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一种优化的单分子下拉检测法用于蛋白质磷酸化定量

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DOI：

10.3791/63665

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2022年6月6日

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1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

本文内容

摘要

本方案描述了利用改进的单分子下拉（SiMPull）实验对蛋白质磷酸化进行定量的样品制备与数据分析方法。

摘要

磷酸化是一种必要的翻译后修饰，可调控蛋白质功能并决定细胞信号转导的结果。目前用于检测蛋白质磷酸化的方法无法保留单个蛋白质之间磷酸化状态的异质性。单分子下拉（SiMPull）检测技术通过在玻璃盖玻片上进行蛋白质的免疫沉淀，随后开展单分子成像，用于研究大分子复合物的组成。via 该技术的现有方法经过改进，可在单分子水平上对全长膜受体的磷酸化状态进行稳健的定量分析。通过这种方式对数千个单个受体进行成像，可实现对蛋白质磷酸化模式的定量。本方案详细描述了从样品制备到成像的优化后 SiMPull 操作流程。玻璃表面处理及抗体固定方案的优化进一步提升了数据质量。本方案还提供了单分子数据分析代码，用于计算样品中磷酸化受体所占的比例。尽管本研究聚焦于表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化，但该方案可推广应用于其他膜受体及胞质信号分子。

引言

膜相关信号转导通过配体诱导的膜受体激活以及下游辅助蛋白的募集共同调控，后者负责信号的传递。受体胞内区关键酪氨酸的磷酸化对于启动信号复合物（即信号体）的形成至关重要1,2。因此，生物学中的一个重要问题是：磷酸化模式如何被建立并维持，以招募信号伙伴蛋白并决定细胞命运。这包括理解受体磷酸化的异质性，无论是磷酸化水平的差异，还是特定磷酸酪氨酸模式的多样性，这些均可通过调控信号体的组成来调节信号输出3,4,5,6,7。然而，当前研究蛋白质磷酸化的方法存在局限性。Western印迹分析在描述蛋白质磷酸化趋势方面表现优异，但其为半定量方法8，且由于将成千上万至数百万个受体信号平均化，无法提供系统异质性的信息。尽管Western印迹可利用针对特定酪氨酸的磷酸化特异性抗体对样本进行检测，却无法揭示同一蛋白质内多位点磷酸化的模式。定量磷酸化蛋白质组学可报告磷酸酪氨酸的丰度，但在检测多位点磷酸化方面仍存在限制，因为目标残基必须位于酶解后产生的同一肽段内（通常为7-35个氨基酸）9,10,11。

为克服上述局限性，单分子下拉（SiMPull）技术已被应用于在单分子水平上定量检测完整受体的磷酸化状态。Jain 等人首次证明了 SiMPull 是一种研究大分子复合物的有力工具。12,13在SiMPull中，大分子复合物通过抗体功能化的玻璃盖玻片进行免疫沉淀（IP），随后利用单分子显微镜分析蛋白质亚基数目及与复合物组分的共免疫沉淀情况12金等人的一种改良方法14被称为SiMBlot的方法是首个利用SiMPull的变体来分析变性蛋白质磷酸化的方法。 SiMBlot 实验方案依赖于使用 NeutrAvidin 包被的盖玻片捕获生物素标记的细胞表面蛋白，随后通过磷酸化位点特异性抗体标记检测其磷酸化水平14尽管取得了这些进展，但仍需进一步改进，以增强翻译后修饰定量的稳健性，并使其适用于更广泛的蛋白质。

本方案描述了一种优化的SiMPull方法，该方法已被用于定量分析完整表皮生长因子受体（EGFR）在不同配体条件和癌基因突变下的磷酸化模式15。尽管本研究聚焦于EGFR，但该方法可适用于任何具有高质量抗体的膜受体或细胞质目标蛋白（POI）。本方案包含降低样品自发荧光的步骤、一种仅需极小样品体积并可同时处理多达20个样品的样品阵列设计，以及抗体标记和固定条件的优化。此外，已开发出用于单分子检测和磷酸化蛋白定量的数据分析算法。

