种反向遗传学技术，RNA干扰（RNAi）为研究线虫（包括B. xylophilus）的功能基因提供了有效途径。

本文概述了一种新的RNAi实验方案，用于 ppm-1 基因在 B. xylophilus，据报道在其他致病性线虫的发育与繁殖过程中发挥关键作用。进行RNA干扰（RNAi）时，通过聚合酶链式反应（PCR）将T7启动子连接至目标片段的5′端，并利用体外转录合成双链RNA（dsRNA） 体外 转录。随后，通过将线虫浸泡在含有合成神经刺激剂的dsRNA溶液中实现dsRNA递送。同步的幼虫 B. xylophilus （约20,000个个体）用dsRNA（0.8 µg/μL）溶于浸泡缓冲液中，在25 °C避光浸泡24 h。

将等量的线虫置于不含dsRNA的浸泡缓冲液中作为对照。同时，将另一份等量的线虫置于含有绿色荧光蛋白（gfp）基因dsRNA的浸泡缓冲液中作为对照。浸泡处理后，采用实时定量PCR检测目标转录本的表达水平。随后通过显微镜观察表型特征，并比较各组成虫体长，以验证RNA干扰的效果。本实验方案有助于推动研究深入理解松材线虫（B. xylophilus）及其他寄生性线虫基因的功能，进而为通过基因工程手段开发防控策略提供支持。

引言

植物寄生性线虫（PPNs）持续威胁着粮食安全和森林生态系统。它们每年造成约1000亿美元的经济损失1，其中最主要的问题来自根结线虫、胞囊线虫和松材线虫。松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是一种迁移性内寄生线虫，是松树萎蔫病的致病病原体2。该线虫已对全球松林造成严重危害3。根据Van Megen等人的术语分类4，B. xylophilus属于小杆目下的寄生滑刃科（Parasitaphelenchidae），位于进化分支10（clade 10），而大多数其他主要植物寄生线虫则属于分支12（clade 12）。

作为一种独立且近期进化的植物寄生线虫，B. xylophilus 是进行比较研究的理想模型。迄今为止，针对属于第12进化枝的根结线虫和胞囊线虫已开展了大量研究，这些线虫为专性、定居型的内寄生线虫，也是被研究最为深入的线虫类群之一。然而，在这一重要领域开展进一步研究面临一个主要挑战：寄生相关基因的功能研究已成为该领域的研究瓶颈。功能研究通常包括异位表达和基因敲低/敲除实验，但这些研究依赖于高效的线虫遗传转化技术。因此，植物寄生线虫的反向遗传学研究几乎完全依赖于RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默。

RNAi 是真核细胞中广泛存在的一种机制，通过引入双链 RNA（dsRNA）5 来沉默基因表达。迄今为止，在所有被研究的真核生物中均发现了由 dsRNA 诱导的转录后基因沉默机制，RNAi 技术作为功能基因组学研究及其他应用的工具，已在多种生物中迅速发展。自1998年在线虫 Caenorhabditis elegans 中发现 RNAi 机制以来6，RNAi 技术已成为鉴定线虫基因功能的有效方法，并被认为是一种有效防控致病性线虫的新途径7。

RNAi 技术操作简便——将幼虫浸泡在 dsRNA 溶液中即可实现；然而，该方法的效果和可重复性因线虫种类和靶基因的不同而存在显著差异8。已有研究利用长片段 dsRNA 作为诱导因子，对松材线虫（Meloidogyne incognita）RNAi 通路中 20 个基因的沉默效果进行了考察，结果呈现出多样化反应，包括部分基因表达水平升高或无明显变化9。这些结果表明，不同靶基因对 RNAi 沉默的响应可能存在差异，因此在将这些基因作为 RNAi 控制线虫的潜在靶标之前，必须对其适用性进行全面评估。然而，目前关于 B. xylophilus的发育生物学和生殖生物学的研究仍十分有限。

作为前期工作的延续10,11,12,13，我们在此描述了一种应用RNAi研究基因功能的实验方案 的 ppm-1 基因 B. xylophilus包括双链RNA的合成、合成神经刺激物浸泡以及定量聚合酶链式反应（qPCR）检测。通过该实验方法获得的知识将有助于深入理解基本生物系统，并为防治松材线虫病提供重要依据。

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方案

本研究经浙江农业大学动物实验委员会批准。 & 林业大学。该 B. xylophilus 分离株NXY61最初从患病个体中分离获得 马尾松 中国浙江省宁波市11.

