本实验方案描述并比较了对小鼠脑组织矢状切片进行全区域或特定感兴趣区域分析的步骤，以定量阿尔茨海默病APP/PS1转基因小鼠模型中的β-淀粉样蛋白负荷。
本文内容
摘要
摘要
细胞外淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块的积聚是阿尔茨海默病（AD）的主要病理特征之一，也是目前唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的AD疾病修饰疗法的作用靶点。因此，过表达淀粉样前体蛋白并由此在脑内积聚Aβ斑块的转基因小鼠模型被广泛用于模拟人类AD。因此，免疫检测方法（包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫染色）常用于检测AD转基因小鼠脑组织中的Aβ负荷量。尽管Aβ检测与定量方法已有充分建立和文献记录，但脑组织中所选感兴趣区域的大小对免疫染色后Aβ负荷量测量结果的影响尚未见报道。因此，本方案旨在利用图像分析软件，比较全区域与子区域感兴趣区域之间的Aβ负荷量测量结果。本文描述了脑组织制备、游离脑切片免疫染色、成像以及对全区域与子区域感兴趣区域中Aβ负荷量进行定量的步骤，所用脑切片来自13月龄APP/PS1双转基因雄性小鼠。本方案及其实验结果提供了有关感兴趣区域大小对Aβ阳性面积定量影响的重要信息，并显示：对于表现出广泛Aβ沉积的13月龄雄性APP/PS1小鼠脑切片，采用全区域与子区域分析所得的Aβ阳性面积之间具有高度相关性。
引言
阿尔茨海默病（AD）是美国第六大死因，持续构成公共卫生威胁，目前估计有620万美国人患有AD，到2060年这一数字预计将达到1380万。1迄今为止，主要的治疗方案是通过胆碱酯酶抑制剂和美金刚等药物进行对症管理。2阿尔茨海默病（AD）的特征是神经病理学改变，例如细胞外淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块沉积和细胞内以神经原纤维缠结形式存在的过度磷酸化tau蛋白积聚。3,4由淀粉样前体蛋白（APP）经内源性蛋白水解切割形成 通过 β-和γ-分泌酶，Aβ聚集形成寡聚体和纤维，导致神经毒性效应5自20世纪80年代以来，Aβ被认为在阿尔茨海默病中起主要的致病作用，并且是目前唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疾病修饰疗法的治疗靶点。6因此，自20世纪90年代初以来，携带基因突变并导致大脑内Aβ显著积聚的转基因AD小鼠模型已被广泛用于阿尔茨海默病的临床前研究。7.
通常使用两种免疫测定方法检测这些阿尔茨海默病（AD）转基因小鼠脑组织中的Aβ物种：酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫染色。前者能够对不同Aβ物种进行定量测定，且相比免疫染色更节省时间，因为免疫染色需要多个连续的组织处理和成像步骤，包括组织切片、免疫染色、成像和定量8。此外，免疫染色所得结果为半定量性质8。然而，由于免疫染色能够实现Aβ在空间上的定位，因此在脑组织中检测Aβ时仍是一种具有吸引力的方法8。
在使用 Aβ 免疫染色时，不同的研究团队采用了多种不同的定量方法。例如，一些研究团队对整个目标区域（皮层或海马）中的 Aβ 负荷进行定量，而另一些团队则对指定的子区域（皮层或海马的某一部分）中的 Aβ 负荷进行定量9,10,11。尽管 Aβ 检测与定量的方法已有较为完善的建立和文献记录，但目标区域大小对免疫染色后 Aβ 负荷测量结果的影响尚未见报道。因此，本实验方案旨在利用图像分析软件 ImageJ，比较在完整区域与子区域范围内 Aβ 负荷测量的差异。
