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方法文章

硝基还原酶/甲硝唑介导的消融及用于研究斑马鱼视网膜色素上皮再生的MATLAB平台（RpEGEN）

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DOI：

10.3791/63658

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2022年3月2日

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了利用转基因斑马鱼模型遗传消融视网膜色素上皮（RPE）的方法。文中详细阐述了对该方案的改进，以结合使用药理学化合物调控信号通路。此外，开发并介绍了基于色素沉着定量分析RPE再生的MATLAB平台，并对此进行了讨论。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）位于眼球后部，执行维持邻近视网膜和血管组织健康与完整性的关键功能。目前，哺乳动物RPE的修复能力有限，仅能应对微小损伤，这一局限性阻碍了相关研究的进展 体内 RPE再生过程。本文提供了一种详细的方法学，以促进对 体内 利用斑马鱼进行RPE修复 具有强大组织再生能力的脊椎动物模型。本方案描述了一种转基因硝基还原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）介导的损伤模型（rpe65anfsB-eGFP），在甲硝唑（MTZ）处理24小时后可特异性消融视网膜色素上皮（RPE）中央三分之二区域，并随后观察组织的再生恢复过程。本研究重点描述了在斑马鱼幼鱼中进行RPE消融的方法，并概述了评估药理化合物对RPE再生影响的实验方案。同时介绍了RpEGEN的构建与验证过程，该工具为一种基于色素沉着自动量化RPE再生程度的MATLAB脚本。除研究主动的RPE修复机制外，本实验体系还可拓展应用于RPE变性与损伤应答的研究，以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织的影响，涵盖多种细胞与分子过程。该斑马鱼模型在揭示驱动RPE再生及相关疾病机制的基因、分子网络与生物学过程方面具有重要意义，其长远目标是将所获知识应用于哺乳动物系统，并最终推动治疗策略的开发。

引言

本文所述方法详细介绍了一种利用幼年斑马鱼遗传性消融视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。RPE覆盖于眼球后部，位于神经视网膜的分层结构与构成脉络膜的血管层之间。RPE执行多种关键功能，包括提供营养支持、吸收光毒性光线以及维持视觉循环相关蛋白的稳定，这些功能对于维持邻近组织的健康与完整性至关重要1. 哺乳动物视网膜色素上皮（RPE）的损伤在病灶较小时可修复2；然而，较大损伤或进行性退行性疾病所造成的损害是不可逆的。在人类中，视网膜色素上皮（RPE）退行性疾病（例如， 年龄相关性黄斑变性（AMD）和Stargardt病）导致永久性视力丧失，且由于可用的治疗选择有限，患者生活质量下降 生活质量。哺乳动物RPE自我修复能力有限，导致RPE再生过程研究领域存在知识空白。鉴于斑马鱼在多种不同组织类型中均具有强大的再生能力，本方案旨在建立一种 体内 脊椎动物系统，以促进对内在再生视网膜色素上皮（RPE）的研究，并揭示驱动该再生反应的机制。采用此处所述的消融范式，经典Wnt信号通路3mTOR 通路4以及免疫相关反应5 已被确定为RPE再生的关键介质，可能具有功能上的重叠。

在此基因消融范式中，Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 斑马鱼在视网膜色素上皮增强子元件 rpe65a7 的调控下，表达一种源自细菌的硝基还原酶（NTR/nfsB）基因6，该基因与增强型绿色荧光蛋白（eGFP）融合。通过将前体药物甲硝唑（MTZ）加入饲养斑马鱼的系统水中，即可实现细胞消融。硝基还原酶在细胞内激活MTZ，导致表达NTR/nfsB的细胞发生DNA交联和凋亡8,9。该技术已广泛应用于斑马鱼中，用于消融视网膜10,11,12,13及其他组织的细胞8。上述各要素共同实现了可诱导性细胞消融技术（NTR/MTZ）的靶向表达(rpe65a)8,9，并提供了用于可视化观察的荧光标记（eGFP）。

其他有趣的 体内 也存在可用于研究视网膜色素上皮（RPE）再生潜能的模型14这些现象较为广泛，包括两栖动物视网膜切除术后视网膜色素上皮细胞（RPE）向视网膜细胞的转分化，其中因视网膜再生而丢失的RPE细胞被替代15,16损伤后RPE的修复 "超级愈合" MRL/MpJ 小鼠17以及在自发生RPE和视网膜变性的大鼠模型中对RPE增殖的外源性刺激18以及其他。 体外 模型，例如成人人类视网膜色素上皮干细胞（RPESCs）19 也已开发出来。这些模型均为研究与视网膜色素上皮再生相关的细胞过程的宝贵工具（例如， 增殖、分化等；然而，斑马鱼在视网膜色素上皮（RPE）消融后具有独特的内在修复能力。