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方案

1. 盖玻片准备

注意：在此步骤中，操作者需佩戴个人防护装备（PPE），包括双层丁腈手套、护目镜或面罩，以及实验服。

  1. 进行Piranha刻蚀以去除玻璃上的有机碎屑。
    警告：Piranha 溶液是一种强氧化剂，具有腐蚀性，与有机物接触时高度反应。其与有机残留物的反应为放热反应，可能引发爆炸。因此，操作必须在通风橱内进行，并将挡板降至最低位置。处理 Piranha 溶液时必须使用 Pyrex 玻璃器皿。
    1. 在化学通风橱内准备操作区域。将盖玻片无重叠地排列在4 L玻璃烧杯底部， "反应" 烧杯，并将反应烧杯置于加热板上，用小火加热。让玻璃器皿预热10分钟。放置一个 "废弃物" 1 L 玻璃烧杯，内装 500 mL ddH₂O2反应烧杯近端。
    2. 加入49 mL 12 N的硫酸（H2SO4用玻璃血清移液管将溶液缓慢加入反应烧杯中。弃置前，用废液烧杯冲洗移液管。
    3. 加入21 mL 30%过氧化氢（H₂O₂）2O2用玻璃血清移液管将反应液逐滴加入反应烧杯中。缓慢分散加入 H2O2 将液滴均匀分散在反应瓶底部，以防止过氧化氢-硫酸混合液刻蚀反应的局部猝灭。使用后将移液管在废液杯中冲洗，再行处理。
      警告：始终将 H2O2 进入 H2SO4，且绝不可相反。
    4. 用Piranha刻蚀液刻蚀盖玻片30分钟，每5分钟轻轻摇动反应烧杯中的内容物。
    5. 将废液烧杯中的内容物缓慢沿反应烧杯内壁倒入，以淬灭piranha溶液，减少飞溅。将反应烧杯从加热板上取下。
    6. 当反应终止并冷却后，将过硫酸混合液倒回废液烧杯中进行中和处理，无需从反应烧杯中取出已蚀刻的盖玻片。
    7. 用弱碱逐步中和piranha溶液。例如，加入过量的20 g碳酸氢钠（NaHCO₃）3)/100 mL 过氧化氢-硫酸混合液。
      警告：切勿将piranha溶液储存在密封的废液容器中。该溶液在处理前必须始终进行中和。中和反应会产生剧烈气泡，若未通过逐步加入弱碱进行控制，可能引发爆炸。
    8. 用玻璃搅拌棒搅拌中和后的溶液，使其反应 2 h。将 pH 值调至 >4，弃去溶液。
    9. 在向芬顿溶液中加入弱碱的间隔期间，用玻璃玻棒将刻蚀后的盖玻片从反应烧杯转移至布氏漏斗中，并用流动的去离子水冲洗5分钟2O.
      注意：请立即进入下一步操作，或将经芬顿刻蚀的盖玻片保存于ddH₂O中，最多可保存2周。2O 在密封的玻璃罐或培养皿中（用封口膜包裹，参见 材料表).
  2. 将盖玻片按照以下步骤在有机溶剂中进行超声清洗。
    1. 将盖玻片放入玻璃染色缸中（参见 材料表）并用甲醇（CH3OH)。用封口膜将瓶盖密封至玻璃瓶上，超声处理10分钟。小心将甲醇从考普林瓶倒入玻璃储存瓶中。
    2. 用丙酮（C3H6O），盖紧盖子，超声处理10分钟。小心将丙酮从考普林瓶倒入玻璃储存瓶中。
      警告：甲醇易燃且具有急性毒性，应在化学通风橱中使用。丙酮易燃并具有刺激性，因此操作和储存时应使用玻璃容器，并在化学通风橱中使用。根据当地法规和指南，将其作为危险废物处置。
      注意：甲醇和丙酮均可重复使用最多五次。
  3. 活化盖玻片表面以进行硅烷功能化。
    1. 用1 M氢氧化钾（KOH）溶液在Coplin染色缸中浸泡并超声处理20分钟。小心将KOH溶液倒入50 mL锥形管中以备重复使用。
      警告：氢氧化钾具有腐蚀性且为刺激物。应在化学通风橱中使用，切勿储存于玻璃容器中，应储存于聚丙烯管中。根据当地法规和指南作为危险废物处理。
      注意：KOH 最多可重复使用五次。
