Method Article

用于蛋白质磷酸化定量的优化单分子下拉测定

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

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本方案描述了样品制备和数据分析，以使用改进的单分子下拉（SiMPull）测定来量化蛋白质磷酸化。

Abstract

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磷酸化是一种必要的翻译后修饰，可调节蛋白质功能并指导细胞信号传导结果。目前测量蛋白质磷酸化的方法不能保持单个蛋白质磷酸化的异质性。单分子下拉（SiMPull）测定是通过在玻璃盖玻片 上免疫沉淀 蛋白质然后进行单分子成像来研究大分子复合物的组成。目前的技术是对SiMPull的改编，可在单分子水平上对全长膜受体的磷酸化状态进行强有力的定量。以这种方式对数千个个体受体进行成像可以量化蛋白质磷酸化模式。本实验方案详细介绍了优化的SiMPull程序，从样品制备到成像。玻璃制备和抗体固定方案的优化进一步提高了数据质量。目前的方案为单分子数据分析提供了代码，该数据分析计算样品中磷酸化的受体的比例。虽然这项工作的重点是表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化，但该方案可以推广到其他膜受体和胞质信号分子。

Introduction

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膜相关信号传导通过配体诱导的膜受体激活和募集传播信号的下游辅助蛋白的组合进行调整。受体细胞质尾部中关键酪氨酸的磷酸化对于启动信号复合物或信号体1，2的形成至关重要。因此，生物学中的一个重要问题是如何创建和维护磷酸化模式以招募信号伙伴并决定细胞结果。这包括了解受体磷酸化的异质性，无论是在丰度上还是在特定的磷酸酪氨酸模式中，都可以通过决定信号体3，4，5，6，7的组成来提供操纵信号输出的方法。然而，目前询问蛋白质磷酸化的方法存在局限性。蛋白质印迹分析非常适合描述蛋白质磷酸化的趋势，但半定量8，并且不能提供有关系统异质性的信息，因为数千到数百万个受体被平均在一起。虽然蛋白质印迹允许使用磷酸特异性抗体对特定酪氨酸进行探查样品，但它们不能提供有关同一蛋白质内多位磷酸化模式的信息。定量磷酸化蛋白质组学报告了磷酸酪氨酸丰度，但检测多位磷酸化存在局限性，因为感兴趣的残基需要位于酶消化产生的相同肽（通常为7-35个氨基酸）内9<....

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Protocol

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1. 盖玻片准备

注意:对于此步骤，需要穿戴个人防护装备（PPE），其中包括双层丁腈手套，安全眼镜或面罩以及实验室外套。

  1. 进行食人鱼蚀刻以清除玻璃上的有机碎屑。
    注意:食人鱼溶液是一种强氧化剂，与有机材料接触时具有腐蚀性和高度反应性。与有机碎片的反应是放热的，具有潜在的爆炸性。因此，该过程必须在降低窗扇的化学通风橱中进行。需要Pyrex玻璃器皿来处理食人鱼溶液。
    1. 在化学通风橱内准备工作空间。将不重叠的盖玻片放在4 L玻璃烧杯（"反应"烧杯）的底部，并将反应烧杯放在加热的温板上。让玻璃器皿加热10分钟。将一个"废物"1 L玻璃烧杯与500 mL ddH2O放在反应烧杯的近端。
    2. 用玻璃血清移液管将49mL12N硫酸（H 2 SO4）缓慢加入反应烧杯中。在处理之前，在废烧杯中冲洗移液器。
    3. 用玻璃血清移液管滴加21mL 30%过氧化氢（H2 O 2）到反应烧杯中。将H2O2液滴均匀地分布在反应瓶的底部，以防止食人鱼蚀刻反应的局部淬火。在处理之前，在废烧杯中冲洗移液器。
      注意:始终将 H2O2 添加到 H2SO4 中，反之亦....