尽管本方法的撰写重点在于理解驱动视网膜色素上皮（RPE）再生的机制，但Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)转基因品系及该遗传消融方案也可用于研究其他细胞过程，例如RPE凋亡、RPE变性以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织的影响。该消融方案还可进行修改以纳入药理学干预，这是一种便捷的初步策略，可用于筛选感兴趣的信号通路。例如，使用Wnt反应抑制剂-1（IWR-1）阻断经典Wnt通路已被证明会损害RPE再生203。本文中重复了该实验，以指导用户完成药理学干预实验，并作为概念验证，用于验证一种基于色素恢复程度量化RPE再生的MATLAB脚本（RpEGEN）。与转基因品系和消融方案类似，RpEGEN脚本具有可适应性，可用于量化RPE内的其他标志物或细胞过程。

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方案

本文所述所有方法均符合匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的规定。

1. 斑马鱼胚胎收集前的准备工作

  1. 将胚胎培养箱设置为 28.5°C。
  2. 制备黑色素生成抑制剂 N-苯硫脲（PTU）的 25 倍浓度储备液21,22。该储备液基于常用配方进行放大配制22，其中 1 倍浓度相当于 0.003% 质量体积比（% w/v）（例如， 将 0.003 g PTU 粉末溶于 100 mL 液体溶剂中）。
    1. 配制大量 25 倍浓度 PTU 储备液时，将 0.75 g PTU 粉末加入 1 L 纯化去离子水（以下简称 dH2O）中，在室温（约 25 °C）下使用搅拌子和搅拌板充分混合。置于 4°C 避光保存，可保存长达 3 个月。
      注意：PTU 难以溶于水溶液，可能需要长时间搅拌过夜。
      警告：PTU 具有危害性，操作时应避免摄入、吸入或与皮肤及眼睛接触。本方案中所述的 PTU 粉末及其所有液体衍生物可能需按照化学废弃物处理，具体取决于所在州及机构的规定。建议在使用前确认适当的 PTU 废弃物处理方法。
    2. 配制 1.5 倍浓度 PTU 工作液（以下简称 1.5x PTU）时，将 60 mL 25 倍浓度 PTU 储备液加入 940 mL 斑马鱼饲养系统用水（以下简称系统水）中。斑马鱼饲养所需的最佳水质参数已有描述23，水生设施应具备标准的水质监测程序。将 1.5x PTU 置于 28.5°C 避光保存 1–2 周。
      注意：本方案常规使用步骤 1.2 中所述的 PTU 浓度、溶剂及储存条件。作为预防措施，胚胎/幼鱼在 PTU 处理期间应每隔 1–2 天观察一次，以验证其有效性并确认持续脱色效果。若怀疑 PTU 溶解度或功效下降，应优化其溶解和/或储存条件。
  3. 通过将 0.05 g 亚甲蓝粉末加入 100 mL dH2O 中，配制 0.05% w/v 的亚甲蓝储备液（一种真菌生长抑制剂）。使用搅拌子和搅拌板充分混匀。置于 4°C 保存。
  4. 使用金刚石刻线笔切割玻璃巴斯德吸管的锥形末端，制备用于操作胚胎/幼鱼的移液管（例如，在培养皿之间转移胚胎/幼鱼、荧光筛选期间分离幼鱼、将安乐死后的幼鱼收集至微量离心管中用于固定等）。用金刚石笔在吸管周围绕刻一圈，然后轻轻拉断或折断末端，形成整齐断裂。
    注意：吸管口应光滑且足够宽大，以便轻松吸取仍处于卵膜内的胚胎而不造成剪切损伤。也可使用橡胶头吸管作为替代。制备好的吸管还可用于换水时移除液体（而非倾倒），以尽量减少胚胎/幼鱼的损失。
  5. 在 1 倍磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液（例如，将 10 mL 16% PFA 加入 4 mL 10 倍浓度 PBS 和 26 mL dH2O 中）。置于 4°C 避光保存，可保存长达 4 周。
    警告：多聚甲醛为危险化学品，应在化学通风橱中操作并妥善处置。操作时应采取防护措施，穿戴个人防护装备（PPE），防止摄入、吸入或与皮肤及眼睛接触。

