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方法文章

一种研究惩罚诱导戒断后应激引发海洛因觅药复吸的实验流程

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DOI：

10.3791/63657

⸱

2022年3月23日

 ,  , 
1Department of Psychology, Center for Studies in Behavioral Neurobiology, Concordia University

本文内容

摘要

本文描述了一种在惩罚诱导的戒断后，通过强烈急性食物剥夺引发海洛因觅药行为复吸的实验方法。该研究成功采用了“寻求-获取”链式程序来建立惩罚诱导的海洛因自我给药戒断模型，随后在经历24小时食物剥夺应激后进行海洛因觅药测试。

摘要

惩罚诱导的戒断程序模拟了人类因吸毒带来的不良后果而主动采取的戒断行为。该模型已被用于多种滥用物质的实验研究，例如甲基苯丙胺、可卡因和酒精。然而，在海洛因训练的动物中，尚未证明可实现由惩罚诱导的戒断。此外，急性应激是人类和动物模型中复吸的关键诱因。先前研究表明，急性食物剥夺能强烈诱导已消退的可卡因和海洛因觅药行为的恢复。本文所述的实验程序可用于评估急性应激暴露对惩罚诱导戒断后海洛因觅药行为的影响。共8只大鼠被植入慢性静脉（i.v.）导管，并在“寻求-获取”链式程序下接受为期18天的海洛因（0.1 mg/kg/输注）自给药训练。完成“寻求”环节后，动物可接触“获取”杠杆，按压该杠杆将伴随一次海洛因输注。“寻求”杠杆按变量间隔60秒程序（VI60）设定强化，“获取”杠杆按固定比率1程序（FR1）设定强化。在自给药训练结束后，30%的“寻求”环节完成时不再伸出“获取”杠杆，而是施加轻度足底电击。足底电击强度从0.2 mA开始，每日递增0.1 mA，直至1.0 mA。在经历24小时食物剥夺（FD）或饱食状态下进行海洛因觅药测试。结果显示，在急性食物剥夺条件下，大鼠在惩罚诱导戒断后显著增加了海洛因觅药行为。

引言

复吸是药物滥用治疗中最棘手的问题1,2。然而，目前仅有少数几种药物疗法被批准用于帮助人类预防复吸3。北美当前面临的阿片类药物流行问题便是典型例证，迫切需要在阿片类药物复吸的动物模型中探索不同的研究方法。

急性应激已被证实是人类复吸的关键诱因之一4。一种常与药物成瘾相关的环境应激因素是食物剥夺。药物使用者常常选择将资源用于获取药物而非食物。热量摄入不足已被证明与更高的香烟5和酒精6复吸率相关。由于伦理和实际操作的限制，过去几十年中已开发出多种动物模型，以促进该领域的研究。在动物模型中，急性食物剥夺已被证实能有效恢复已消退的海洛因觅药行为7。目前，大多数复吸动物模型基于戒断程序，但这些程序要么不能代表人类真实的戒断情况（例如基于消退的模型），要么仅涵盖因监禁或住院治疗而被迫戒断的少数药物使用者（例如强制戒断模型）。药物使用者选择戒断的主要原因是与觅药和用药行为相关的负面后果8。惩罚诱导的戒断是一种模拟人类因自我施加戒断而面临觅药行为负面后果的动物模型。该模型将一种厌恶刺激（例如轻微足底电击）与觅药或用药行为关联，从而使动物自愿停止用药。另一种包含觅药负面后果的程序是用于研究药物戒断与复吸的电屏障冲突模型9。在此模型中，大鼠必须穿越一个电屏障以执行与药物自我给药相关的操作行为。该模型已成功用于证明对精神兴奋剂和阿片类药物的自愿戒断及复吸行为10,11。然而，在电屏障程序中，觅药行为始终伴随着厌恶事件，这与人类实际情况不同。此外，当动物在药物输注后再次穿越屏障返回安全区域时，用药行为本身可能与足底电击发生重叠。

惩罚性戒断已被用于其他滥用药物，如可卡因12、酒精13、甲基苯丙胺14、瑞芬太尼15，但从未应用于经海洛因训练的动物。该模型已被用于研究由药物启动14和药物相关线索16诱发的复吸，但尚未整合到应激诱导复吸的实验程序中。本文所述方法用于在雄性大鼠中演示在惩罚性戒断后由急性食物剥夺诱发的海洛因觅药复吸行为。