1. 基因克隆

注意：有关本实验方案中所用引物的详细信息，请参见材料表。

  1. 收集线虫。
    1. 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，于25 °C条件下，将B. xylophilus菌株接种于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌丝上，培养3–5天。
    2. 采用贝尔曼漏斗法收集线虫14。
      1. 在漏斗下方连接一段带夹子的橡胶管，在漏斗口放置两层滤纸。将真菌培养物转移至漏斗中，并加入水浸没菌丝垫。静置2小时后，收集线虫。
  2. 使用总RNA提取试剂（参见材料表）11，按照以下步骤从线虫中提取总RNA。
    1. 在2 mL离心管中加入500 µL提取试剂和100 µL磁珠。吸取20 µL线虫样品转移至研磨器中，在9,000 × g条件下研磨30秒。孵育5分钟后，在12,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    2. 将上清液转移至新的离心管中。加入100 µL氯仿，盖紧管盖，反复倒置混匀数次。孵育3分钟后，在12,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    3. 将上清液转移至新的离心管中。加入250 µL异丙醇，剧烈涡旋振荡。在12,000 × g条件下离心10分钟。 
    4. 弃去上清液。加入500 µL 75%乙醇洗涤RNA，随后涡旋振荡样品。在12,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
    5. 将RNA沉淀在空气中干燥5分钟。
    6. 用30 µL无RNase的水重悬沉淀。
    7. 使用以下公式计算RNA浓度：A260 × 稀释倍数 × 40 = µg RNA/mL。计算A260/A280比值。
      ​注：比值约为2时视为纯度较高。
  3. 对高质量RNA进行反转录，获得cDNA模板。
    1. 设计并使用一对特异性引物ppm-1-F/R（参见材料表），扩增B. xylophilus中Bx-ppm-1基因的部分编码序列（GenBank登录号QTZ96795）。
    2. 按照标准克隆流程11，将ppm-1基因序列克隆至含有T7启动子的pGEM-Teasy载体中。
      1. 设置PCR反应体系如下：2 µL cDNA，25 µL 2x Ex Taq聚合酶预混液，每种引物各2 µL（10 pmol/L），无菌蒸馏水补足至终体积50 µL。
      2. 进行扩增程序：94 °C预变性5分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟；最后在72 °C延伸5分钟。
      3. 将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体中用于测序。

2. 双链RNA的合成

  1. 使用带有T7启动子序列的引物通过PCR制备用于dsRNA合成的DNA模板，将T7启动子序列添加至引物的5'端。
  2. 以含有ppm-1基因片段（894 bp）的质粒作为PCR模板，扩增出两端带有T7启动子的片段11。采用上述描述的PCR程序和体系。
  3. 使用体外转录试剂盒合成dsRNA11。
    1. 将冷冻的试剂在冰上解冻。
    2. 在离心管中加入2 µL 10x反应缓冲液、2 µL酶混合物和1 µg DNA。加入无核酸酶水，使总体积达到标准的20 µL反应体系。然后，将四种核糖核苷酸溶液（ATP、CTP、GTP和UTP）等体积混合，取8 µL该混合液加入离心管中。充分混匀后，在37 °C孵育4小时。
    3. 加入1 µL DNase，充分混匀，在37 °C孵育15分钟。
    4. 终止反应，加入30 µL无核酸酶水和30 µL LiCl沉淀液以沉淀RNA。充分混匀，于-20 °C过夜孵育。
    5. 在4 °C、12,000 × g条件下离心15分钟，弃去上清液。
    6. 加入1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。涡旋振荡样品后，在4 °C、12,000 × g条件下离心10分钟。
    7. 将RNA沉淀在空气中干燥3分钟。
    8. 将沉淀重悬于30 µL无RNase水中。
    9. 使用分光光度计分析dsRNA的质量。取1 µL dsRNA样品加至检测平台，设置波长为340 nm。在1.0%琼脂糖凝胶上对产物进行电泳观察。