2. 斑马鱼胚胎采集及基因消融前的饲养（受精后0-5天）

  1. 按照先前所述方法饲养成年斑马鱼3,4,5在收集胚胎的前一天下午/晚上，将成年斑马鱼分至繁殖缸中进行交配。
  2. 次日早晨（受精后0天（dpf）），将胚胎收集至直径10 cm的培养皿中，置于系统水中，并移除所有无活力或未受精的卵，这些卵表现为不透明和/或细胞质形态不规则以及卵裂失败。24.
    注：健康胚胎的正常卵裂和发育分期事件将如所述清晰可见25在整个实验过程中，培养皿应保持四分之三满（直径10 cm的培养皿约为30 mL）。
    1. 向每个培养皿中加入两滴0.05%（w/v）亚甲蓝，轻轻混匀，并将胚胎置于28.5°在本方案的其余部分中，C 保持不变。
  3. 受精后约6小时（hpf）4,5,26，用1.5x PTU（步骤1.2.2中配制的工作液）替换胚胎培养皿中的系统用水，并补充亚甲蓝。
    注意：必须在胚胎出现色素沉着之前加入PTU（即, 在24小时后（hpf）之前25 因为已形成色素的组织在加入PTU后不会脱色21需要注意的是，眼尺寸减小、眼部和颅面缺陷，以及某些信号通路的紊乱（例如, 甲状腺信号传导）已在PTU处理的斑马鱼中被报道27,28,29PTU 的发育毒性似乎取决于其添加的浓度和时机27,29如上文验证PTU功效（步骤1.2）所述，应密切监测PTU毒性的迹象；若怀疑存在毒性，应优化PTU的工作浓度和/或添加时间。
  4. 在受精后2-3天，使用新配制的蛋白酶溶液去除胚胎的卵膜。
    1. 将pronase溶于1.5x PTU中，通过涡旋振荡使其浓度达到2 mg/mL。
      警告：Pronase 以极细粉末形式包装，具有刺激性。应采取措施避免吸入和/或接触皮肤、眼睛等。
    2. 将已孵化的胚胎与未孵化的胚胎分开，仅对未孵化的胚胎进行蛋白酶处理。
    3. 用第2.4.1步配制的1.5x PTU替换为2 mg/mL的pronase溶液，加入未孵化的胚胎中，轻轻振荡（例如置于台式旋转摇床或手动 swirling），处理4-5分钟。
    4. 倒掉pronase溶液，立即用新鲜的1.5x PTU冲洗。用带有橡胶头的移液管轻轻吹打1.5x PTU冲洗液以冲洗胚胎。
    5. 重复进行第二次1.5倍PTU漂洗，以去除所有卵膜碎片，然后补充1.5倍PTU用于维持。
      注意：也可使用尖头镊子手动去除胚胎的卵膜。在此情况下，应在手动去膜后清除卵膜碎片，并补充1.5x PTU。
  5. 监测胚胎/幼鱼健康状况，并每隔1-2天补充1.5x PTU。胚胎/幼鱼在1.5x PTU中培养至5 dpf进行消融处理。
    注意：步骤 2.3 和 2.4 的重要性将在讨论部分进一步阐述。

