方法文章

基于深度学习虚拟染色的高速紫外光声显微镜用于组织学成像

4.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63649

⸱

2022年4月28日

 ,  ,  ,  , 
1Translational and Advanced Bioimaging Laboratory, Department of Chemical and Biological Engineering, Hong Kong University of Science and Technology

本文内容

摘要

展示了一种高速开放式顶面紫外光声显微镜，该显微镜可在术中提供组织学图像，用于手术切缘分析，内容包括系统配置、光路准直、样品制备及实验操作流程。

摘要

手术切缘分析（SMA）是肿瘤切除手术中确认癌组织完全切除的关键步骤，需要术中诊断工具以避免因切缘阳性而重复手术。近年来，利用DNA/RNA在266 nm波长下具有高本征光吸收的特性，紫外光声显微镜（UV-PAM）被开发用于实现无需标记的高分辨率组织学成像，展现出作为SMA术中检测工具的巨大潜力。为推动UV-PAM在SMA中的应用，本文介绍了一种高速、开放式顶盖的UV-PAM系统，其操作方式类似于传统的光学显微镜。该UV-PAM系统具备1.2 µm的高横向分辨率，并通过单轴振镜扫描实现了55 kHz的A线成像速度。此外，为确保病理医师无需额外培训即可直观解读UV-PAM图像，采用深度学习算法对原始灰度UV-PAM图像进行虚拟染色，以模拟标准的苏木精-伊红染色图像，从而实现无需培训的组织学分析。通过对小鼠脑切片进行成像，验证了该开放式顶盖UV-PAM系统的高性能，展示了其在SMA应用中的广阔前景。

引言

手术切缘分析（SMA）是一种通过显微镜检查组织标本的关键步骤，用于确定在切除手术中是否已将患者体内的所有癌细胞完全清除1。因此，能够快速提供组织学图像的显微镜对于SMA至关重要，可避免因癌细胞未完全切除而导致的重复手术。然而，目前基于明场光学显微镜的金标准方法需要将切除的组织用福尔马林固定、石蜡包埋、切成薄片（4–7 µm），并在成像前进行苏木精和伊红（H&E）染色，该过程耗时较长（3–7天）且劳动密集2,3。冷冻切片是一种快速替代方案，通过快速冷冻、切片和染色组织，可在20–30分钟内获得组织学图像4。然而，其组织学特征常发生畸变，且需要熟练的技术培训，限制了该技术在多种器官类型中的应用5。

已开发出一些光学显微技术，可在无需或仅需少量组织处理步骤的情况下为术中快速评估（SMA）提供细胞水平的图像。然而，这些技术各自存在不同的问题。例如，光学相干断层扫描6和共焦反射显微镜7由于其固有的散射对比度较低，特异性较差。尽管紫外表面激发显微镜8和光片显微镜9能够为SMA提供高分辨率和高对比度的图像，但其染色过程通常具有毒性和挥发性，无法在手术室内进行，从而延长了检测周转时间。多光子显微镜10和受激拉曼显微镜11可为SMA提供丰富的信息。然而，产生非线性效应所需的超快激光器成本高昂，限制了这些技术的广泛应用。

近年来，利用内源性光学吸收特性，无标记紫外光声显微成像技术（UV-PAM）已被开发用于获取高分辨率的组织学图像12在紫外光声显微镜（UV-PAM）中，激发紫外光（例如 266 nm）的光子能量首先被细胞核中的 DNA/RNA 吸收13 然后转化为热能，通过热弹性膨胀诱导产生声波发射14通过检测生成的声波，可以获得细胞核的二维（2D）紫外光声显微成像（UV-PAM）图像 通过 声学信号的最大振幅投影，为SMA提供组织学信息。为了推动UV-PAM的临床应用，基于振镜扫描的高速UV-PAM已被开发，可在18分钟内获取脑组织活检样本（5 mm × 5 mm）的组织学图像，在时间敏感的应用中展现出巨大潜力15为进一步验证紫外光声显微镜（UV-PAM）用于厚组织成像的可行性，提出了一种采用防水单轴微机电系统扫描器的反射式UV-PAM系统，成功实现了对人体结肠和肝脏组织的术中组织病理学检查。16由于原始的紫外光声显微成像（UV-PAM）图像为灰度图像，而金标准的H&E染色图像呈粉红色和紫色，病理学家难以直接解读紫外光声显微镜（UV-PAM）图像。为解决这一问题，提出了一种深度学习算法，可将灰度UV-PAM图像转换为虚拟H&近实时的E染色图像，使病理学家无需额外培训即可理解这些图像17.