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方案

所有大鼠的处理均遵循加拿大动物护理委员会的指导原则。所有实验程序均已获得康考迪亚大学动物研究伦理委员会的批准。

1. 动物

  1. 获取体重为275-300 g（雄性）或225-250 g（雌性）的Long Evans大鼠。手术前将大鼠成对饲养于标准塑料笼中，垫料为玉米芯，并提供碎纸屑。
  2. 将大鼠置于倒置的光-暗循环环境中（上午9:30关灯，晚上9:30开灯）。
  3. 除食物剥夺试验期间外，自由供应食物和水。使用常规大鼠饲料（20.9%蛋白质、67.2%碳水化合物和11.8%脂肪）。

2. 静脉注射手术

  1. 按照 Sedki 等人 201317 中所述方法制备导管并进行静脉手术，但作如下修改：1）使用 2–2.5% 异氟烷作为麻醉剂；2）手术期间皮下注射青霉素的剂量改为 60 000 IU/大鼠；3）用于冲洗导管的肝素与庆大霉素混合液中，庆大霉素的剂量提高至 7.5 IU + 800 µg；每次冲洗体积为 0.2–0.3 mL。
  2. 术后（麻醉苏醒前）立即腹腔或皮下注射酮洛芬或卡洛芬（非甾体抗炎镇痛药，5 mg/kg），并在术后连续 3 天每日给药一次。术后恢复期前 2 天提供软化饲料，并根据需要提供保温措施以促进恢复。每日称量动物体重并进行观察，以检查是否出现体重骤降或其他健康异常迹象。