3. 筛选斑马鱼幼鱼中的 rpe65a:nfsB-eGFP 及视网膜色素上皮的遗传性消融（受精后5-6天）

  1. 在5 dpf（消融日）当天配制新鲜的10 mM 甲硝唑（MTZ）溶液。该过程需2小时完成。
    1. 将MTZ粉末加入不含PTU的系统用水中，通过剧烈震荡（例如，每分钟250转）在37 °C下充分混匀1小时。
    2. 将10 mM MTZ溶液在室温下继续于台式旋转器/摇床中冷却1小时，并确保完全溶解后，再加入含有幼鱼的培养皿中。
      注：可在37 °C和室温孵育期间进行eGFP+幼鱼的荧光筛选与分离（步骤3.2）。
      警告：MTZ具有危害性，应避免摄入、吸入或与皮肤及眼睛接触。根据各州及机构规定，MTZ粉末及其所有液体制品可能需作为化学废弃物处理。建议在使用前确认正确的MTZ废弃物处置方法。
  2. 对斑马鱼幼鱼进行rpe65a:nfsB-eGFP转基因筛选。
    1. 使用0.168 g/L三卡因（MS-222）麻醉幼鱼，并在配备488 nm激发激光/滤光片的荧光体视显微镜下，将转基因（eGFP+）幼鱼（图1）与非转基因（eGFP-）幼鱼分离。
      注：应将三卡因加入1.5x PTU和/或药理化合物溶液中，以便在筛选eGFP时幼鱼始终浸没于处理液中。仅在筛选期间短暂孵育于三卡因中（例如， ≤10分钟，用于一个含50条幼鱼的10 cm培养皿）。
    2. 立即用移液器将完成筛选的幼鱼转移至不含三卡因的新鲜1.5x PTU培养皿中使其苏醒。
    3. 筛选完成后，将eGFP+幼鱼进一步分为两组，分别置于不同的培养皿中：一组接受MTZ处理（消融组/MTZ+），另一组作为未消融对照组（MTZ-）。
  3. 消融视网膜色素上皮。
    1. 从未消融对照组（MTZ-）培养皿中移除1.5x PTU，并加入不含PTU的新鲜系统用水。
    2. 从消融处理组（MTZ+）培养皿中移除1.5x PTU，并加入新配制的10 mM MTZ溶液（步骤3.1）。
    3. 在恰好24小时后（定义为损伤后第1天（dpi））移除10 mM MTZ溶液，并加入不含PTU的新鲜系统用水。同时更换MTZ-培养皿中的新鲜系统用水。此后在整个实验流程中，幼鱼不再接触PTU。
      注：在更换溶液过程中（步骤3.3.1和3.3.2中的1.5x PTU，以及步骤3.3.3中的10 mM MTZ），由于幼鱼处于活跃游动状态，可能难以通过移液或倾倒完全去除液体而不造成幼鱼损失。在此情况下，可追加不含PTU的系统用水清洗，以确保溶液更换彻底。

4. 基因消融后幼鱼的维持（受精后6天及以上）

  1. 每天检查幼鱼，并在不添加PTU的情况下补充系统用水，直至实施安乐死（步骤5.6）或送回斑马鱼饲养设施。
  2. 监测消融的成功率与范围 在体内 在2 dpi（7 dpf）时，使用体视显微镜的透射光照明进行观察图2).

5. 将药理学处理整合到斑马鱼视网膜色素上皮消融实验方案中

注意：此处以在4 dpf开始使用15 µM IWR-1或等体积的二甲基亚砜（DMSO）溶剂对照处理为例，说明如何测试RpEGEN，该方法此前已有报道3。不同药理化合物的浓度和时间线可能有所不同，关于剂量-反应验证、处理时长、筛选以及药理干预实验设计其他方面的建议详见讨论部分。如需进行图像分析，请执行步骤6和步骤7。