本研究采用13月龄的APP/PS1双转基因雄性小鼠，该小鼠表达嵌合型小鼠/人源APP以及突变型早老素1，用于模拟早发性阿尔茨海默病（AD）12。Aβ沉积物自6至7月龄开始形成，至9至10月龄时，这些小鼠的大脑皮层和海马区均可见大量Aβ积聚12。转基因来源的淀粉样肽和全长蛋白可通过6E10免疫染色法检测13，因此该动物模型适用于本实验方案。本文涵盖的操作步骤包括脑组织制备、游离切片的免疫染色、成像以及对感兴趣区域整体与亚区中Aβ负荷的定量分析。分析结果显示，整体区域与亚区定量结果之间具有强相关性，表明在来自13月龄APP/PS1雄性小鼠、且呈现大量Aβ沉积的脑组织切片中，这两种定量方法具有一致性和可靠性。
方案
所有动物实验均依照加州大学欧文分校机构动物照护与使用委员会批准的方案，在大学实验动物资源部门的监管下进行。实验使用了13月龄的雄性B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax（APP/PS1）小鼠（n = 35），小鼠来源于商业渠道（见材料表）。
1. 脑组织制备
- 根据批准的动物实验方案，通过腹腔注射苯妥英钠/戊巴比妥钠类麻醉剂（150 mg/kg）对小鼠实施致死剂量麻醉（参见材料表）。以5 mL/min的速度用冰冻的磷酸盐缓冲液（1× PBS）进行心脏灌注5分钟，以清除脑血管系统14。
- 按照先前发表的文献方法获取脑组织15，将脑组织分离为左右半脑，并将每只小鼠的右半脑放入含有5 mL新配制的4%多聚甲醛 (PFA) 溶液（溶于1× PBS）的15 mL锥形管中，于4 °C固定72小时。
注：根据所研究抗原的不同，脑组织浸渍固定时间可在24–72小时之间调整。去除小脑后的左半脑可迅速在液氮中冷冻，随后保存于-80 °C，用于ELISA或生化法检测Aβ等生化分析16。
注意：PFA可能具有致癌性，皮肤接触可能导致过敏性皮肤反应。操作时应佩戴腈类或丁基手套、口罩及护目设备，并在化学通风橱中配制。 - 在4% PFA中孵育后，将右半脑依次置于5 mL 10%、20%和30%的蔗糖溶液（以1× PBS配制）中，每种浓度于4 °C孵育24小时，直至脑组织沉降至锥形管底部。
- 在30%蔗糖溶液中孵育完成后，取出半脑，用滤纸轻轻吸去表面多余的蔗糖溶液，然后将固定的半脑在粉末状干冰中冷冻30分钟。将冷冻后的半脑包裹于标记清晰的铝箔中，保存于-80 °C，直至进行冷冻切片。
注：在本实验方案中，半脑样本在-80 °C下保存了6–8个月。 - 使用冷冻切片机将冷冻的半脑切成20 µm厚的切片（参见材料表）。
注：在本方案中，半脑被切为矢状面切片；如有需要，也可制备冠状面切片17。步骤2用于对固定并经冷冻保护处理的脑组织样本进行Aβ免疫荧光染色。
2. 免疫荧光
- 将矢状面脑组织切片（步骤 1.5）放入 24 孔板中（每孔最多六片小鼠脑组织切片，每孔 300 µL）。将孔板置于摇床上，以轻柔旋转方式在室温（23 °C）下用 1x PBS 洗涤 5 分钟，重复三次。
- 在室温下用 dH20 中的 70% 甲酸孵育脑组织切片 10 分钟。
注意：甲酸具有腐蚀性，应避免接触皮肤和眼睛。 - 在室温下用 dH20 洗涤脑组织切片 5 分钟，重复三次。
- 在室温下用含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.3% TritonX 100（见材料表）的 1x PBS 封闭 1 小时，以阻断非特异性结合。
- 将脑组织切片与荧光标记的一抗（6E10，见材料表）在含 0.3% TritonX 100 的 1x PBS 中按 1:1000 稀释后，在 4 °C 孵育 24 小时。
注意：由于一抗为荧光素偶联抗体，从本步骤开始需将孔板遮光，或所有操作均在避光环境中进行，以维持荧光基团的活性。 - 在室温下用 1x PBS 洗涤脑组织切片 10 分钟，重复三次。
- 将脑组织切片转移至带有正电荷的载玻片上（见材料表），在短暂用 dH20 洗涤以去除残留盐分后进行贴片（载玻片上的标签信息根据个人偏好标注）。将载玻片在避光条件下自然晾干。
注意：脑组织切片必须小心贴附，避免产生皱褶或撕裂，以免影响数据定量。若出现位于感兴趣区域且可能干扰数据定量的撕裂和/或皱褶，建议重新染色并重新贴片。 - 使用水溶性封片剂（见材料表）封固脑组织切片，并将盖玻片覆盖于组织上。用透明指甲油密封盖玻片边缘，并将载玻片置于载玻片盒中，于 4 °C 保存直至成像。