    2. 用ddH₂O冲洗两次2O. Drain ddH2从盖玻片上取下后，用本生灯火焰来回烘烤每片盖玻片，以去除表面所有水分。将盖玻片置于干燥的科卜林瓶中。
  4. 进行盖玻片氨基硅烷化处理。
    1. 通过将 69.4 mL 甲醇与 3.6 mL 乙酸（CH3COOH）置于锥形瓶中。加入720 µN-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（氨基硅烷）L，充分混匀（参见 材料表).
      警告：乙酸易燃且具有腐蚀性。请使用玻璃移液管操作 并在玻璃容器中储存。操作乙酸时需在 化学通风橱。氨基硅烷具有急性毒性，吸入有害，且为致敏剂和刺激物。对水生生物有害。应在化学通风橱中使用。根据当地法规和指南，将化学品作为危险废物处置。
      注意：氨基硅烷具有光敏性，且在水中会迅速水解。所有涉及该试剂的操作均需在避光条件下进行，以保持其活性。储存前需用氮气吹扫瓶内，并封以密封膜，置于暗处干燥器中。每6至9个月更换一次。
    2. 立即将氨基硅烷溶液加入考普林瓶中。盖上盖子并用封口膜密封，继续避光保护。
    3. 在室温（RT）避光条件下，将盖玻片置于氨基硅烷溶液中孵育10分钟。随后超声处理1分钟，再继续孵育10分钟。小心将氨基硅烷溶液倒入指定用于CH的废液容器中3含痕量氨基硅烷的羟基与CH3COOH
    4. 用甲醇冲洗盖玻片，并将溶液倒入指定用于甲醇的废液容器中。
    5. 用ddH₂O冲洗盖玻片，每次2分钟，共冲洗三次2O. 取出盖玻片，吸去多余水分，室温下完全晾干10分钟。
  5. 进行盖玻片的阵列制备/生物素-PEG功能化。
    1. 制备 1 M NaHCO₃3 (pH 8.5) 工作液，通过溶解 84.5 mg NaHCO₃ 配制3 到 1 mL ddH₂O 中2O. 使 NaHCO₃ 终浓度为 10 mM3，将1 M NaHCO₃稀释3 加入ddH₂O2O (1:100)
    2. 用疏水屏障笔在干燥的氨基硅烷化盖玻片上绘制网格阵列（参见 材料列表）并等待墨水干燥。在盖玻片上标记标识符以指示正确方向。将盖玻片置于湿化 chamber 中。
      注意：阵列应包含16-20个方格，每个方格大小约为4 mm × 4 mm。
    3. 为了配制生物素-聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯（biotin-PEG）/甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG）溶液，首先取出mPEG和biotin-PEG（参见 材料表) 从冷冻保存状态取出后平衡至室温。取153 mg mPEG和3.9 mg生物素-PEG（生物素-PEG : mPEG 摩尔比约为1:39）加入1.5 mL微量离心管中，用609 μL溶剂重悬 µ10 mM NaHCO₃ 溶液3 通过轻柔吹打混匀。在10,000 x g 室温下静置1分钟以去除气泡。
      注意：缬氨酰琥珀酰亚胺酯在 pH 8.5 缓冲液中的水解半衰期约为 30 分钟。将缓冲液加入 mPEG 后，应尽快进行以下步骤。此步骤至关重要。
    4. 将生物素-PEG/mPEG 溶液加至盖玻片阵列的每个方格，使其完全覆盖，通常每格 10–15 µ每平方厘米加入 L。避免液体溢出指定区域。将盖玻片置于湿润容器中，室温避光孵育 3–4 小时。
    5. 用大量水清洗盖玻片，依次将其浸入盛有 ddH₂O 的 3 个 250 mL 玻璃烧杯中2每次10秒。
    6. 用氮气吹干盖玻片上的所有水分。将盖玻片背对背存放于密封膜包裹的50 mL锥形管中，管内充满氮气，并置于-20℃保存。 °C.
      ​注意：立即进行步骤2，或在-20℃保存盖玻片 °4°C 保存，最多可使用一周。