3. 通过浸泡法进行RNAi

  1. 取4 µL 5倍浓缩浸泡缓冲液（含0.05%明胶、5.5 mM KH2PO4、2.1 mM NaCl、4.7 mM NH4Cl、3 mM 亚精胺），与dsRNA及ddH2O混合，总体积为20 µL，最终RNA浓度为0.8 µg/μL。
  2. 获取J2期幼虫。
    1. 从真菌培养物中收集线虫，并转移至直径6 cm的玻璃培养皿中。向培养皿中加入10 mL水，确保线虫可自由游动。将线虫置于培养皿中30分钟，使卵充分附着于底部。
    2. 小心移除水和线虫，注意不要扰动已附着的卵。重复上述步骤，直至所有幼虫和成虫均被清除，仅保留卵在培养皿中。
    3. 将收集的卵置于黑暗条件下25 °C孵育24小时，以获得J2期幼虫。收集J2期幼虫，放入离心管中，并用ddH2O清洗三次，用于后续RNAi实验15。
    4. 将J2期幼虫转移至含有dsRNA溶液的2 mL离心管中，并加入间苯二酚溶液（用锡箔包裹后溶于水），使其终浓度为1.0%。将幼虫置于摇床上，于25 °C孵育24小时，同时以15 × g离心，确保幼虫有效吸收dsRNA。
    5. 将等量的线虫浸泡于不含dsRNA探针或含有GFP dsRNA探针的浸泡缓冲液中作为对照。使用GFP基因（gfp，M62653.1）作为非内源性对照，并利用基因特异性引物T7-GFP-F/R合成gfp的dsRNA。

4. qPCR 检测

  1. 用 ddH2O 清洗 J2 幼虫，包括目标基因干扰组、GFP 基因干扰组以及未处理的对照组。采用上述方法提取各组的总 RNA。
  2. 开始进行 qPCR。
    1. 使用所需软件设计 q-ppm-1-F/R 引物（参见材料表）。
    2. 配制 12 µL 的 qPCR 反应体系，包含 1 µL cDNA、6 µL 荧光预混液、每种引物各 0.4 µL（10 pmol/l）以及无菌蒸馏水。
    3. qPCR 程序设置如下：95 °C 预变性 2 min；随后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 10 s、55 °C 退火 30 s、72 °C 延伸 1 min。
    4. 使用 actb 基因（GenBank 登录号 EU100952）和 tbb-2 基因（GenBank 登录号 MT769316）， 或其他合适基因，作为内参基因，以评估 RNAi 后基因表达水平的变化15。
  3. 根据循环阈值（Ct 值）和溶解曲线，采用 2-ΔΔCt 法估算目标基因的相对表达水平，并验证干扰效率。
    1. 将每个样本的目标基因 Ct 值减去其内参基因 Ct 值，得到 ΔCt 值；再用对照组的 ΔCt 值减去干扰组的 ΔCt 值，得到 ΔΔCt 值。
      ​注意：若 ΔΔCt 值大于 0，表明干扰有效。

5. RNAi处理后评估线虫成虫的体长

  1. RNAi 处理后，将 J2 幼虫在 PDA 平板上的 B. cinerea 菌苔上于 25 °C 培养 60 小时至成虫阶段15。
  2. 使用贝尔曼漏斗法收集成虫（见步骤 1.1.2.1）14。
  3. 在显微镜下拍摄成虫线虫的图像，并使用 ImageJ 软件（或其他测量软件）测量其体长。
    1. 在 ImageJ 中选择 分析 | 设置比例尺 进行长度测量。若已知距离，请输入所绘制直线的长度值，并输入长度单位。
    2. 勾选 全局 复选框（将此标准应用于所有图片），然后点击 确定 ，在待测图像上用直线选择需测量的长度。
    3. 使用快捷命令 Ctrl+M（测量）显示结果，并将结果记录在 结果 窗口中。
  4. 对 50 条雄性与 50 条雌性线虫进行测量，用于统计分析12。
  5. 通过计算各样本的平均值和标准差来分析数据，并使用 Student's t 检验比较不同组样本间的平均值。

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结果

分析 ppm-1 表达 B. xylophilus RNAi 处理后
相对表达水平 ppm-1 基因的 B. xylophilus 分别用GFP dsRNA和目标基因dsRNA浸泡处理的样本值为0.92和0.52（该 ppm-1 ddH 的基因表达水平2O-处理对照组设定为1）（图1因此，外源性dsRNA对 ppm-1 表达 B. xylophilus；然而， ppm-1 dsRNA 可有效抑制目的基因的表达。