  1. 按照步骤2所述收集并培养胚胎。在受精后2天（2 dpf）去除胚胎的卵膜。
  2. 筛选 eGFP+ 4 日龄幼鱼，如步骤 3.2 所述。无需使用培养皿，将 eGFP+ 将幼鱼以每6孔板不超过10尾的密度接种至6孔板中，用于药物处理。为未进行MTZ处理（即未消融）的幼鱼指定单独的6孔板-）以及将要进行消融的幼鱼（MTZ+).
    注意：eGFP 信号在 4 dpf 时可见，但其强度较 5 dpf 时更弱。
  3. 预处理4 dpf eGFP+ 15尾幼鱼 µ在使用10 mM MTZ溶液进行基因消融前，精确给予M IWR-1或等体积DMSO载剂对照处理24小时。
    注意：药理学处理实验通常仅需极少量化合物。为避免称量微量 IWR-1 粉末，该药理学化合物以 25 mM 浓度的 DMSO 溶液形式购买，到货后分装为小体积，以避免反复冻融。
    1. 确定所需药理学处理及溶剂对照处理的体积，并相应地将1.5x PTU分装至锥形管中。建议每孔使用5 mL体积，适用于6孔板。
    2. 将 IWR-1 储存液加入 1.5x PTU 中，使其终浓度为 15 µM IWR-1（例如，3 µ每5 mL 1.5x PTU中加入25 mM IWR-1的L溶液。向1.5x PTU中加入等体积的DMSO储备液（例如，3 µL ≥ 99.7% DMSO 每 5 mL 1.5x PTU。此处将得到终浓度为 0.06% 体积/体积（% v/v）的 DMSO。涡旋充分混匀，并通过目视确认化合物完全溶解。
      警告：二甲基亚砜（DMSO）、IWR-1 及其他药理学化合物和溶剂可能需要根据各州及机构的规定作为化学废物处理。建议在使用前确认这些化合物（如适用）的危险等级及正确的废弃物处置方法。
    3. 从 eGFP 中去除 1.5x PTU+ 6孔板中的幼鱼，每孔加入5 mL新配制的0.06% v/v DMSO或15 µM IWR-1 处理，参见步骤 5.3.2。
  4. 在5 dpf时消融RPE。除了24小时预处理（步骤5.3）外，幼鱼在24小时遗传性消融期间（使用10 mM MTZ）以及消融后的恢复期间，直至固定前，需持续浸入药理学处理组及溶剂对照组中（例如， 从4至9天后受精（dpf）。
    1. 在进行基因消融（步骤 3.1）前 2 小时配制 10 mM MTZ 溶液。
    2. 确定未消融（MTZ）和消融组所需药物处理及溶剂对照处理的体积-）以及经甲硝唑处理的消融组（MTZ+）6孔板，并分装适量不含PTU的新鲜系统水（MTZ-）或 10 mM MTZ 溶液（MTZ+) 转移至锥形管中。这将产生四种处理条件：1) 0.06% v/v DMSO，MTZ-; 2) 15 µM IWR-1，MTZ-；3）0.06% v/v DMSO，MTZ+；以及 4）15 µM IWR-1，MTZ+.
    3. 将 IWR-1 和 DMSO 储存液分别加入相应的锥形管中，操作同步骤 5.3.2。涡旋振荡充分混匀，并通过目视确认化合物完全溶解。
    4. 去除 0.06% v/v DMSO 和 15 µM IWR-1 处理在 1.5x PTU 中（步骤 5.3.2）从指定的未消融（MTZ-）和经甲硝唑处理的消融组（MTZ+）6 孔板，并加入第 5.4.3 步配制的相应处理溶液。
    5. 去除 0.06% v/v DMSO 和 15 µ在恰好 24 小时后，将 M IWR-1 处理转移至含 10 mM MTZ 的溶液中，并更换为不含 PTU 的新鲜系统水进行处理。补充 0.06% v/v DMSO 和 15 µM IWR-1 处理未损伤（MTZ未处理）的样本，使用不含PTU的新鲜系统水-6孔板
  5. 按照步骤4所述进行幼鱼消融后的维持，并补充0.06% v/v DMSO或15 µ每日在不含PTU的系统水中进行M IWR-1处理。
  6. 在9 dpf（对于经MTZ处理的同龄对照幼鱼为4 dpi）时，将幼鱼浸入0.3 g/L三卡因溶液（致死剂量）中，并结合快速冷却进行安乐死（例如., 将培养皿置于冰上至少 20 分钟30检查幼鱼是否对触碰无反应，并在室温或4℃下用4% PFA固定3小时（步骤1.5）。 °C 过夜。
  7. 按照先前所述方法，对固定后的幼鱼组织进行处理，用于在共聚焦显微镜上获取z轴层扫图像5,31 以及在代表性结果部分。步骤6和7的分析至少需要获取细胞核标记物（如DAPI）和明场z轴层扫图像。