本研究报道了一种高速开放式顶面紫外光声显微镜（UV-PAM）系统，其操作方式类似于传统的光学显微镜，可同时提供原始的灰度组织学图像以及由深度学习算法辅助生成的虚拟染色图像。利用该UV-PAM系统对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的小鼠脑切片进行成像，结果表明，本方法获得的虚拟染色UV-PAM图像与标准的苏木精-伊红（H&E）染色图像具有高度相似性，展示了其在无标记组织病理学分析（SMA）应用中的潜力。

方案

本研究中进行的所有动物实验均经香港科技大学动物伦理委员会批准。

1. 开放式紫外光声显微镜系统（图1）

  1. 光学照明
    1. 使用调Q二极管泵浦固体激光器（266 nm波长）作为激发光源。
    2. 使用两个凸透镜扩束激光，并在第一个凸透镜的焦点附近放置一个小孔，以实现空间滤波。
    3. 使用一维振镜（1D GM）将激光束向上反射。
    4. 使用物镜将激光束聚焦，并使其穿过环形超声换能器（UT）的中心，然后紧密聚焦于样品上。
  2. 超声检测
    1. 使用环形聚焦超声换能器（UT）检测超声波。UT有效区域的内径和外径分别为3 mm和6 mm；焦距：6.3 mm；中心频率：40 MHz；-6 dB带宽：84%。
    2. 将UT固定在一个自制的水箱中，水箱底部设有光学透明窗口，并覆盖一层薄石英盖玻片以允许紫外光通过。确保UT的有效区域朝上。将水箱连接至二维手动平台，以控制UT的横向位置。
    3. 打开紫外激光器，调节UT的位置，使激光束从UT中心穿过。关闭紫外激光器，然后向水箱中注入去离子水，使UT完全浸没。
    4. 将UT的输出连接至两个放大器（总增益 = 56 dB），并将第二个放大器的输出连接至数据采集卡（DAQ）。
  3. 将样品 holder 安装在连接至xy电动平台的z轴手动平台上。样品 holder 上有一个通孔，允许紫外光通过。在通孔周围粘贴四段双面胶带。
  4. 系统校准
    1. 将黑色胶带贴在载玻片上，并将载玻片覆盖在样品 holder 的通孔上，使黑色胶带朝下。按压载玻片以确保其牢固固定在样品 holder 上。然后降低样品 holder，使载玻片浸入水中。
    2. 断开环形UT与放大器的连接，将UT连接至脉冲发生器/接收器，并将脉冲发生器/接收器的输出连接至示波器。将脉冲发生器/接收器设置为脉冲回波模式。将脉冲幅度和增益分别设置为6和20 dB。
      1. 启动脉冲发生器/接收器，调节样品 holder 的z轴位置，找到超声信号最强的声学焦平面位置。
    3. 将脉冲发生器/接收器切换至透射模式，并将增益设为60 dB。启用激光输出，调节物镜的z轴位置，使示波器测得的光声信号最大化。
    4. 调节环形UT的横向位置，使产生的光声信号对称且幅值最大，这表明光学焦点与声学焦点在横向平面上已共轴对齐。然后调节样品 holder 的z轴位置，使光声信号最大化。
    5. 重复步骤1.4.3和1.4.4，以优化光声信号的对称性和幅值。当光声信号优化后，在示波器上记录时间延迟（即光声波到达UT所需的时间）。
    6. 移动样品 holder 以对黑色胶带的不同位置成像。调节样品 holder 的平整度，使从黑色胶带各位置产生的光声信号具有与步骤1.4.5中测得的相同时间延迟。
    7. 关闭激光器，并将UT重新连接至两个放大器。