2. SiMPull 裂解液的制备

注意：本方案后续步骤所需的个人防护装备包括丁腈手套、安全眼镜和实验服。

注意：裂解液由表达 EGFR-GFP 的贴壁 CHO 细胞制备。将细胞接种于 60 mm 组织培养皿（TC60）中过夜培养12,13。CHO 细胞在添加 10% 胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 500 ng/mL 遗传霉素的 DMEM 培养基中培养（参见材料表）。其他贴壁细胞系或悬浮细胞也可使用。

  1. 按照以下步骤接种细胞。
    1. 用 1 mL 的 1× PBS 清洗培养皿（含细胞），然后加入 1 mL 的 1× 胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 5 分钟以使细胞脱落。使用移液器将脱落的细胞从培养皿转移至 1.5 mL 离心管中。
    2. 取 10 µL 台盼蓝与 10 µL 细胞悬液在另一离心管中混合。根据自动细胞计数仪的说明书（见材料表），使用 10 µL 细胞混合液进行细胞计数。
    3. 将 8 × 105 个细胞在 TC60 培养皿中过夜培养。每种实验条件接种一个培养皿。
      注：在本研究中，细胞未经处理或如步骤 2.4.1 所述经钒酸盐过氧化物（Pervanadate）和表皮生长因子（EGF）处理。
  2. 准备用于细胞裂解液制备的以下溶液。
    1. 制备冰冻的 1× PBS（pH 7.4）。
    2. 制备裂解缓冲液，即含 1% 非离子型、非变性去垢剂（见材料表）的 50 mM Tris-HCl（pH 7.2）和 150 mM NaCl 溶液，并添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂（PPI）（按储存液稀释 1:100）。将离心管置于旋转混合仪上，使缓冲液混合 15 分钟。 将配制好的溶液置于冰上保存。
    3. 配制 Tyrode's 缓冲液，终浓度为 135 mM NaCl、10 mM KCl、0.4 mM MgCl2、1 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.2）、20 mM 葡萄糖和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）（见材料表）。将溶液预热至 37 °C。
  3. 制备磷酸化阳性对照——1 mM 钒酸盐过氧化物（pervanadate）处理。
    注：此步骤为可选。钒酸盐过氧化物是钒酸盐的过氧化形式，为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂16。通过抑制磷酸酶活性阻止蛋白去磷酸化，从而获得高度磷酸化的样品。
    1. 配制 200 mM 活化正钒酸钠（Na3VO4）储存液。
      1. 配制 100 mL 溶液时，将 3.89 g Na3VO4（见材料表）加入 90 mL 去离子水（ddH2O）中，边搅拌边溶解。逐滴加入 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 10。加入 HCl 会使溶液变为黄色。
      2. 用 ddH2O 定容至 100 mL，通过微波加热煮沸溶液。煮沸后，溶液将变为无色。
      3. 冷却至室温（RT），重新调节 pH 至 10。重复煮沸、冷却和 pH 调节 2 至 4 次，直至 pH 稳定在 10。分装后于 -20 °C 保存。
    2. 通过将 20.4 µL 的 3% H2O2 与 100 µL 的 200 mM Na3VO4 和 546.8 µL 的 ddH2O 混合，配制 30 mM 钒酸盐过氧化物（PV）储存液（H2O2 与活化的 Na3VO4 摩尔浓度相等）。在室温下避光孵育 15 分钟。
    3. 用 Tyrode's 缓冲液配制 1 mM PV 溶液。配制 10 mL 溶液时，将 0.33 mL 的 30 mM PV 储存液加入 9.67 mL 的 37 °C Tyrode's 缓冲液中。立即对细胞进行处理。
    4. 用 3 mL Tyrode's 缓冲液清洗细胞一次。向细胞中加入 3 mL 含 1 mM PV 的 Tyrode's 缓冲液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
  4. 进行配体刺激。
    1. 使用适当的浓度、时间和温度，用目标配体刺激细胞。为实现 EGFR 的最大激活，使用含 50 nM 表皮生长因子（EGF，见材料表）和 1 mM PV 的 Tyrode's 缓冲液 1 mL，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  5. 进行细胞裂解。
    1. 在完成所需的细胞处理后，将培养皿置于冰上，用冰冻的 1× PBS 清洗。使用移液器完全吸除 PBS 液体。
    2. 向培养皿中加入 180 µL 裂解缓冲液（步骤 2.2.2）。使用细胞刮棒在培养皿内移动缓冲液，确保完全覆盖细胞。在整个培养表面施加稳定且均匀的压力，彻底裂解细胞。
      注：裂解缓冲液的体积应尽量保持最小，以确保较高的蛋白浓度。
    3. 用移液器吸取裂解后的细胞，转移至 1.5 mL 离心管中。将离心管置于冰上 30 分钟，每隔 5 分钟涡旋震荡一次。
      注：如果目标蛋白（POI）由多个亚基组成或对解离敏感，则不应涡旋震荡裂解液。
    4. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 20 分钟。用移液器将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。此即为总蛋白裂解液。
    5. 保留 10 µL 裂解液，加入 90 µL 裂解缓冲液稀释，用于双辛可宁酸比色法（BCA）分析17。将剩余的总蛋白裂解液储存于 -80 °C。
    6. 使用 BCA 分析法测定裂解液的总蛋白浓度（见材料表）。
      ​注：总蛋白裂解液可在实验当天制备后立即使用，或分装为单次使用量于 -80 °C 保存最多 12 周。避免反复冻融。

