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使用Theiler's小鼠脑脊髓炎病毒建立感染性病因癫痫模型

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DOI：

10.3791/63673

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2022年6月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

本文内容

摘要

在C57BL/6小鼠中通过脑内感染鼠脑心肌炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus, TMEV）可复制出人类病毒性脑炎及其继发癫痫的许多早期和慢性临床症状。本文描述了TMEV模型的病毒感染过程、症状表现及组织病理学特征。

摘要

癫痫的主要病因之一是中枢神经系统（CNS）感染；大约8%的此类感染幸存患者会继发癫痫，而在经济欠发达国家，这一比例显著更高。本文概述了感染性病因癫痫的建模方法，并介绍将其作为新型抗惊厥化合物测试平台的应用。文中提供了一种在C57BL/6小鼠中通过非立体定位脑内注射Theiler's murine encephalomyelitis virus（TMEV）诱导癫痫的实验方案，该模型可重现人类病毒性脑炎及其继发癫痫的多种早期和慢性临床症状。本文描述了在脑炎期间对小鼠进行临床评估的方法，以监测惊厥活动并检测新型化合物可能的抗惊厥效应。此外，还展示了病毒性脑炎和惊厥引起的组织病理学后果，如海马损伤和神经炎症，以及长期后果如自发性癫痫发作。TMEV模型是首个可转化的、由感染驱动的实验平台之一，可用于研究中枢神经系统感染后癫痫发生发展的机制，因此也可用于识别在中枢神经系统感染后有癫痫风险患者的潜在治疗靶点和化合物。

引言

病毒性脑炎的常见后果之一是癫痫发作。许多病毒感染会在感染急性期引发症状性癫痫发作；在普通人群中，此类发作的风险增加超过20%1,2,3。感染后存活的患者在感染后的数月到数年间，发展为慢性癫痫的风险也增加，约为4%–20%1,4。Theiler小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）已被确定为研究病毒性脑炎小鼠模型中急性和慢性癫痫发作的合适病毒5,6,7。TMEV是一种无包膜、正链单股RNA病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae），传统上用于研究SJL小鼠脊髓中的脱髓鞘病变，而C57BL/6（B6）小鼠则因能在感染后迅速清除病毒而对此具有保护作用。然而，TMEV在感染后第一周内可诱导50%–75%的雄性和雌性B6小鼠出现急性癫痫发作，而约25%–40%的小鼠在感染后数周至数月发展为慢性癫痫2,5,6,8,9。除了癫痫发作外，这些小鼠还表现出癫痫海马常见的组织病理学特征，包括神经元变性和胶质增生5,6,8,10,11,12。此外，TMEV感染的B6小鼠在学习和记忆行为学测试中表现显著下降，并伴有认知共病，这与临床癫痫患者的表现一致13,14,15。

传统上，癫痫和发作模型通常采用化学致痫物质或电刺激来诱导发作；然而，这些模型缺乏结构效度，且常常表现出比临床患者更为严重的发作和脑损伤16。目前尚无一种模型适用于所有研究问题17。如果研究目标是探索中枢神经系统感染后发作发展的易感因素，或筛选化合物的抗发作效能，则使用TMEV模型尤为有意义。

由于TMEV模型已在国际上多个不同的实验室建立并使用，作者们总结出许多有助于成功实施该模型的细节，例如不同病毒株和小鼠品系的特异性。最可靠的癫痫发作诱导效果是通过使用TMEV的Daniel's株与B6J小鼠实现的2,5,6,8,9。目前，美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）已将该模型作为平台，用于筛选抗癫痫和抗惊厥的新药18,19。本文提供了病毒诱导及临床监测的详细实验方案，以便其他研究人员能够利用这一病毒性脑炎模型，进一步深入理解疾病机制，并开展药物测试研究。

以下方案基于在此模型中进行化合物测试的研究设计，尽管也可开展多种其他类型的研究。小鼠在右侧半球颞区（右眼后内侧）注射Daniel株TMEV前会短暂麻醉。根据研究问题的不同，若需要非感染性对照动物，则小鼠注射无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，含KH2PO4 [1.06 mM]、NaCl [155.17 mM]和Na2HPO4·7H2O [2.97 mM]）代替TMEV。既往在TMEV感染小鼠中的经验表明，由操作诱发的癫痫发作通常出现在感染后第3至第7天。实验化合物的给药频率、给药途径及测试时间因其性质而异。建议在周五进行病毒接种，以便在接下来的一周（周一至周五）完成第3至第7天的癫痫发作监测。在癫痫发作监测期间，除非化合物的药代动力学或作用机制另有建议，实验化合物可每天腹腔注射两次（每次间隔至少4小时）。治疗期间的癫痫发作监测可在预先确定的时间点进行。注射和观察时间根据具体化合物而有所不同。动物被注射待测化合物或作为药物替代的溶媒。这两个对照组的处理和观察方式可与实验组保持一致。实验过程中，负责操作小鼠并评估癫痫发作的人员应对治疗分组情况设盲。