6. 在 FIJI（ImageJ）中对共聚焦显微镜 z 轴层扫图像进行预处理

  1. 使用 FIJI 导入和处理共聚焦显微镜 z 轴层扫图像32.
    1. 使用显微镜图像打开 Bio-Formats 导入选项 设定为 使用超堆栈查看 以及 颜色模式：灰度.
    2. 通过选择生成导入的显微镜图像的最大强度投影 图像 | 图像序列 | Z 轴投影. 在 Z投影 窗口，设置 起始切片 以及 停止切片 以包含该图像的所有切片。例如, 设置 起始切片：1 以及 终止切片：18 对于一个总共包含18个切片的z-stack。选择 投影类型：最大强度投影 并点击 好的.
    3. 将最大强度投影文件转换为8位图像（如果尚未转换），方法是选择 图像 | 类型 | 8位.
    4. 调整图像方向，使背侧朝上、远端（即晶状体）朝左 图像 | 变换 | 水平翻转 （对于最后一条命令，选择最适合该图像所需方向性的选项）。对于多通道图像，单击 是 在 流程堆栈？ 重新调整所有通道的窗口方向。
      注意：此步骤至关重要，但如果图像已处于背侧朝上、远端朝左的方向，则无需执行此步骤。参见 图3A- D 和 图4 用于处理时眼球方向正确的图像。
    5. 将8位最大强度投影另存为标记图像文件格式（TIF）文件 文件 | 另存为 | Tiff....
  2. 使用 FIJI 生成视网膜色素上皮感兴趣区域（ROI）
    1. 打开按步骤 6.1 所述生成的 8 位 TIF 图像。通过选择启动 ROI 管理器 分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器.
    2. 使用 图像 | 放大 并切换 DAPI 和明场通道，以确定 RPE 顶侧与外限制膜（OLM）尖端相邻的位置图3B，B"，D'，D"；蓝色箭头所示）。将此解剖标志作为感兴趣区域（ROI）的起始点。
    3. 创建RPE感兴趣区域（ROI） 多边形选择 工具（使用 FIJI 工具栏中的 DAPI 和明场图像通道以及缩放功能）图像 | 放大) 以确定RPE的顶端和基底边界。将ROI的背侧和腹侧末端（即 其中ROI从RPE的顶端向基底侧过渡）变为尖锐的点，而不是变钝或变圆图3B，B"，D'，D"；品红线）
      注意：使用 RpEGEN 进行终点检测时，创建尖端状 ROI 结束端是优化检测的关键步骤，相关内容将在讨论部分予以说明。
    4. 通过单击添加感兴趣区域 添加 在 ROI 管理器中。根据需要调整 ROI，然后单击 更新 在 ROI 管理器中。
    5. 选择并保存 ROI 文件 更多>> | 保存... 在 ROI 管理器中，配对的 ROI 与 TIF 图像文件应使用相同的文件名（例如，[文件名].tif 和 [文件名].roi）。
  3. 将每种条件下的8位TIF文件和ROI文件合并到一个单独的文件夹中。例如，该文件夹 DMSO_9dpf，将包含9 dpf未消融（MTZ）组所有匹配的TIF和ROI文件-0.06% v/v DMSO处理的幼体组