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Results

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图 1A显示了一幅描绘SiMPull过程的卡通。使用新链阿维丁作为生物素化抗EGFR抗体的锚点，从总蛋白裂解物中捕获EGFR-GFP，盖玻片被功能化。洗去未结合的蛋白质后，磷酸化的受体用抗磷酸酪氨酸（anti-PY）抗体15标记。 图1B 显示了疏水阵列的图像，其中可以制备多个样品并在同一盖玻片上成像。该样品架的一个优点是需要~10 μL的最小样品体积。盖玻片可以通过将其直接放在显微镜载物台上来成像。但是，使用盖玻片支架稳定盖玻片是有帮助的。 图1B 所示的盖玻片支架是使用3D打印机创建的，蓝图在 补充编码文件5中提供。疏水性油墨的自发荧光是找到样品焦平面的有用指南（图1C）。多通道原始图像的示例如图 1D 所示。原始绿色和远红色通道的叠加

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Discussion

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这里描述的方案经过优化，可以在单一蛋白质水平上定量测量受体磷酸化。对SiMPull方案进行了一些简单但重要的修改，提高了磷酸酪氨酸检测测量的可靠性，包括通过NaBH4 处理减少自发荧光和后固定样品以防止抗体解离。使用绿色通道掩模识别受体位置以计算与抗PY抗体的共定位，还可以通过消除抗体与细胞裂解物的非特异性结合中的潜在伪影来提高测量精度。利用双色成像来检测磷酸化受体的比例。在这种情况下，受体用GFP进行遗传标记，抗体直接用远红色染料标记。SiMPull方法适用于具有特定抗体的其他蛋白质靶标，包括细胞内蛋白质。此外，由于不需要变性条件，因此也可以捕获多苏布尼受体/复合物。然而，如果感兴趣的PTM位于蛋白质14的结构区域中，则可以掺入变性。最终，SiMPull可以很容易地扩展为包括同时标记单个受体上不同的磷酸酪氨酸，以量化多位磷酸化模式15。以这种方式询问全长，完整的受体不能通过其他标准方法实现，包括蛋白质印迹和磷酸化质谱。

除了SiMPull的优势外，还需要考虑一些限.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了美国国立卫生研究院R35GM126934，R01AI153617和R01CA248166的支持。EMB通过阿塞特-伊拉克开发区计划（NIH K12GM088021）和UNM MARC计划（NIH 2T34GM008751-20）提供支持。我们非常感谢使用新墨西哥大学综合癌症中心荧光显微镜共享资源，由NIH P30CA118100支持。我们要感谢安库尔·贾恩博士和哈太基吉普博士，他们最初对SiMPull的开发启发了这项工作。
ES-C现在地址:免疫动力学组，综合癌症免疫学实验室，癌症研究中心，国家癌症研究所，贝塞斯达