2. 样品制备

  1. 小鼠脑组织石蜡包埋切片
    1. 使用过量麻醉剂处死小鼠，随后按照参考文献18中描述的方案取小鼠脑组织。
    2. 将取出的脑组织置于10%中性缓冲福尔马林中固定24小时。
    3. 按照参考文献19所述方法，使用梯度乙醇脱水、二甲苯透明，并用石蜡包埋固定后的脑组织。
      注意：在通风橱中处理样品。
    4. 使用切片机将包埋的脑组织切成薄片（厚度为5 µm），并将切片置于石英载玻片上。在60 °C烘箱中干燥1小时。
    5. 使用透明剂（见材料表）对切片进行脱蜡处理，以去除石蜡，避免因石蜡在紫外激发下具有强吸收而产生高背景信号。
      注意：在通风橱中处理样品。
  2. 新鲜小鼠脑组织切片
    1. 使用过量麻醉剂处死小鼠，随后按照参考文献18中所述方案取小鼠脑组织。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗小鼠脑组织以去除血液。
    3. 手动切割脑组织样本成切片（厚度约5 mm），然后用PBS清洗切片，以去除横截面上的血液。

3. 实验步骤

  1. 样本放置
    1. 准备一个带有紫外透明膜（聚乙烯， ∼10 µ厚度为 m）。在膜上加一滴水，然后将生物样本放置于样本槽中以覆盖水滴。对于 FFPE 切片样本，使用胶带将玻片固定在膜上。
    2. 将装有样本的样本槽放置在样本架上，确保覆盖样本架上的空孔。
  2. 将紫外激光器设置为外触发模式。使用我们实验室自主开发的LabVIEW程序（参见 材料表），设置扫描参数如下。
    1. 将激光重复频率设置为 55 kHz；设置 信号类型GM 驱动器的 e 端 三角形 以及驱动电压 范围 至 0.018 V（代表 ±0.018 V；比例系数：1 V/°）。设置 GMnum 至22和 dy 至2，以便每22次激光触发后，检流计镜（GM）完成四分之一的扫描周期，y轴电机移动0.3125的步长 µm. 设置 dx 至192，以便当y轴电机到达预设位置（例如5 mm）时，x轴电机移动30的步长 µm.
      注意：最小增量步长设置为 0.15625 µx轴和y轴电机的dy均为2时，步长等于0.15625 × 2 = 0.3125 μm。 µ当 dx = 192 时，步长等于 0.15625 × 192 = 30 µm. 扫描整个 5 x 5 mm 区域2，x轴电机会移动5000 µm /30 µm = 167 次，意味着将拼接 167 幅子图像以获得完整图像。参见 图2 用于紫外光声显微系统扫描轨迹。
  3. 通过设置 x 轴和 y 轴电机的移动步数，在小范围内开始试扫描xn = 10 和 yn = 1000）。调节z轴手动载物台，将样本置于焦平面以获得最大的光声信号。
  4. 将 x 轴和 y 轴电机移动至所需的起始位置，通过设置 xn 和 yn 数值，然后启动图像采集程序（参见 材料清单).
  5. 图像采集完成后，关闭激光器，取下样品架，并妥善保存生物样本。
  6. 对于新鲜生物组织，将样本保存在10%中性缓冲甲醛溶液中。
  7. 对于FFPE小鼠脑切片，使用H&E 按照参考文献中所述方案进行20 以获得相应的H&E染色图像
  8. 使用采集到的光声信号，通过实验室自建的图像处理算法重建最大振幅投影图像（参见 材料清单).