注意：在本实验方案中，染色后 1 个月内完成载玻片的成像。
3. 成像
- 使用荧光显微镜（落射荧光或共聚焦显微镜）（参见材料表），配备2倍物镜以单幅图像完整捕获整个脑组织切片，并配置适当的滤光片（本研究中使用GFP滤光片）对6E10染色的脑切片进行成像。
注意：不同载玻片的成像设置必须保持一致。 - 将捕获的图像保存为TIFF文件或按需保存，并按照下文步骤4.2所述，在图像分析软件（参见材料表）中打开，用于6E10定量分析。
注意：在捕获图像前应添加标尺，以便在图像分析软件ImageJ中进行定量分析。
4. 全区域兴趣分析
注意：本研究的两个感兴趣区域为海马体和同型皮层。全区域分析指的是对成像脑组织切片中的整个同型皮层（以下简称皮层）或海马体进行分析。
- 下载图像分析软件（参见材料表），安装后启动软件。
- 软件运行后，点击文件 | 打开 | 选择要分析的图像。
- 点击分析 | 设置尺度 | 点击移除尺度。 从软件工具栏中选择 直线 工具，沿标尺长度绘制一条直线。点击 分析 | 测量。记录标尺的像素长度或距离。点击 分析 | 设置尺度。
- 在弹出窗口中，输入像素距离、标尺的实际长度（本例中为 µm）以及长度单位 µm。如果需对多个图像应用相同的尺度设置，请勾选 全局 选项。点击 确定 以应用设置。
注意：在进行进一步分析前，始终建议检查图像是否已正确应用准确的尺度。
- 在弹出窗口中，输入像素距离、标尺的实际长度（本例中为 µm）以及长度单位 µm。如果需对多个图像应用相同的尺度设置，请勾选 全局 选项。点击 确定 以应用设置。
- 为设定所需测量区域的面积，请进入分析 | 设定测量 | 勾选面积和显示标签选项。确保正在分析的图像已在重定向至选项下被选中。
- 为便于海马体或皮层的可视化，进入图像 | 调整 | 亮度/对比度。逐渐将最大值滑块向左拖动，以增强组织清晰度，直至可识别出感兴趣的脑区。
注意：分析过程中请勿保留此设置，以免造成测量偏差，应直接进入下一步。 - 使用多边形选区或自由手绘选区工具勾勒出海马体区域。在完成海马体轮廓绘制后，点击亮度/对比度设置中的重置选项，恢复原始亮度。
注意：皮层区域需单独重复上述步骤。 - 为测量所选区域的总组织面积，点击编辑 | 清除外部。当屏幕上仅显示所选区域时，点击分析 | 测量，在弹出窗口中获取所分析的总组织面积。将数据保存至 Excel 文件以供后续使用。
- 为测量 6E10 阳性区域，进入图像 | 调整 | 颜色阈值。在阈值方法下通常可使用预设滤镜，以红色高亮显示最强信号。
注意：最佳阈值的选择取决于图像背景和染色强度。应选择能够识别染色信号而排除背景干扰的阈值设置。 - 选择合适的阈值后，勾选暗背景。这将在黑色背景上突出显示 Aβ 斑点（即目标染色）。点击选择 | 原始图像 | 选择，使暗信号（Aβ 沉积物）在白色背景上显示。点击分析 | 分析颗粒，当弹出窗口出现时点击确定。
- 通过点击编辑 | 复制，复制软件生成的汇总结果。将其粘贴至之前创建的 Excel 文件中，并标注相应信息。此即为所选感兴趣区域（海马体或皮层）中的 6E10 阳性面积。
注意：在 Excel 中，将有一列记录总 6E10 阳性面积（步骤 4.10）和总组织面积（步骤 4.7）。 - 按以下公式计算 6E10 阳性面积百分比16：（总 6E10 阳性面积 / 所分析的总组织面积）× 100。
5. 感兴趣亚区分析
注意：感兴趣亚区分析是指对成像脑组织切片中皮层或海马体的某一部分进行分析。
- 下载图像分析软件，并在安装完成后启动该软件。
- 软件运行后，点击 文件 | 打开 | 选择要分析的图像。
- 点击 分析 | 设置尺度 | 点击移除尺度。 从软件工具栏中选择 直线 工具，在比例尺的长度方向上绘制一条直线。点击 分析 | 测量。记录比例尺的像素长度或距离。点击 分析 | 设置尺度。