7. 使用 RpEGEN 脚本对 RPE 再生进行量化与可视化

  1. 安装并准备 RpEGEN 脚本。
    1. 从 GitHub 仓库（https://github.com/burchfisher/RpEGEN）点击下载最新版本的 RpEGEN 脚本 代码 | 下载 ZIP.
    2. 解压缩文件夹并将其放置在所需的 workspace 位置（例如，Desktop）。
    3. 打开 MATLAB。
    4. 导航至 RpEGEN 文件夹 当前文件夹 面板（通常位于左侧）。
    5. 右键单击 RpEGEN 文件夹并选择 添加到路径 | 所选文件夹及子文件夹这会将文件夹添加到 MATLAB 路径中，以便自动查找并运行该文件夹中的任何脚本。
    6. 双击 RpEGEN 文件夹中的 当前文件夹 窗格以显示所有子文件夹和 M 文件。
    7. 双击 RpEGEN.m 文件以在 编辑 面板
    8. 在 用户自定义变量 在 RpEGEN.m 文件的部分中，输入包含 ROI 文件（.roi）、图像文件（.tif）的文件夹路径，以及输出文件的保存位置。输入要导出的 .mat 文件的组名（例如， DMSO_9dpf、DMSO_4dpi 等）以及 TIF 图像堆栈中明场通道的位置（例如，如果明场是图像堆栈中的第三个通道，则为 3）。如果图像文件仅包含明场图像，则此项应设为 1。
  2. 运行 RpEGEN.m 脚本并验证结果。
    注意：运行 RpEGEN 需要用户在 MATLAB 许可中激活图像处理工具箱（Image Processing Toolbox）、曲线拟合工具箱（Curve Fitting Toolbox）和统计与机器学习工具箱（Statistics and Machine Learning Toolbox）。此外，还需使用免费的 ReadImageJROI 工具箱33 需要将FIJI的ROI导入MATLAB；但是，相关文件已包含在RpEGEN文件夹中，与其他无需激活的函数M文件一并提供。
    1. 单击以运行脚本 运行 按钮在 编辑 MATLAB 顶部的菜单
      注意：一旦启动，该 命令 窗口将提供详细输出，以指示脚本的执行进度。在保存包含提取数据的 MAT 文件后，将为每幅图像生成一个三面板图，并以 PDF 格式保存至输出目录。这些为质量控制（QC）图，用于确保所有步骤均正常运行，内容包括：1）叠加了感兴趣区域（ROI）的明场图像图4A）；2）以中心线为基准的感兴趣区域（ROI）及其对应的角距离（度）（图 4G）；以及3）以中心线中位强度值（0-255，8位色阶）定义的感兴趣区域（ROI）（图 4H). 等待QC PDF文件保存至输出文件夹且最后一个图像消失后，再进行下一步操作。
    2. 在任意 PDF 查看器中打开导出到输出文件夹的各个 PDF 文件，核实所有感兴趣区域（ROI）与明场图像匹配，中心线数值合理地近似于 ROI 的中心位置，且中位强度值已正确填充数据（即整个中心线上并非全部为相同数值）。
      注意：RpEGEN.m 保存在 MAT 文件中的每个变量的详细描述和结构可在 表 1.
  3. 运行 RpEGEN_PermPlot.m 脚本。
    注意：RpEGEN_PermPlot.m 脚本利用 RpEGEN.m 的输出，通过两组中位数的置换模拟运行统计比较，并提供使用免费的 GRAMM 工具箱复现本文图表的代码。34，该文件也已包含在 RpEGEN 文件夹中。
    1. 双击 RpEGEN_PermPlot.m 文件将在新窗口中打开 编辑 表。
    2. 在 第1节 - 用户定义变量 在 RpEGEN_PermPlot.m 文件中，输入运行 RpEGEN.m 后生成的包含 MAT 文件的输出文件夹的目录路径，并输入每个要加载的 MAT 文件名（例如，DMSO_4dpi.mat、IWR1_4dpi.mat）。
    3. 单击以运行此部分脚本 运行部分 按钮在 编辑 MATLAB 顶部的菜单
    4. 在 第2节，输入用于统计比较的两组名称 数据_A 以及 数据_B 变量（这些组将通过置换模拟计算中位数）。在 bin_sz 变量，输入用于对数据集的中位强度值进行积分的角度范围（默认为1度的区间）。
      注意： 重复 variable 表示用于构建概率分布的置换次数，可设置为任意数值（默认值为 20,000）。通常情况下，重复次数越高，统计结果越稳健，但会增加处理时间。
    5. 单击以运行此部分脚本 运行部分 按钮在 编辑 位于 MATLAB 顶部的菜单。此部分完成所需时间可能较长，具体取决于指定的重复次数，但会在命令窗口中持续提供状态更新。
    6. 运行 热图图示 以及 分组结果与 P 值 使用以下方法独立处理各部分 运行部分 按钮。在任何带有注释的章节中编辑数据变量 "请在下方输入需要翻译的内容。"这些图的 PDF 文件会自动保存，且均可在后期使用任意矢量图形软件轻松修改。
      注意：由此生成的图表中的 RpEGEN_PermPlot.m 文件为 临时的 并且可能需要根据每位用户的具体数据和可视化需求进行修改。然而，这些图表提供了坚实的基础，可借助 MATLAB 和 GRAMM 网站轻松实现个性化定制。

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结果

已知抑制经典Wnt信号通路会显著损害斑马鱼视网膜色素上皮（RPE）的再生能力，本研究采用遗传消融模型（rpe65a:nfsB-eGFP）和药理学干预方法（IWR-1）进行验证，相关方法在本方案中有详细描述3。本实验在此重复进行，旨在验证一种基于色素沉着的自动化定量斑马鱼RPE再生的方法。下文总结的结果涵盖了从受精当天（0 dpf）到利用RpEGEN进行RPE再生定量的全部实验步骤。

在幼年斑马鱼中实施视网膜色素上皮消融方案（结合药理学干预）
从三组不同的亲本（N = 3）收集的胚胎在约6 hpf时开始用1.5x PTU处理，并在1 dpf时通过肉眼确认视网膜色素上皮（RPE）和表层黑色素细胞中无色素沉着。胚胎在2 dpf时使用2 mg/mL蛋白酶进行酶法去壳（步骤2.4）。在4 dpf时，幼鱼使用三卡因（MS-222）麻醉，并利用荧光体视显微镜通过eGFP荧光进行筛选（步骤3.2和5.2）。eGFP+ 幼虫被转移至6孔板中（每孔10只幼虫），并分别用0....