3. 使用生物素标记的抗体对抗体芯片进行功能化修饰

  1. 准备以下溶液。
    1. T50 缓冲液，含 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 50 mM NaCl 的溶液。该溶液在室温下可稳定保存 1 个月。
    2. 在 T50 缓冲液中加入 0.1 mg/mL BSA，配制 T50-BSA。配制后将溶液置于冰上保存。
    3. 用 1× PBS 配制 10 mg/mL 的硼氢化钠（NaBH4）。请在使用前立即配制。
    4. 用 T50 缓冲液配制 0.2 mg/mL 的中性亲和素（NeutrAvidin）（参见材料表）。
      警告：NaBH4 为还原剂，易燃。使用后应始终用氮气吹扫容器，并将其保存在干燥器中。
  2. 用生物素化抗体对芯片进行功能化修饰。
    1. 从冰箱中取出经 PEG-生物素修饰的芯片，在打开前将锥形管平衡至室温。将带有阵列的一面朝上放置于铺有密封膜的 100 mm 组织培养皿（TC100）中。
      注意：应尽量减少上方光照。所有溶液应在疏水性阵列所界定的每个方格内形成液滴。加入适量溶液以完全覆盖每个方格（通常为 10–15 µL），避免液体溢出限定区域。为快速移除液体，可使用连接至真空瓶的实验室真空管线收集废液。NaBH4 废液应在化学通风橱内敞口放置 1 小时以释放气体后再行处理。NaBH4 处理可降低背景自发荧光，从而减少单分子检测中的假阳性信号。
    2. 在室温下用含 10 mg/mL NaBH4 的 1× PBS 处理芯片每个方格 4 分钟，随后用 PBS 洗涤三次。
    3. 在 T50 缓冲液中加入 0.2 mg/mL NeutrAvidin，孵育每个方格 5 分钟；随后用 T50-BSA 洗涤三次。
      注意：NeutrAvidin 可结合 PEG-生物素，为生物素化抗体提供结合位点12,13,15。
    4. 在 T50-BSA 中加入 2 µg/mL 的生物素化目标蛋白特异性抗体，孵育每个方格 10 分钟；随后用 T50-BSA 洗涤三次。
      ​注意：本实验方案使用生物素化抗 EGFR IgG（参见材料表）捕获 EGFR-GFP。

4. 从全细胞裂解液中进行目标蛋白的SiMPull

注意：将功能化的 SiMPull 阵列 TC100 培养皿置于冰上，直至完成 SiMPull 制备的后续步骤。此步骤是从总蛋白裂解液中进行目标蛋白（POI）的下拉。裂解液在解冻后不得重复使用。

  1. 配制以下溶液。
    1. 在1× PBS中配制4%多聚甲醛（PFA）/0.1%戊二醛（GA）。
      注意：PFA和GA为有毒化学固定剂，且可能具有致癌性。操作时需穿戴个人防护装备（PPE），并根据当地法规和指南将化学品作为危险废物处理。
    2. 配制10 mM Tris-HCl，pH 7.4。
  2. 通过轻柔吹打使裂解液解冻并混匀，置于冰上保存。
  3. 将1 µL裂解液加入100 µL冰上预冷的T50-BSA/PPI中进行稀释。
    注意：如有需要，可通过在阵列上应用不同稀释倍数来确定总蛋白裂解液的合适稀释比例。每单位阵列面积上SiMPull受体的最佳密度为0.04–0.08/µm2。裂解液的稀释效果可在第6步（数据分析）中进行评估。
  4. 将裂解液在阵列上孵育10分钟，随后用冰上预冷的T50-BSA/PPI洗涤四次。
  5. 将AF647标记的抗磷酸化酪氨酸抗体（见材料表）用冰上预冷的T50-BSA/PPI稀释后，加入阵列中孵育1小时。
    注意：本实验方案中使用广谱抗pTyr（PY99）-AF647 IgG抗体来识别磷酸化的EGFR-GFP亚群。使用直接标记的抗体可避免使用二抗，从而增加标记选择性并提高实验结果的一致性。荧光标记抗体可从商业来源获得；若无市售产品，可采用标准生物偶联技术进行定制标记，亦可使用市售的生物偶联试剂盒。每一批次的荧光标记抗体均需通过SiMPull实验测试其最佳标记条件，测定剂量-反应曲线并确定饱和点。
  6. 用冰上预冷的T50-BSA洗涤六次，总洗涤时间为6–8分钟。
  7. 用冰上预冷的1× PBS洗涤两次。
  8. 将阵列与4% PFA/0.1% GA溶液在室温下孵育10分钟，以防止抗体解离。
  9. 用10 mM Tris-HCl，pH 7.4/PBS洗涤两次，每次5分钟，以灭活固定剂。
    注意：对于使用多种抗体的实验（例如检测多个磷酸化酪氨酸位点），需重复步骤4.5–4.9。有关判断两种抗体之间是否存在空间位阻的信息，请参见第6.2.9步。

5. 图像采集

注意：单分子成像使用150倍TIRF物镜和图像分光器进行，图像分光器将每个光谱通道捕获到emCCD相机的特定象限（参见材料表）。首先获取校准图像，以便利用纳米图案化通道对准网格（nanogrid）进行通道配准和相机增益校准，该网格包含20 × 20阵列的200 ± 50 nm孔，孔间距离为3 ± 1 µm（总尺寸约60 µm × 60 µm）。