- 在弹出窗口中，输入像素距离、比例尺的已知实际距离（本例中为 µm），并将长度单位设为 µm。如果需对多个图像应用相同设置，请勾选 全局 选项，以便将新尺度设置应用于后续所有图像。点击 确定 以应用设置。
注意：在进行进一步分析前，始终建议检查图像是否已正确应用准确的尺度。
- 在弹出窗口中，输入像素距离、比例尺的已知实际距离（本例中为 µm），并将长度单位设为 µm。如果需对多个图像应用相同设置，请勾选 全局 选项，以便将新尺度设置应用于后续所有图像。点击 确定 以应用设置。
- 为设定所需的截面面积测量，请进入 分析 | 设定测量项 | 勾选“面积”和“显示标签”。确认正在分析的图像已在 重定向至 选项下被选中。
- 若图像过暗导致脑区（例如本例中的海马体或皮层）难以辨认，可调整亮度和对比度。使用软件工具栏，点击 图像 | 调整 | 亮度/对比度，根据需要向左拖动 最大值 滑块以增强组织可见性。
注意：为避免分析过程中产生错误测量结果，请勿应用此设置，而应直接进入下一步。 - 使用 矩形工具，在皮层或海马体中选择感兴趣区域。使用工具栏并点击 编辑 | 选区 | 指定，将高度和宽度更改为预设值。调整矩形框，使其完全被组织覆盖。将亮度/对比度重置，恢复至原始状态。
注意：用于选择感兴趣区域的矩形框尺寸必须在所有图像中保持一致。在本次分析中，矩形框尺寸为 300 像素 × 300 像素（相当于 1177 µm × 1177 µm）或 400 像素 × 200 像素（相当于 1569 µm × 784 µm）。 - 通过右键单击矩形框并选择 复制，复制所选的感兴趣区域。一个包含所选区域的新窗口将打开。将复制的图像重命名，以标明其所在区域（例如皮层或海马体）。
- 使用工具栏点击 图像 | 类型 | 8位，将复制的 RGB 图像转换为 8 位图像，以便更好地分析斑块。通过点击 编辑 | 反相 对图像进行反相处理。
- 为测量 6E10 阳性区域，请进入 图像 | 调整 | 阈值。通常情况下，阈值方法 下的预设滤波器可通过将最强信号以红色高亮显示，获得理想结果。
注意：最佳阈值的选择取决于图像背景和染色强度。应选择能够识别染色信号而排除背景的阈值设置。 - 选择合适的阈值后，点击 应用。
- 为分析 6E10 阳性区域，请使用工具栏并点击 分析 | 分析颗粒，确保勾选了"汇总结果"选项。
- 点击 编辑 | 复制，复制软件生成的包含 面积百分比（%Area） 的 汇总 结果，并粘贴至先前创建的 Excel 文件中，对应标注相应标签。
- 对组织中的不同区域重复步骤 5.3–5.12。确保每个图像中用于勾画感兴趣区域的矩形框位置保持一致。
注意：若因组织曲率导致 矩形工具 的尺寸无法适配指定区域，可使用旋转工具进行调整。 - 为旋转矩形框，请使用工具栏并点击 编辑 | 选区 | 旋转，根据需要调整旋转角度。按照步骤 5.7 所述复制图像，并使用工具栏点击 编辑 | 清除外部，清除指定矩形框外的 6E10 染色信号。随后继续执行上述步骤 5.8。
结果
本文比较了两种不同的方法，用于定量小鼠脑组织海马和皮层中6E10阳性区域。这两种方法分别为全区域分析和感兴趣子区域分析（图1）。顾名思义，全区域分析是指勾画出整个感兴趣区域（本例中为同型皮层或海马）以测定6E10阳性区域（图1A、B）；而感兴趣子区域分析则是在感兴趣区域内选择一个预定义的子区域来测定6E10阳性区域（图1C、D）。两种方法的逐步ImageJ操作流程分别如图2、图3和图4所示。
本研究共使用了三名阅片者；其中两名独立阅片者进行感兴趣亚区分析，第三名阅片者进行全感兴趣区分析。如图5A、B所示，进行感兴趣亚区分析的两名阅片者所报告的6E10阳性区域之间存在显著的强正相关性（p < 0.0001）（皮尔逊相关系数在皮层中为r = 0.97，在海马中为r = 0.96）。两名阅片者在感兴趣亚区分析中报告的6E10阳性区域取平均值后，该平均的感兴趣亚区6E10阳性区域与全感兴趣区分析所得的6E10阳性区域在皮层（皮尔逊相关系数r = 0.96；图5C）和海马（皮尔逊相关系数r = 0.95；图5D）均表现出显著的强正相关性（p < 0.0001）。全感兴趣区分析与感兴趣亚区分析所得的皮层和海马6E10阳性区域平均值相近，差异无统计学意义，证实了两种方法之间的一致性（图5E）。此外，在部分小鼠的全脑匀浆样本中测定了不溶性Aβ1-42水平，全感兴趣区分析所确定的皮层（图5F）和海马（图5G）6E10阳性区域与ELISA法检测的不溶性Aβ1-42负荷量之间均存在显著相关性（p < 0.01）（参见材料表）。