结果

图1展示了高速紫外光声显微成像（UV-PAM）系统的示意图。在该装置中，光学激发和超声检测光路位于样品的同一侧且处于样品下方，构成反射模式和开放式系统。因此，该系统操作简便，适用于厚样品的成像。

图2 显示了UV-PAM系统在成像过程中的扫描轨迹。首先使用散点插值算法生成每个区域的子图像（例如，5 mm × 30 µm 区域），然后通过自定义图像处理算法将所有子图像拼接，获得完整的图像（例如，5 mm × 5 mm 区域）（参见材料表）。

图 3A 和 图3B 显示 UV-PAM 和 H&E 分别为小鼠脑组织 FFPE 切片的图像，两者的视场均为 5 × 5 mm2图像处理算法可从 Github 获取 通过 提供的链接中的 材料清单图像采集时间少于18分钟。 图 3C-F 显示标记区域的放大图像 图3A，其中单个细胞核可以被清晰分辨。更重要的是，可以在标准H&E染色图像（图3G-J），表明当前系统在细胞成像方面具有高精度。将灰度紫外光声显微成像图像转换为虚拟H&E染色图像，一种深度学习算法17 （参见 材料列表) 被应用，生成一幅8000 x 8000像素的图像所需时间将少于30秒。相应的放大图像如图所示 图3K-N. 虚拟染色的紫外光声显微成像（UV-PAM）图像提供的结构信息几乎与苏木精-&E染色图像，显示出当前紫外光声显微成像系统在临床转化方面的潜力。

紫外激光、样品架、超声换能器和数据采集的光子成像系统示意图。
图1：高速开放式顶面紫外光声显微成像（UV-PAM）系统的示意图。(A) 系统配置。(B) 安装在双轴手动平台上的样品架及水箱的照片。(C) 固定在水箱中的环形超声换能器以及覆盖样品架孔洞的样品池的照片。(D) 放置于样品架上的带有膜和样品的样品池照片。UV：紫外光；DAQ：数据采集卡；GM：检流计镜。 请点击此处查看该图的放大版本。

x-y 图上的螺旋弹簧阵列；示意图展示空间周期性；标有 30μm 单位。
图 2：紫外光声显微镜（UV-PAM）系统在成像过程中的扫描轨迹。请点击此处查看该图的放大版本。

UV-PAM 与 H&E 脑组织对比；示意图展示通过虚拟染色进行的组织学分析。
图3：基于深度学习虚拟染色的紫外光声显微成像实验结果。A) 小鼠脑组织FFPE切片的UV-PAM图像。B标准 H&同一切片的E染色图像。比例尺：1 mm。（C-F标记区域的放大图像 A. (G-J) 对应的 H&标记区域的E染色图像 B. (K-N) 使用深度学习算法获得的虚拟染色图像。比例尺： 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

总之，已展示一种用于组织学成像的高速开放式顶置紫外光声显微成像（UV-PAM）系统。本文提供了有关系统配置、光学校准、样品制备和实验操作的详细说明。图像采集程序可从Github获取 通过 提供的链接 材料表该系统的横向分辨率约为1.2 µm，已在最近发表的研究中通过实验测定。21小鼠脑切片成像结果表明，本系统可在18分钟内获取5 × 5 mm区域的组织学图像2，这是脑活检的典型尺寸22尽管原始图像为灰度图像，但借助基于深度学习算法的数字虚拟染色工具，本系统可进一步近乎实时地提供虚拟染色图像，便于病理医生轻松解读。作为一种无标记成像技术，本紫外光声显微成像（UV-PAM）系统亦可为未经处理的新鲜组织样本提供组织学图像。更多示例（包括冰冻切片和新鲜组织样本）已在先前发表的研究中展示。17实验结果表明，当前基于深度学习辅助的紫外光声显微成像系统在脊髓性肌萎缩症（SMA）应用中具有很高的潜力。