  1. 按照以下步骤执行通道校准。
    注意：精确的通道校准对于正确计算发射体的共定位至关重要。此步骤非常关键。
    1. 清洁油镜并在物镜上滴加一滴镜油。将纳米网格放置在载物台上进行成像。使用透射白光，对焦到网格图案上。
      注意：纳米网格的图像通过透射光采集，透射光穿过纳米网格并被所有光谱通道检测到。或者，也可使用多荧光微珠，其发出的荧光可被各个通道分别检测。图像采集需根据每台显微镜的配置进行优化。
    2. 采集该网格的20幅图像序列。确保像素未饱和。将图像序列保存为“Fiducial”。
    3. 使纳米网格离焦以形成艾里斑图案18。采集20幅图像用于增益校准。将图像保存为“Gain”。
    4. 通过阻断所有进入相机的光线，采集20幅图像以获取相机本底信号。将图像保存为“Background”。
  2. 采集SiMPull图像。
    注意：在对盖玻片阵列成像前，将Tris溶液更换为T50-BSA，并将阵列平衡至室温。
    1. 清洁油镜并在物镜上补充镜油。将盖玻片阵列牢固固定在显微镜载物台上。
    2. 优化每种荧光染料的激发功率、全内反射角（TIRF）和相机积分时间。目标是在最小化样品光漂白的同时获得最高的信噪比。记录激光功率，以便后续测量保持一致。
      注意：本研究中，远红通道的曝光时间为300 ms，绿色通道为1 s。642 nm激光器的激光功率约为500 µW，488 nm激光器的激光功率为860 µW，均在物镜管透镜前测量。
    3. 对每个样品采集图像。优先采集远红通道，随后依次采集波长更短的荧光通道，以减少光漂白。由于每个样品使用的体积较小，每30–45分钟检查一次缓冲液液面，并根据需要补充。

6. 数据分析

  1. 下载演示代码。
    注意：提供的演示代码和示例数据集展示了完整的数据分析流程（补充编码文件 1-4）。SiMPullMain.m 中列出的系统要求见于 补充编码文件 1。
    1. 解压 并 保存 至个人文档中的 Documents/MATLAB（MacOS/Linux）或 Documents\MATLAB（Windows）目录。
      注意：这将生成四个新文件夹：SiMPull_class、smite、Sample Data、Sample Analysis Outputs。
    2. 打开 SiMPull_class 文件夹中的“ReadMe_Setup.txt”文件。
    3. 安装 MATLAB 及 MATLAB 工具箱：曲线拟合工具箱（Curve Fitting Toolbox）、并行计算工具箱（Parallel Computing Toolbox）以及统计与机器学习工具箱（Statistics and Machine Learning Toolbox）。
    4. 根据下载说明安装 DipImage19。
    5. 按照 ReadMe_setup.txt 中的说明安装“smite”单分子分析软件包。
      注意：“smite”可在 GitHub 仓库中获取（见 材料表）。
    6. 通过将 SiMPull_class 文件夹中的 SiMPullMain.m 文件拖入 MATLAB 窗口来打开该文件。
    7. 点击 浏览文件夹 图标并选择文件夹，将当前目录更改为 ...\MATLAB\Sample Data\。
  2. 数据处理步骤概述
    1. 运行 SiMPullMain.m —— 按照各部分的说明依次执行。将光标置于相应部分后，点击“运行节”图标以逐节执行。
      注意：本节描述了数据分析的一般步骤。详细说明见随附的 SiMPullMain.m 代码。
    2. 运行“初始化”部分，设置路径以定义光谱通道和图像尺寸。
    3. 运行“查找相机增益和偏移”部分，利用增益和背景数据集将相机增益转换为光子数。
    4. 运行“通道配准”部分，计算用于图像配准的局部加权均值变换。
    5. 格式化并整理数据。运行“将连续通道合并为四通道图像”部分，然后运行“去除坏帧”部分。
    6. 运行“拟合单分子并识别重叠分子”部分。
      注意：该部分执行多个函数，用于在每个通道中定位单分子，并确定不同光谱通道之间的共定位事件。
    7. 为确定每个真实 GFP 拟合所需的最小光子数，运行“优化最小光子阈值”部分。这是一个迭代过程。
      1. 首先，将 smf.Thresholding_MinPhotons 设置为 [0, 0, 0] 并运行该部分。提示时选择“Blank Data”文件。再对“CHO-EGFR-GFP”文件重复此操作。
      2. 通过比较两个直方图选择合适的最小阈值。将 smf.Thresholding_MinPhotons 设置为 [475, 0, 0]，然后再次运行该部分。
    8. 运行“计算 GFP 拟合中 FR 信号阳性比例”部分，以校正背景定位并计算最终数值。
    9. 根据实验需求执行选项 1（步骤 6.2.10）或选项 2（步骤 6.2.11）。
    10. 选项 1：根据参考文献15所述方法，校正可用于配体结合的细胞膜表面受体数量。
      1. 首先，使用饱和浓度的荧光 NHS 酯染料（NHS-AF647，见 材料表）标记表面受体。然后进行 SiMPull 实验，确定与 AF647 共定位的 GFP 定位所占百分比。
        注意：这可估算出可用于 NHS 标记的受体比例以及表面受体数量的比例（SR）。
      2. 在最终计算中应用 SR 校正：NGFP = (NLOC - NBG)*SR，其中 NGFP 为校正后的 GFP 定位数，NBG 为背景定位数，NLOC 为总定位数。
        注意：在当前示例中，未应用此校正，因为过钒酸盐具有膜通透性16，因此磷酸酶抑制作用不仅限于表面受体。
    11. 选项 2：对于多位点磷酸化测量，需考虑使用两种抗体时可能产生的空间位阻效应。
      注意：空间位阻可能导致当抗体 2 存在时，抗体 1 的磷酸化受体观测百分比（P12）低于仅使用抗体 1 时的百分比（P1）。
      1. 使用 SiMPull 测定 P1 和 P12，并根据先前发表的参考文献15计算空间位阻的校正因子。