图1：全区域与感兴趣亚区域的选择对比。代表性图像显示了用于全区域兴趣分析的完整同型皮层（皮层）和海马体轮廓，分别如（A）和（B）所示。代表性图像还展示了用于亚区域兴趣分析的皮层和海马体亚区域的选择，分别如（C）和（D）所示。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：全目标区域6E10阳性面积定量分析方案。 图像分析步骤显示原始图像（A）、亮度/对比度调整后的图像（B）、目标区域选择（C）、背景清除（D）、阈值调整（E）以及最终可用于分析的图像（F）。图中数字对应于方案中的步骤编号。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：6E10阳性区域兴趣子区域定量分析方案。 图像分析步骤，依次显示原始图像（A）、亮度/对比度调整后的图像（B）、选定感兴趣区域（C）、复制感兴趣区域图像（D）、将图像转换为8位并进行图像反相（E）、阈值调整（F），以及最终可用于分析的图像（G）。图中标注的数字对应于方案中的步骤编号。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：感兴趣区域旋转的操作流程。 图像分析步骤显示了感兴趣区域的选择，以及旋转选框以匹配组织曲率（A）；复制后得到的感兴趣区域图像（B）；以及清除外部（非感兴趣区域）区域后的图像（C）。图中数字表示操作流程中的步骤编号。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：全区域与亚区域感兴趣区分析之间的相关性。 散点图显示了两位独立阅片者对皮层（A）和海马（B）进行感兴趣亚区域分析时，6E10阳性面积之间的一致性。在皮层（C）和海马（D）中，感兴趣亚区域分析所得的6E10阳性面积与全区域感兴趣区分析结果之间均表现出强烈的正相关性。皮层和海马中，全区域感兴趣区分析与亚区域感兴趣区分析所得的平均6E10阳性面积之间无统计学显著差异（E）。使用ELISA法检测全脑匀浆中不溶性Aβ1-42水平，其与皮层（F）和海马（G）的全区域感兴趣区分析结果之间均存在显著相关性。数据采用图形与统计学软件进行分析，(A–D) 和 (F–G) 使用皮尔逊相关系数 r，(E) 使用双因素重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA）。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示，(E) 中 n = 35 只小鼠；双尾 p < 0.05 被认为具有统计学显著性。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文所述方案概述了半脑制备以进行矢状切片、使用6E10抗体对游离切片中的Aβ沉积物进行免疫荧光染色、对染色后的Aβ脑切片进行成像，并利用图像分析软件定量小鼠脑组织皮层和海马区Aβ沉积物的操作流程。尽管已有文献报道用于定量脑组织切片中Aβ负荷的方案8,10，本方案进一步详细描述了在需要时，对整个同型皮层（以下简称皮层）和海马区的Aβ负荷进行定量，同时与皮层和海马区内特定感兴趣区域的Aβ负荷进行比较的步骤。此外，还提供了全区域与感兴趣子区域分析结果之间的相关性数据。