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 微量离心管MTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaClT50 缓冲液
100 mm 组织培养皿CELLTREAT229620食人鱼蚀刻玻璃/阵列的储存
15 mL 锥形管
16% 多聚甲醛水溶液溶液电子显微镜科学15710危险
50 mL 锥形管功能化玻璃储存/KOH 重复使用
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl裂解缓冲液组分
60 mm 组织培养皿康宁430166
8% 戊二醛水溶液电子显微镜科学16020有害
丙酮 （C3H6O）Millipore Sigma270725有害
Alexa Fluor 647 NHS 酯 ThermoFisher ScientificA-20006
无动物源重组人 EGFPeprotechAF-100-15
抗人 EGFR（外部域） –生物素Leinco Technologies， IncE101
抗 p-tyr 抗体 （PY99） Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
浴超声仪Branson1200
BCA 蛋白质检测试剂盒Pierce23227
生物素-PEGLaysan 生物素-PEG-SVA，MW 5,000
牛血清白蛋白Gold BiotechnologyA-420-1Tyrode 缓冲液成分
Buchner 漏斗
本生灯
氯化钙 （CaCl2）Millipore SigmaC4901Tyrode 缓冲液成分
细胞刮刀Bioworld30900017-1
锥形过滤瓶FisherScientificS15464
Coplin罐WHEATON900470
Countess II自动细胞计数器Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
盖玻片 24 x 60 #1.5电子显微镜科学63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEM沉箱实验室DML19-500
emCCD 相机Andor iXon
胎牛血清，OptimaBio-TechneS12450H热灭活
Fusion 360 软件Autodesk
Geneticin G418 硫酸盐沉箱实验室G030-5GM
冰醋酸 （CH3COOH）JT BakerJTB-9526-01危险
玻璃血清移液管
玻璃搅拌棒
葡萄糖 （D-（+）-葡萄糖）Millipore SigmaD9434Tyrode 缓冲液组分
终止磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物 （100X）Thermo Fisher Scientific78446裂解缓冲液组分
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode的缓冲成分
盐酸 （HCl）VWRBDH7204-1有害
过氧化氢 （H2O2） （3%）HX0645
过氧化氢 （H2O2） （30%）EMD MilliporeHX0635-2
冰
IGEPAL CA-630 （NP-40）Sigma AldrichI8896裂解缓冲液组件
ImmEdge 疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F 浸油蔡444960-0000-000
内部真空线
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-164
六水合物氯化镁 （MgCl2-6H2O）MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox， Parallel Computing Toolbox， and Statistics and Machine Learning 工具箱
甲醇 （CH3OH）IBIS ScientificMX0486-1有害
Milli-Q 水
Mix-n-Stain CF 染料抗体标记试剂盒Biotium92245建议的偶联试剂盒
mPEGLaysan BiomPEG-琥珀酰亚胺戊酸酯，MW 5,000
N-（2-氨基乙基）-3-氨基丙基三甲氧基硅烷UCT United ChemicalA0700危险
网格Miraloma Tech
Neutr亲和素 生物素结合蛋白Thermo Fisher Scientific31000
氮气（压缩气体）
NVIDIA GPU，带 CUDAhttps://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html Olympus
iX71 显微镜Olympus
Parafilm M 密封膜实验室仓库HS234526C
PBS pH 7.4沉箱实验室PBL06
PC-200 模拟热板康宁6795-200
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140-163
磷酸化 EGF 受体 （Tyr1068） （1H12） 小鼠单克隆抗体细胞信号传输技术2236BF
氯化钾 （KCl）Millipore Sigma529552Tyrode's缓冲成分
氢氧化钾（KOH）Millipore Sigma1050330500危险
优质PLA丝，直径1.75提升3DPMS：2035U/RAL：3028打印温度范围：205-235 °C
Pro2 3D 打印机Raise 3D
Pyrex 1 L 烧杯
PYREX 100 mL 储存瓶康宁1395-100CH3OH/C3H6O 重复使用
Pyrex 250 mL 烧杯
Pyrex 4 L 烧杯
四视图图像分流光度计QV2
型冷冻离心机EppendorfEP-5415R
RevCount 细胞计数仪，EVE 细胞计数载玻片VWR10027-446
Semrock 发射滤光片：蓝色 （445/45 nm）、绿色 （525/45 nm）、红色 （600/37 nm）、远红外 （685/40 nm）SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
血清移液器控制器
血清移液管
打击单分子分析套装https://github.com/LidkeLab/smite.git
碳酸氢钠 （NaHCO3）Sigma AldrichS6014有害
硼氢化钠 （NaBH4）Millipore Sigma452874Tyrode's 缓冲成分
氯化钠 （NaCl）Millipore SigmaS9625通过连续加热和 pH 循环活化
氢氧化钠VWRBDH3247-1
原钒酸钠 （Na3VO4）Millipore SigmaS6508有害
硫酸 （H2SO4）Millipore Sigma258105有害
TetraSpeck 微球Thermo Fisher ScientificT7279多荧光珠
Tris （Trizma） 碱Millipore SigmaT1503
台盼蓝染色剂，0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
胰蛋白酶-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120
品司 纳米的兼容性 毫米

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

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