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结果

图解 SiMPull 过程的示意图见图1A。盖玻片通过 NeutrAvidin 进行功能化修饰，作为生物素化抗EGFR抗体的锚定点，用于从总蛋白裂解液中捕获 EGFR-GFP。在洗去未结合的蛋白质后，磷酸化的受体使用抗磷酸酪氨酸（anti-PY）抗体进行标记15。图1B 显示了疏水性阵列的图像，可在同一盖玻片上制备并成像多个样品。这种样品支架的一个优势是所需样品体积极小，约为 10 µL。盖玻片可直接放置在显微镜载物台上进行成像，但使用盖玻片支架有助于稳定盖玻片。图1B 所示的盖玻片支架采用3D打印机制作，其设计蓝图见补充编码文件5。疏水性墨水的自发荧光有助于确定样品的焦平面（图1C）。图1D 展示了一幅多通道原始图像的示例。

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讨论

本文所述方案经过优化，可在单个蛋白质水平上实现受体磷酸化的定量检测。我们对SiMPull方案进行了若干简单但重要的改进，以提高酪氨酸磷酸化检测的测量可靠性，包括采用NaBH4处理以降低自发荧光，以及对样品进行固定后处理以防止抗体解离。利用绿色荧光通道的掩膜来识别受体位置，从而计算其与抗磷酸化酪氨酸（anti-PY）抗体的共定位，可有效排除抗体与细胞裂解液非特异性结合所导致的潜在假象，提高测量准确性。本研究采用双色成像方法检测受体中发生磷酸化的比例。在此方案中，受体通过基因工程标记GFP，抗体则直接标记远红外荧光染料。SiMPull方法同样适用于其他具有特异性抗体的蛋白质靶标，包括细胞内蛋白。此外，由于无需变性条件，因此也可捕获多亚基受体/复合物。然而，若目标翻译后修饰（PTM）位于蛋白质的结构化区域，则可引入变性步骤14。最终，SiMPull方法可进一步拓展，实现对单个受体上不同酪氨酸磷酸化位点的同时标记，以定量分析多位点磷酸化模式15。这种对全长、完整受体的检测方式，是其他常规方法（如Western印迹和磷酸化质谱）所...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R35GM126934、R01AI153617 和 R01CA248166，授予 DSL。EMB 得到 ASERT-IRACDA 项目（NIH K12GM088021）的支持，JAR 得到新墨西哥大学 MARC 项目（NIH 2T34GM008751-20）的支持。我们衷心感谢新墨西哥大学综合癌症中心荧光显微镜共享资源平台的支持，该平台由 NIH P30CA118100 资助。我们谨向 Ankur Jain 博士和 Taekijip Ha 博士致谢，他们最初开发的 SiMPull 技术启发了本研究。
ES-C 现地址：美国国立癌症研究所癌症研究中心整合癌症免疫学实验室免疫动态研究组，贝塞斯达