3. 行为学实验步骤

  1. 操作性条件反射箱：
    1. 按照 Sedki 等人 201317 中所述方法设置操作性条件反射箱。
  2. 适应期：
    1. 大鼠术后恢复后，将其安置于操作性训练箱中，并在开始任何实验方案前让动物适应箱内环境 24 小时。在整个实验过程中，始终将动物饲养在操作性条件反射箱内。
    2. 不要将大鼠连接至金属弹簧，也不启动任何实验方案（在适应日，提示灯、声音提示和杠杆均不可用）。
  3. 海洛因自给药：
    1. 将 5 向连接器连接至 Tygon 管和金属弹簧。
    2. 根据下述程序，每天进行 6 小时的海洛因自给药训练（每次输注剂量为 0.1 mg/kg）。
    3. 每日训练从反向光周期的暗期开始时启动（在代表性结果中约为上午 9:30），同时推出“寻求”杠杆（或在前两天使用“获取”杠杆；见下文），并关闭笼内照明灯。
    4. 仅提供“获取”杠杆的自给药训练，固定比率 1（FR1；持续 2 天）
      1. 编程设定每次试验以“获取”杠杆的推出开始。
      2. 当大鼠按压“获取”杠杆一次（FR1）后，收回该杠杆，开启杠杆上方的提示灯和声音提示，持续 20 秒的超时时间，关闭笼内照明灯，并给予一次海洛因输注（0.1 mg/kg，体积为 0.13 mL）。
      3. 设定 30 秒的试验间间隔，在此期间不呈现任何提示，笼内照明灯关闭，杠杆保持收回状态。下一次试验开始时，推出“获取”杠杆，并开启笼内照明灯。
    5. 在 FR1 条件下进行“寻求-获取”链式自给药训练（持续 5 天）
      1. 编程设定操作性训练系统仅推出“寻求”杠杆，并开启笼内照明灯以标志会话开始，此时“获取”杠杆处于收回状态。
      2. 当大鼠按压“寻求”杠杆一次（FR1）后，程序自动收回“寻求”杠杆并推出“获取”杠杆。
      3. 按压一次“获取”杠杆（FR1）后，收回该杠杆，并启动与步骤 3.3.4.2 相同的程序以及 30 秒的试验间间隔。
      4. 编程设定操作性训练系统在试验间间隔结束后推出“寻求”杠杆，并开启笼内照明灯以标志下一次试验的开始。
      5. 编程设定操作性训练系统：若大鼠在 10 分钟内未能完成“寻求-获取”链（即未按压“寻求”或“获取”杠杆），则启动试验间间隔，表示本次试验结束且失去给药机会。
    6. 在可变时间间隔（VI5、VI30 和 VI60）条件下进行“寻求-获取”链式自给药训练
      1. 执行第 3.3.5 节中的所有步骤，但将“寻求”杠杆的强化程序由 FR1 改为 5 秒的可变时间间隔（VI5）。在 VI5 程序下进行 3 天的自给药训练。
      2. 设置软件，使第一次按压“寻求”杠杆后启动 VI5 程序。对于 VI5 程序，软件从 0.1 秒、5 秒和 10 秒的时间列表中随机选择一个间隔，平均间隔为 5 秒。在选定的时间间隔结束后，第一次按压“寻求”杠杆将导致该杠杆收回并推出“获取”杠杆。
      3. 对于“获取”杠杆操作及试验结束的指令，继续执行步骤 3.3.4.2、3.3.5.4 和 3.3.5.5 。
      4. 随后，在“寻求”环节采用 VI30 程序训练大鼠 5 天，再在 VI60 程序下训练 3 天。
      5. 对于 VI30 程序，允许软件从 15 秒、30 秒和 45 秒的时间列表中随机选择，平均间隔为 30 秒；对于 VI60 程序，软件则从 45 秒、60 秒和 75 秒的时间列表中随机选择。
      6. 根据不同强化程序调整试验间间隔。在 FR1 和 VI5 阶段，试验间间隔设为 30 秒，而在 VI30 和 VI60 阶段逐步增加至 7 分钟。
  4. 惩罚诱导的戒断
    1. 惩罚阶段开始时，推出“寻求”杠杆并开启笼内照明灯。持续进行 8 天的惩罚实验，并定期监控，确保动物未出现异常疼痛或其他健康问题。
    2. 编程设定操作性训练系统：在完成 VI60 条件下的“寻求”环节后，收回“寻求”杠杆，关闭笼内照明灯，并在 30% 的已完成“寻求”链试验中施加轻度足底电击，而非推出“获取”杠杆；在其余 70% 的试验中，仍推出“获取”杠杆，如同正常自给药试验。
    3. 设定 7 分钟的试验间间隔，期间所有提示和笼内照明灯均关闭，之后推出“寻求”杠杆并开启笼内照明灯，标志下一次试验开始。
    4. 将足底电击强度设为 0.2 mA，并在每次惩罚日增加 0.1 mA，直至达到 1.0 mA。
    5. 当大鼠按压“获取”杠杆（在该杠杆可用的试验中）后，重复步骤 3.3.4.2 的操作：收回杠杆、给予海洛因输注并呈现提示，随后进入 7 分钟的试验间间隔。
    6. 下一次试验以推出“寻求”杠杆和开启笼内照明灯开始。
    7. 若大鼠在 10 分钟内未按压任何杠杆，则执行步骤 3.3.5.5。
  5. 急性食物剥夺（24 小时）
    1. 在惩罚诱导戒断的最后一天次日，根据体重以及自给药训练最后 3 天内“寻求”杠杆按压次数和输注次数的平均值，将大鼠分为两个匹配的组：食物剥夺组（FD）和饱食组（Sated）。
    2. 对于将接受食物剥夺诱导复吸测试的大鼠，于当天上午约 9:30 移除箱内的食槽；饱食组则保留食槽，使其可自由取食。两组均提供自由饮水，并进行监控，确保在食物剥夺期间未出现任何健康问题。
  6. 食物剥夺诱导的海洛因寻求测试
    1. 在 24 小时食物剥夺后的次日上午，进行为期 3 小时的海洛因寻求测试，采用 VI60 程序，试验间间隔为 7 分钟，不给予电击或海洛因输注。3 小时测试结束后，将食槽重新放回食物剥夺组大鼠的箱中。
    2. 在第一次海洛因寻求测试的次日上午，将第一次测试中为饱食状态的大鼠的食槽移除。对于此前曾经历食物剥夺的大鼠，在测试前和测试期间提供自由取食（即饱食状态）。
    3. 在下一天（即再次经历 24 小时食物剥夺后），按照步骤 3.6.1 再次进行一次 3 小时的海洛因寻求测试。
    4. 测试次日，使用二氧化碳安乐死装置（以每分钟填充箱体体积 30–70% 的速度通入 100% CO2）对大鼠实施安乐死。

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结果

雄性大鼠在训练期间随着强化程序的递增，对寻求杠杆的按压次数增加，并在训练期间保持稳定且一致的海洛因输注次数图1）。在惩罚期间，随着足底电击强度的增加，大鼠在8个惩罚日中按压寻求杠杆的次数和药物输注次数均减少。图2）。食物剥夺条件显著增加了惩罚诱导戒断后的海洛因觅药行为（喂养条件：F(1, 7) = 7.12，p = 0.03 d = 1.3; 图3A）。在不同喂养条件下，时间因素以及随时间变化的觅药行为均未表现出统计学上的显著效应（时间：F(2, 14) = 1.029，p = .38；时间 × 喂养条件：F(2, 14) = 1.347，p = .29； 图3B).