方案

所有描述的实验程序均已获得相应机构的批准。动物饲养和使用遵循《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会）的建议，并符合美国公共卫生服务部政策以及犹他大学机构动物护理与使用委员会（动物实验方案编号：21-11009，药理学与毒理学系）和柏林自由大学（实验方案编号：G0015/21，柏林健康与社会事务局，药理学与毒理学研究所）的相关规定。图 3 和图 5 所示结果已获下述许可：33.9-42502-04-11/0516 和 33.9-42502-04-15/1892（德国奥尔登堡州动物福利与兽医事务局，汉诺威兽医大学药理学、毒理学与药物学系）。

1. 研究设计的考虑与准备工作

  1. 病毒
    1. TMEV 的 Daniel 株由犹他大学的 Robert Fujinami 惠赠。最初，该毒株分离自哈佛大学动物群中的一只小鼠20。在操作 TMEV 前，请查阅各国关于生物制剂的具体分类和管理规定，并与所在机构的生物安全管理人员沟通，确保符合相关法规要求。通常情况下，TMEV 被归类为 BSL 2 级，具体等级取决于毒株类型及是否经过基因改造。诱导大多数动物出现癫痫发作的标准剂量为 3 × 105 斑块形成单位（PFU）。
      注：若使用转基因小鼠，剂量可能需要调整。总体而言，已有研究成功使用 2 × 104 PFU 至 2.44 × 107 PFU 范围内的滴度诱导癫痫发作。对照组动物接受无菌 PBS 处理，不会出现癫痫发作。该病毒不感染人类；但实验人员应始终穿戴个人防护装备（实验服、手套、护目镜），小鼠尸体和垫料在丢弃前须经高压灭菌处理。
  2. 动物
    1. 为诱导和研究癫痫发作，应使用 B6J 小鼠，因为其他品系的小鼠不一定表现出癫痫发作，例如 SJL/J、FVB/N 或 Balb/c 小鼠5。在急性癫痫发作频率方面，雌性和雄性小鼠之间无显著差异5。实验应在青春期至成年期的小鼠中进行（起始年龄为 5–6 周龄）。
  3. 饮食
    1. 饮食已被确认为不同实验室间疾病严重程度差异的来源之一；因此，应将饮食视为可能导致变异的潜在因素22。
  4. 分组规模
    1. 由于并非所有动物在此模型中都会发展出急性或慢性癫痫发作，因此在进行化合物测试时，建议每组使用约 20 只小鼠。
  5. 动物福利
    1. 若任何小鼠在感染或给予试验化合物后表现出明显不良反应（如嗜睡、毛发凌乱、伤口明显红肿或化脓性分泌物），并在本地 IACUC 指南规定的观察期（例如 48 小时）内未见改善，应实施人道安乐死。
    2. 在感染期间，若小鼠出现极端体重下降（>20%），应实施人道安乐死。
    3. 若动物进食不良，应提供湿润的补充饲料颗粒，并用儿科电解质溶液或类似物浸润以利于摄取。