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讨论

本方案描述了在幼龄斑马鱼中遗传性消融视网膜色素上皮（RPE）并研究其退变与再生机制的方法。该方案也已在成年斑马鱼中成功实施3，但表征程度相对有限，因此本文重点介绍幼鱼阶段的操作。本方案此部分的关键步骤（步骤1-4）包括：1）在黑色素生成开始前向胚胎中加入1.5x PTU；2）在2-3 dpf时对经PTU处理的胚胎进行脱膜；3）仔细筛选eGFP阳性个体；4）在使用MTZ进行遗传消融过程中精确控制换水时间。PTU可抑制黑色素合成21,22，在本RPE消融模型中被用于促进对rpe65a:nfsB-eGFP转基因表达的筛选，并通过色素组织的缺失及随后的恢复，分别实现对RPE退变与再生过程的表征3。由于PTU仅能抑制后续色素生成，而无法使已开始黑色素生成的组织脱色21，因此必须在色素形成开始前添加PTU。斑马鱼的色素生成起始于约24 hpf

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披露

L.L.L. 是美国专利 #9,458,428 的共同发明人，该专利描述了一种从人多能干细胞快速衍生视网膜色素上皮细胞的方法；此专利与本文内容无关。J.M.G. 和 G.B.F. 无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文所述工作由美国国立卫生研究院（RO1-EY29410 资助 J.M.G，以及 NIH 核心资助 P30-EY08098 资助眼科系）；UPMC 免疫移植 & 治疗中心（资助编号：L.L.L. 和 J.M.G.）；以及眼科研究 E. Ronald Salvitti 讲席（资助编号：J.M.G.）。额外支持来自眼科 Wiegand 奖学金（资助编号：L.L.L）、眼科 &匹兹堡耳科基金会以及纽约“防盲研究”组织提供的无限制资助。作者还要感谢Amanda Platt提供的技术支持，以及Hugh Hammer博士和水生动物饲养团队在动物护理方面给予的出色支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
实验材料/设备
2-(4-脒基苯基)-6-吲哚甲脒二盐酸盐（DAPI）Millipore SigmaD9542
6孔板Fisher Scientific07-200-83
锥形聚丙烯离心管Fisher Scientific05-539-13目录号对应50 mL离心管
金刚石尖刻划笔Fisher Scientific50-254-51由Electron Microscopy Sciences生产，类似该货号的产品亦可使用
二甲基亚砜（DMSO）≥99.7%Fisher ScientificBP231请查阅机构对化学废弃物处理的要求
胚胎培养箱（大型）Fisher Scientific3720A
胚胎培养箱（小型/台式）LabnetI5110A
荧光体视显微镜ZeissAxio Zoom.V16或类似设备，需配备488 nm激发激光/滤光片
玻璃巴斯德移液管Fisher Scientific13-678-4由Corning生产，非无菌
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462由Calbiochem生产；25 mM溶于DMSO；请查阅机构对化学废弃物处理的要求
亚甲蓝（粉末）Fisher ScientificBP117-100也可使用预先配制的水溶液
甲硝唑（MTZ）Millipore SigmaM3761请查阅机构对化学废弃物处理的要求
N-苯硫脲（PTU）Millipore SigmaP7629请查阅机构对化学废弃物处理的要求
16%（w/v）无甲醇甲醛Fisher ScientificAA433689M属于化学废弃物，需妥善处理
培养皿Fisher ScientificFB0875712直径10 cm
磷酸盐缓冲液（粉末包）Millipore SigmaP3813用于配制10× PBS储备液
蛋白酶K（Pronase）Millipore SigmaPRON-RO
摇床培养箱BenchmarkH2010用于在37摄氏度下孵育MTZ 1小时
体视显微镜LeicaS9i或类似设备，需具备透射光照明
学生型Dumont #5镊子Fine Science Tools91150-20尖端精细的镊子，用于手动去壳
台式旋转器/摇床ScilogexSK-D1807-E
移液管（带橡胶头）Millipore SigmaZ135003容量3.2 mL，非无菌
三卡因甲磺酸盐（MS-222）PentairTRS1, TRS2, TRS5也可从Fisher Scientific购买（货号NC0342409）
含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1200
软件材料
FIJI（Fiji is Just ImageJ）FIJI（Fiji is Just ImageJ）https://imagej.net/software/fiji/版本：2.0.0-rc-69/1.52p；构建号：269a0ad53f；所需插件：Bio-Formats
GRAMM示例与使用指南MathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.html运行RpEGEN所需工具箱：图像处理工具箱、曲线拟合工具箱、统计与机器学习工具箱
MATLAB支持MathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

参考文献

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RPE RpEGEN MATLAB RPE RPE Wnt
硝基还原酶/甲硝唑介导的消融及用于研究斑马鱼视网膜色素上皮再生的MATLAB平台（RpEGEN）
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