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管MTC BioC2000
10 mM Tris-HCl，pH 7.4
10 mM Tris-HCl，pH 8.0 / 50 mM NaClT50 缓冲液
100 mm 组织培养皿CELLTREAT229620用于存放经 piranha 溶液蚀刻的玻璃/阵列
15 mL 锥形管
16% 甲醛水溶液Electron Microscopy Sciences15710危险品
50 mL 锥形管功能化玻璃储存 / KOH 重复使用
50 mM Tris-HCl，pH 7.2 / 150 mM NaCl裂解缓冲液组分
60 mm 组织培养皿Corning430166
8% 戊二醛水溶液Electron Microscopy Sciences16020危险品
丙酮（C3H6O）Millipore Sigma270725危险品
Alexa Fluor 647 NHS 酯Thermo Fisher ScientificA-20006
无动物源性重组人 EGFPeprotechAF-100-15
抗人 EGFR（胞外域）– 生物素Leinco Technologies, IncE101
抗磷酸化酪氨酸抗体（PY99）Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
超声水浴机Branson1200
BCA 蛋白检测试剂盒Pierce23227
生物素-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA，分子量 5,000
牛血清白蛋白Gold BiotechnologyA-420-1Tyrode 缓冲液组分
布氏漏斗
本生灯
氯化钙（CaCl2）Millipore SigmaC4901Tyrode 缓冲液组分
细胞刮刀Bioworld30900017-1
锥形抽滤瓶Fisher ScientificS15464
Coplin 染色缸WHEATON900470
Countess II 自动细胞计数仪Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
盖玻片 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEM 培养基Caisson LabsDML19-500
emCCD 相机Andor iXon
胎牛血清，Optima 级Bio-TechneS12450H经热灭活处理
Fusion 360 软件Autodesk
遗传霉素 G418 硫酸双盐Caisson LabsG030-5GM
冰醋酸（CH3COOH）JT BakerJTB-9526-01危险品
玻璃移液管
玻璃搅拌棒
葡萄糖（D-(+)-葡萄糖）Millipore SigmaD9434Tyrode 缓冲液组分
Halt 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液（100X）Thermo Fisher Scientific78446裂解缓冲液组分
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode 缓冲液组分
盐酸（HCl）VWRBDH7204-1危险品
过氧化氢（H2O2）（3%）HX0645
过氧化氢（H2O2）（30%）EMD MilliporeHX0635-2
冰
IGEPAL CA-630（NP-40）Sigma AldrichI8896裂解缓冲液组分
ImmEdge 疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F 浸油Zeiss444960-0000-000
实验室自建真空系统
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-164
六水合氯化镁（MgCl2-6H2O）MPBio2191421Tyrode 缓冲液组分
MatlabMathworks曲线拟合工具箱、并行计算工具箱和统计与机器学习工具箱
甲醇（CH3OH）IBIS ScientificMX0486-1危险品
Milli-Q 水
Mix-n-Stain CF 染料抗体标记试剂盒Biotium92245推荐使用的偶联试剂盒
mPEGLaysan BiomPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，分子量 5,000
N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷UCT United ChemicalA0700危险品
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin 生物素结合蛋白Thermo Fisher Scientific31000
氮气（压缩气体）
配备 CUDA 的 NVIDIA GPU请在 https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html 查询兼容性
Olympus iX71 显微镜Olympus
Parafilm M 封口膜The Lab DepotHS234526C
PBS，pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 模拟加热板Corning6795-200
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140-163
磷酸化 EGFR 抗体（Tyr1068）（1H12）小鼠单克隆抗体Cell Signaling Technology2236BF
氯化钾（KCl）Millipore Sigma529552Tyrode 缓冲液组分
氢氧化钾（KOH）Millipore Sigma1050330500危险品
优质 PLA 线材，直径 1.75 mmRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028打印温度范围：205–235 °C
Pro2 3D 打印机Raise 3D
Pyrex 1 L 烧杯
Pyrex 100 mL 储存瓶Corning1395-100用于重复使用甲醇（CH3OH）和丙酮（C3H6O）
Pyrex 250 mL 烧杯
Pyrex 4 L 烧杯
Quad-view 图像分光器PhotometricsModel QV2
冷冻离心机EppendorfEP-5415R
RevCount 细胞计数器，EVE 细胞计数载玻片VWR10027-446
Semrock 发射滤光片：蓝色（445/45 nm）、绿色（525/45 nm）、红色（600/37 nm）、远红（685/40 nm）SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
移液管控制器
移液管
smite 单分子分析软件包https://github.com/LidkeLab/smite.git
碳酸氢钠（NaHCO3）Sigma AldrichS6014危险品
硼氢化钠（NaBH4）Millipore Sigma452874Tyrode 缓冲液组分
氯化钠（NaCl）Millipore SigmaS9625通过连续加热和 pH 循环激活
氢氧化钠VWRBDH3247-1
偏钒酸钠（Na3VO4）Millipore SigmaS6508危险品
硫酸（H2SO4）Millipore Sigma258105危险品
TetraSpeck 微球Thermo Fisher ScientificT7279多荧光微珠
Tris（Trizma）碱Millipore SigmaT1503
台盼蓝染液，0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
胰蛋白酶-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120

参考文献

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EGFR

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