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讨论

本文有两个重要的实验验证。第一，利用海洛因的“寻求-摄取”链式行为范式，验证了由惩罚诱导的戒断效果。第二，证明了在惩罚诱导的戒断条件下，可以观察到由应激引发的复吸现象。这些验证具有重要意义，原因如下：（i）惩罚诱导的戒断程序更贴近人类的真实情况，因为它导致的是自愿性戒断，即并非由于药物寻求行为的消退，也不是因为被迫脱离药物使用环境18；（ii）本研究使用了一种生态学上具有相关性的应激源——急性食物剥夺应激，成功诱导出稳定的复吸反应。

在实施本方案时，需特别注意对大鼠进行适当的训练，因为“寻求-获取”程序比使用单一“主动”杠杆的常规持续性自我给药更为复杂。此外，惩罚阶段应根据所使用的大鼠品系进行仔细调整，以避免不必要的疼痛和“过度惩罚”，后者可能导致大鼠出现僵直反应，从而干扰复吸测试。需要注意的是，海洛因的镇痛作用可能会降低大鼠对足底电击惩罚的反应；然而，在本方案所述条件下，仍可观察到显著的由惩罚诱导的海洛因自我给药戒断行为。本方案的条件设置旨在尽可能延长海洛因输注与足底电击（在惩罚试验中）之间的时间间隔。为实现这一点，方案中设置了较长...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

这项工作得到了自然科学基金的资助 & 加拿大工程委员会发现计划（美国：RGPIN-2016-06694）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mg/mL 安乃近注射液 50 mL 瓶装MERIAL Canada, Inc.1938126抗炎药物
平衡臂Coulbourn InstrumentsH29-01
套管针（22 G，5个装）Plastics OneC313G-5up
环境连接板 & Linc 电缆Coulbourn InstrumentsH03-04
固定速度输注泵（3.3 转/分钟）Coulbourn InstrumentsA73-01-3.3
通用电气船用硅通用电气SE-1134
图形状态标记法 3Coulbourn InstrumentsGS3软件
Habitest 通用型 LincCoulbourn InstrumentsH02-08
盐酸海洛因美国北卡罗来纳州研究三角园国家药物滥用研究所
房间灯-大鼠Coulbourn InstrumentsH11-01R
异氟烷USP 99.9% 250 mL/瓶Fresenius Kabi Canada Ltd2237518
液体旋转接头，塑料，22 GLomir Biomedical, Inc.RSP1
大鼠测试笼Coulbourn InstrumentsH10-11R-TC操作性条件反射室
可伸缩杠杆-大鼠Coulbourn InstrumentsH23-17RA
硅胶管（内径 0.02，外径 0.037）Fisher Scientific（加拿大）1118915A
单一高亮度线索-大鼠Coulbourn InstrumentsH11-03R
消声衰减箱康考迪亚大学自制
不锈钢网格地板Coulbourn InstrumentsH10-11R-TC-SF
系统控制器 2Coulbourn Instruments系统对照 2
系统电源底座Coulbourn InstrumentsH01-01
2.9 kHz 音调模块Coulbourn InstrumentsH12-02R-2.9
Tygon 管（内径 0.02，外径 0.060）VWR63018-044