本方案中有若干关键步骤。首先，本方案所述内容适用于厚度为 20 µm 的脑组织切片进行游离漂浮式免疫染色，该方法可实现抗体在组织切片内的最佳渗透18。游离漂浮技术可能需要在免疫荧光染色过程中手动将组织切片在不同溶液之间转移，因此在整个操作过程中必须小心处理组织切片。这一点在当前方案中尤为关键，因为组织切片需浸入 70% 甲酸溶液中进行抗原修复，这会增加薄切片的组织脆性。替代本方案所述方法的其他策略包括使用较厚的组织切片（例如 30–40 µm），或在免疫荧光染色前将组织切片直接贴附于带正电荷的载玻片上。其次，本方案中使用的是荧光标记的 6E10 抗体。除荧光标记的 6E10 抗体外，也可使用非荧光标记的 6E10 抗体（例如辣根过氧化物酶偶联的 6E10 抗体）来检测脑组织切片中的 Aβ 负荷，且当前方案可参照先前描述的方法进行调整，以定量分析脑组织切片中 Aβ 阳性的免疫化学染色8。第三，Aβ 负荷定量结果的准确性取决于分析软件中阈值的合理选择，而阈值的选择受组织背景和信号强度的影响。阈值的设定必须由最终使用者完成，以确保仅将 Aβ 阳性染色区域纳入定量分析。最终使用者需进行干预，优化适用于所有图像的特定阈值，以保证阈值设定的准确性。第四，由于感兴趣亚区分析需要在组织切片中选择较小的感兴趣区域，本研究采用了两名独立的分析人员进行该分析。为在数据采集过程中保持独立性和盲法，所有图像均采用数字编码；图像分析顺序在分析人员之间随机化，确保不同分析人员在任一时间点分析不同的图像，并于每周结束时提交数据。由于在感兴趣亚区分析中，不同分析人员在感兴趣区域选择上更易出现差异，因此在开始数据采集前，分析人员需通过多个示例图像进行培训，以优化皮层和海马区的区域选择。该培训对于降低分析人员间的变异至关重要；如（图 5A、B）所示，在本研究中，两名分析人员报告的 6E10 阳性区域显示出高度的一致性。
当前方案及结果提供了有关感兴趣区域大小对Aβ阳性区域定量影响的重要信息。较大的感兴趣区域相较于较小的感兴趣区域更能代表组织整体情况。因此，为准确量化组织中的Aβ负荷，宜采样较大范围的组织。然而，当组织内Aβ负荷分布均匀时，通常认为较小的采样区域也能良好代表所分析的大范围组织。本研究结果证实了这一点，全皮层和海马的Aβ负荷与所选皮层及海马亚区的Aβ负荷具有强相关性（图5C，D）。为进一步验证全区域与亚区分析结果的一致性，比较了皮层和海马中6E10阳性区域的平均值，发现两种方法之间无显著差异（图5E）。这表明这两种方法（全区域或亚区分析）所得的Aβ负荷测量结果具有可比性。
当前方案存在一些局限性。两种方法（全区域与亚区域分析）可能并不总是可以互换使用。选择全区域或亚区域分析取决于组织内Aβ的区域分布情况，而该分布受阿尔茨海默病小鼠模型的年龄、性别和品系影响。在13个月时，APP/PS1小鼠的皮层和海马中均有广泛的Aβ负荷分布。然而，在6个月时，Aβ沉积主要局限于皮层，海马中仅观察到极少的沉积12。在此类情况下，全区域感兴趣区分析可能是更理想的方法，因其可增加组织取样面积，从而增强Aβ信号。另一方面，当研究关注特定脑区的Aβ负荷时（例如体感皮层），亚区域分析可能是首选方法。此外，在13个月时，APP/PS1雄性小鼠表现出强烈的6E10阳性染色，免疫荧光染色结果具有优异的信号强度和极低的背景，使得当前方案在给定条件下非常适合定量分析。目前尚不清楚该定量方法是否能成功应用于染色强度较弱的情况，未来还需进一步研究来回答这一问题。本文所介绍的免疫荧光及图像定量方法可检测所有形式的Aβ，包括前体形式13。因此，如果需要检测特定Aβ亚型（例如Aβ1-40或Aβ1-42），可使用针对这些Aβ异构体的特异性抗体。因此，尽管6E10免疫荧光染色与通过ELISA法测定全脑匀浆中Aβ1-42含量的结果具有相关性（图5F、G），但相关性仅为中等程度。这可能是由于ELISA仅检测Aβ1-42，而6E10免疫染色则可检测所有Aβ亚型所致。本研究采用三名阅片者来评估全区域与亚区域分析之间的一致性和相关性。增加阅片者数量可能提高研究的稳健性，并进一步验证本研究所提出的两种方法之间的一致性。此外，我们采用Pearson相关系数作为一致性评估指标，该方法在描述连续变量间一致性方面被广泛使用19。