紫外光声显微成像（UV-PAM）系统的一个优势在于其采用反射式设计，能够对较厚的组织进行成像。此外，这种开放式顶盖的UV-PAM系统允许将样品置于扫描窗口（即样品池的膜表面）上，其操作方式与传统光学显微镜相似。因此，相较于需要将样品夹在两层膜之间的其他系统，该系统具有更高的用户友好性11,14。此外，通过使用高重复频率紫外激光器与一维光机扫描器（1D GM）相结合，当前的UV-PAM系统在成像速度方面表现优异，且相较于采用多焦点激发的系统具有更高的成本效益23。

目前，成像速度主要受限于激光器的重复频率和光子预算。使用具有高重复频率和高脉冲能量的激光器，可进一步缩短成像时间。该系统的另一个局限性在于，只能通过寻找最大的光声信号来粗略地将样品调整至物镜的焦平面，而无法向用户显示实时图像以直观判断样品是否处于焦点位置。为了实现近实时图像的显示，可以采用二维光声扫描（2D GM）技术。

该方案中有两个关键步骤：（a）应优化光学焦点与声学焦点的共焦条件，以实现高检测灵敏度；（b）在x轴方向上，GM的扫描范围应小于环形UT的声学焦斑尺寸，以保持相似的高检测灵敏度（在当前设置中，扫描范围约为30 µm ±15 µm）。否则，当多个子图像拼接成完整图像时，边缘区域会出现明显的渐晕效应。

披露

T. T. W. W. 和 V. T. C. T. 对 PhoMedics Limited 公司拥有经济利益，但该公司未资助本项工作。作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者谨此感谢香港创新及科技委员会（ITS/036/19）提供的财务支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙醇Sigma AldrichPHR1373样本脱水
放大器Mini CircuitZFL-500LN-BNC+超声信号放大
控制器国家仪器公司NI myRIO系统控制器
数据采集卡Alazar TechnologiesATS9350超声信号采集
深度学习算法用于将灰度UV-PAM图像转换为虚拟H&E染色图像；https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
福尔马林Sigma AldrichR04586样本固定
H&E染色试剂盒Abcamab245880样本染色
Histo-Clear II国家诊断公司HS-202样本脱蜡
图像采集程序国家仪器公司LabVIEW基于LabVIEW开发的自建程序；https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
图像处理算法MathworksMATLAB基于MATLAB开发的自建算法；https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
运动平台支架ThorlabsKM200B调节样本至水平
薄膜GladCling wrap夹在样本槽中
显微镜物镜ThorlabsLMU- 5X-NUV物镜
电动平移台Physik InstrumenteL-509.10SD00扫描平台
一维振镜ThorlabsGVS411快速扫描镜
示波器RIGOL TechnologiesDS1102E超声信号读出
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP3813样本洗涤
针孔Edmund Optics#59–257空间滤波
平凸透镜ThorlabsLA-4600-UV聚焦透镜
平凸透镜ThorlabsLA-4663-UV准直透镜
脉冲发生/接收器ImaginantDPR300脉冲回波放大器
Q开关二极管泵浦固态激光器Bright SolutionsWEDGE HF 266 nm266 nm激光器
环形超声换能器南加州大学超声信号检测
样本支架实验室自制支撑样本槽
样本槽实验室自制承载生物样本
单轴Z向平移台ThorlabsPT1手动平台
双轴手动平台ThorlabsLX20手动平台
水槽实验室自制超声信号传输
二甲苯Sigma AldrichXX0060样本透明化

参考文献

  1. Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
  2. Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
  3. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  4. Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4(2006).
  5. Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
  6. Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607(2017).
  7. Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
  8. Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
  9. Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
  10. Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
  11. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027(2017).
  12. Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168(2017).
  13. Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
  14. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
  15. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401(2020).
  16. Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124(2021).
  17. Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308(2022).
  18. Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
  19. Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
  20. An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
  21. Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313(2022).
  22. Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
  23. Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).

重印与许可

标签

手术切缘分析深度学习成像小鼠脑切片光声信号苏木精-伊红染色开放式显微镜肿瘤切除
基于深度学习虚拟染色的高速紫外光声显微镜用于组织学成像
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。