参考文献

  1. Jaffe, J. H. Drug addiction and drug abuse. Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics. Gilman, A. G., Rall, T. W., Nies, A. S., Taylor, P. , Pergamon Press. New York. 522-573 (1990).
  2. O'Brien, C. P., McLellan, A. T. Myths about the treatment of addiction. Lancet. 347, 237-240 (1996).
  3. Miczek, K. A., de Wit, H. Challenges for translational psychopharmacology research--some basic principles. Psychopharmacology (Berl). 199 (3), 291-301 (2008).
  4. Sinha, R. How does stress increase risk of drug abuse and relapse. Psychopharmacology. 158, 343-359 (2001).
  5. Cheskin, L. J., Hess, J. M., Henningfield, J., Gorelick, D. A. Calorie restriction increases cigarette use in adult smokers. Psychopharmacology. 179, 430-436 (2005).
  6. Krahn, D., Kurth, C., Demitrack, M., Drewnowski, A. The relationship of dieting severity and bulimic behaviors to alcohol and other drug use in young women. Journal of Substance Abuse. 4, 341-353 (1992).
  7. Shalev, U., Highfield, D., Yap, J., Shaham, Y. Stress and relapse to drug seeking in rats: studies on the generality of the effect. Psychopharmacology. 150, 337-346 (2000).
  8. Peck, J. A., Ranaldi, R. Drug abstinence: exploring animal models and behavioral treatment strategies. Psychopharmacology (Berl). 231 (10), 2045-2058 (2014).
  9. Cooper, A., Barnea-Ygael, N., Levy, D., Shaham, Y., Zangen, A. A conflict rat model of cue-induced relapse to cocaine seeking). Psychopharmacology (Berl). 194 (1), 117-125 (2007).
  10. Barnea-Ygael, N., Yadid, G., Yaka, R., Ben-Shahar, O., Zangen, A. Cue-induced reinstatement of cocaine seeking in the rat "conflict model": effect of prolonged home-cage confinement. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 875-883 (2012).
  11. Fredriksson, I., Applebey, S. V., Minier-Toribio, A., Shekara, A., Bossert, J. M., Shaham, Y. Effect of the dopamine stabilizer (-)-OSU6162 on potentiated incubation of opioid craving after electric barrier-induced voluntary abstinence. Neuropsychopharmacology. 45 (5), 770-779 (2020).
  12. Pelloux, Y., Everitt, B. J., Dickinson, A. Compulsive drug seeking by rats under punishment: effects of drug taking history. Psychopharmacology (Berl). 194 (1), 127-137 (2007).
  13. Marchant, N. J., Campbell, E. J., Kaganovsky, K. Punishment of alcohol-reinforced responding in alcohol preferring P rats reveals a bimodal population: Implications for models of compulsive drug seeking. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 87, Pt A 68-77 (2018).
  14. Krasnova, I. N., et al. Incubation of methamphetamine and palatable food craving after punishment-induced abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (8), 2008-2016 (2014).
  15. Panlilio, L. V., Thorndike, E. B., Schindler, C. W. Reinstatement of punishment-suppressed opioid self-administration in rats: an alternative model of relapse to drug abuse. Psychopharmacology (Berl). 168 (1-2), 229-235 (2003).
  16. Economidou, D., Pelloux, Y., Robbins, T. W., Dalley, J. W., Everitt, B. J. High impulsivity predicts relapse to cocaine-seeking after punishment-induced abstinence. Biological Psychiatry. 65 (10), 851-856 (2009).
  17. Sedki, F., D'Cunha, T., Shalev, U. A procedure to study the effect of prolonged food restriction on heroin seeking in abstinent rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50751(2013).
  18. Venniro, M., Caprioli, D., Shaham, Y. Animal models of drug relapse and craving: From drug priming-induced reinstatement to incubation of craving after voluntary abstinence. Progress in Brain Research. 224, 25-52 (2016).
  19. Deroche-Gamonet, V., Piazza, P. V. Psychobiology of cocaine addiction: Contribution of a multi-symptomatic animal model of loss of control. Neuropharmacology. 76, 437-449 (2014).
  20. Pelloux, Y., Everitt, B. J., Dickinson, A. Compulsive drug seeking by rats under punishment: effects of drug taking history. Psychopharmacology (Berl). 194 (1), 127-137 (2007).
  21. Epstein, D. H., Kowalczyk, W. J. Compulsive seekers: Our take. Two clinicians' perspective on a new animal model of addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 677-679 (2018).
  22. Hser, Y. I., Hoffman, V., Grella, C. E., Anglin, M. D. A 33-year follow-up of narcotics addicts. Archives of General Psychiatry. 58 (5), 503-508 (2001).
  23. Chen, B. T., et al. Rescuing cocaine-induced prefrontal cortex hypoactivity prevents compulsive cocaine seeking. Nature. 496 (7445), 359-362 (2013).

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