然而，使用Pearson相关系数评估一致性的一个局限性在于，尽管两种方法可能提供相关的结果，但由于系统性偏差，其中一种方法的整体数值可能始终高于另一种。因此，Pearson相关系数是衡量相对一致性的一个良好指标19。为了增强方案的稳健性，可结合其他方法来验证绝对一致性，例如比较两种方法测得的6E10阳性区域的平均值（图5E）19。综上所述，本方案比较了通过免疫荧光染色检测到的Aβ负荷，并对脑组织切片中的全区域和亚区域感兴趣区进行了分析。结果表明，在来自13月龄APP/PS1雄性小鼠（其脑组织中存在大量Aβ沉积）的脑组织切片中，这两种方法之间具有高度相关性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家衰老研究所，项目编号为 R01AG062840（授予 RKS）和 R01AG072896（授予 RKS）。本内容的全部责任由作者承担，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。本项目约使用了20万美元（占总经费100%）的联邦资金。我们还要感谢 Joshua Yang 博士在稿件编辑方面的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国 | 339650 | |
| 24孔板 | 美国新罕布什尔州费舍尔科学公司 | FB012929 | |
| 人源淀粉样蛋白β 42 ELISA试剂盒 | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国 | KHB3441 | |
| 水性封片介质 | 美国加利福尼亚州，Vector 实验室 | H-5501-60 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigmaaldrich，密苏里州，美国 | A2153-50G | |
| BZ-X710 Keyence 一体式荧光显微镜 | Keyence，伊利诺伊州，美国 | BZ-X710 | |
| 透明指甲油 | 用户偏好 | NA | |
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国 | Leica CM1860 冷冻切片机 | |
| 甲酸 | Sigmaaldrich，密苏里州，美国 | F0507-500ML | |
| 玻璃盖玻片 | 美国宾夕法尼亚州 VWR | 48393-081 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software，加利福尼亚州，美国 | 版本 8 | |
| ImageJ 1.51k | 美国马里兰州国立卫生研究院 | 版本 1.53e | |
| 小鼠 | 美国缅因州杰克逊实验室 | 034829-JAX | |
| 多聚甲醛 | Sigmaaldrich，密苏里州，美国 | P6148-500G | |
| 基于苯妥英/戊巴比妥的麻醉剂（Euthasol） | Patterson Veterinary，马萨诸塞州，美国 | 07-805-9296 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific NH，美国 | BP661-50 | |
| 载玻片（+） | Ted Pella, Inc.，加利福尼亚州，美国 | 260100 | |
| 一抗（6E10） | Biolegend，加利福尼亚州，美国 | 803013 | |
| 蔗糖 | Sigmaaldrich，密苏里州，美国 | 47289 | |
| Triton X-100 | Sigmaaldrich，密苏里州，美国 | T8787-100ML |
参考文献
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