效应 ppm-1 生长和发育中的表达

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讨论

尽管松材线虫（B. xylophilus）的生活史和寄生环境与其他线虫不同，但针对这种植物病原体的分子致病机制研究仍十分有限。尽管CRISPR/Cas9基因组编辑技术在秀丽隐杆线虫（C. elegans）及其他线虫中的应用已取得显著进展，但截至目前，仅有关于RNAi技术在松材线虫（B. xylophilus）中应用的报道17。RNAi是研究线虫基因功能最强大的工具之一，已广泛应用于松材线虫（B. xylophilus）的基因功能解析、信号转导通路研究以及基因治疗等领域18,19,20。与无脊椎动物模型中常用的基因敲除方法相比，RNAi介导的靶基因表达下调能够实现对基因功能的快速评估。

进行RNAi有三种方法 秀丽隐杆线虫注射6...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（31870637，31200487）资助，并由浙江省重点研发计划（2019C02024，LGN22C160004）联合资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
贝尔曼漏斗n/an/a用于分离线虫
Beacon Designer 7.9上海康昱盛信息科技有限公司n/a用于设计qPCR引物
Botrytis cinerean/an/a作为线虫的食物
Bursaphelenchus xylophilusn/an/a其编号为NXY61，最初从中国浙江省宁波市患病的
马尾松中分离获得。
恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司H1703544用于培养线虫
电泳装置Bio-Rad Laboratories1704466用于实现电泳分析
75%乙醇国药集团化学试剂有限公司80176961用于提取RNA
Ex Taq聚合酶预混液Takara Bio Inc.RR030A用于PCR
Ex Taq聚合酶预混液Takara Bio Inc.RR390A用于PCR
凝胶成像系统杭州朗基科学仪器有限公司LG2020用于使核酸条带可视化
GraphPad Prism 8GraphPad Prismn/a用于数据分析和绘图
高速离心机杭州艾本森仪器有限公司AS0813000用于离心
高通量组织研磨仪Bertin用于提取RNA
ImageJ软件美国国立卫生研究院n/a用于测量虫体长度
异丙醇上海阿拉丁生化科技股份有限公司L1909022用于提取RNA
Leica DM4B显微镜徕卡显微系统公司用于观察线虫
磁珠奥然科技有限公司150010C用于提取RNA
MEGAscript T7高产转录试剂盒赛默飞世尔科技公司AM1333用于体外合成dsRNA
NanoDrop ND-2000分光光度计赛默飞世尔科技公司NanoDrop 2000/2000C用于分析dsRNA的质量
PCR扩增仪Bio-Rad生命医学产品有限公司1851148用于扩增核酸序列
培养皿n/an/a用于培养线虫
pGEM-T Easy载体Promega公司A1360用于克隆
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）n/an/a用于培养Botrytis cinerea
含gDNA清除剂的Prime Script反转录试剂盒Takara Bio Inc.RR047B用于合成cDNA
Primer Premier 5.0PREMIER Biosoftn/a用于设计PCR引物
引物：ppm-1-F/R青克生物技术有限公司n/aF: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R青克生物技术有限公司n/aF: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
实时荧光定量PCR仪 qTOWER 2.2 Analytik Jena仪器（北京）有限公司用于qPCR
摇床上海智城分析仪器制造有限公司用于浸泡线虫
体视显微镜重庆奥特光学仪器有限公司1814120用于观察线虫
T7-GFP-F/R青克生物技术有限公司n/aF: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA
GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG
TTACAAACTCAAGAAGG-3'
 T7启动子青克生物技术有限公司n/aTAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Takara Bio Inc.9762用于回收DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）Takara Bio Inc.RR820A用于qPCR
三氯乙烷上海凌峰化学试剂有限公司用于提取RNA
TRIzol试剂赛默飞世尔科技公司15596026总RNA提取试剂，用于提取RNA

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勘误


Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/63645-v

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基因功能分析双链RNA贝尔曼漏斗体外转录定量PCR体型表型基因表达分析
RNA干扰技术在松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 中的应用
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