2. 病毒接种

  1. 注射器的灭菌
    1. 取下胰岛素注射器的针帽。在针头周围加装聚乙烯管作为套环，以确保注射深度为 2.5 mm。将注射器浸入乙醇中 30 分钟。随后将注射器置于紫外线下照射 30 分钟。
    2. 将针帽重新盖回针头。用灭菌袋包裹注射器，并用胶带封口。标注制备日期。
  2. 病毒注射
    1. 从 −80 °C 冰箱中取出 Daniel 株 TMEV 的分装样品。将病毒溶液融化并置于冰上保存。避免反复冻融病毒。用病毒悬液（3 × 105 PFU 溶于 20 µL PBS 或 DMEM 培养基中）填充注射器。
      注意：该病毒对小鼠具有感染性，但对人类无感染性。
    2. 用消毒剂清洁实验台面，并在通风橱内操作。病毒接种无需无菌条件，但应尽可能保持清洁。
    3. 将小鼠转移至麻醉诱导舱中，使用 2% 异氟烷与氧气混合气体进行麻醉诱导。达到手术耐受水平需数分钟；根据动物的呼吸频率和麻醉深度调整异氟烷浓度。
    4. 将已麻醉的小鼠从麻醉舱转移至通风橱下。检查手术耐受状态，例如通过脚趾夹捏反应判断。整个注射过程应在 30 秒内完成，因此注射期间无需持续吸入异氟烷。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
    5. 用酒精棉片清洁动物头部。将小鼠头部轻微向左倾斜，使注射部位朝上。
    6. 向后轻拉皮肤，将针头插入头部，在右半球颞区（右眼后内侧）以 2.5 mm 深度进行 20 µL 的皮层内注射。
    7. 在所有动物中均单侧同一半球进行注射。以眼睛和耳朵作为顶叶皮层定位的解剖标志。此前已通过组织学方法验证过注射位点；见 图 1。根据相对于前囟的立体定位坐标为：−2.0（前后方向，AP）；+3.0（内外方向，ML）；−1.5（背腹方向，DV）。
    8. 注射后留针 5–15 秒。记录是否有液体渗漏或气泡出现；若存在此类情况，则需准备新的注射器。拔针时应缓慢轻柔地旋转针头退出。麻醉期间需再次涂抹眼膏以防角膜干燥。
    9. 可选：根据本地操作规程，在尾巴或耳朵上标记动物编号（动物处于无意识状态，操作简便）。
    10. 将动物转移至新笼子中，笼子一半置于加热垫（35–40 °C）上，以辅助麻醉恢复。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
      备注：恢复后可重新群养（感染动物不得与假感染动物混养）。感染小鼠不应与未感染小鼠饲养在同一房间内。
    11. 记录感染后前 7 天内小鼠的体重变化，因感染后可能出现体重下降，必要时需补充喂养。

小鼠脑部注射装置、神经解剖图、NeuN与TMEV标记的免疫荧光结果。
图1：TMEV注射操作示意图。从左至右：进行右侧顶叶皮层注射时，针头插入位置略偏离于同侧眼与对侧耳之间假想连线的外侧。用于控制深度的卡环以黄色标示。冠状脑切片中可见注射通路，由箭头指示。注射位点对应于箭头上方给出的坐标。右侧图像显示Theiler病毒（紫色）在海马结构CA1区内的分布情况。该图使用biorender.com制作。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 化合物测试

  1. 化合物制备
    1. 查阅配方说明。根据推荐方案或提供的说明制备溶剂溶液。以抗癫痫药物左乙拉西坦（LEV）为例，该药物在剂量为 350 mg/kg 时可将癫痫发作负担降低至溶剂对照组水平的 30%–40%。本研究中使用的溶剂为 0.5% 甲基纤维素。
    2. 根据化合物计算剂量。按照计算结果称取药物。例如，为处理 1 kg 小鼠，需称取 350 mg LEV。
    3. 根据配方说明（如超声处理、溶剂辅料等）使用适量溶剂溶液配制储备液。若注射量为每克小鼠体重 0.01 mL，则 1 kg 小鼠的注射体积为 10 mL，其中含 350 mg LEV，最终得到浓度为 35 mg/mL 的溶液19。报告计算过程、剂量（mg/kg）及注射体积（mL）。
      注：示例性方案见补充材料 1第 2 页。
  2. 化合物给药
    1. 将小鼠笼随机分配至溶剂组或化合物组。使用假感染小鼠进行癫痫发展机制研究或验证实验，但不用于常规药物筛选。
    2. 记录环境条件，如温度、湿度、给药时间等。
    3. 对含化合物的溶液及溶剂溶液进行涡旋混匀。用注射器吸取溶剂或化合物，并对注射器进行颜色编码以防止混淆。
    4. 称量动物体重。确保 B6J 小鼠在感染后第 3 天体重 >18 g（不四舍五入）。记录体重数据。
    5. 给予化合物（如腹腔注射或其他适当途径）。记录给药时间与给药途径。
    6. 给药后观察动物是否出现行为变化，尤其是首次给药后。若发生癫痫发作，按 Racine 评分标准23报告发作强度；参见步骤 3.2。
      注：补充材料 1第 3 页提供了化合物给药的示例性方案，给药期间观察到的癫痫发作记录于补充材料 1第 4–5 页。
  3. 诱发性癫痫发作的监测
    1. 由对处理分组设盲的实验人员执行该操作。将所有笼子移至操作台。在光照期每天两次观察动物是否出现癫痫发作。
    2. 采用改良 Racine 评分标准23对癫痫活动进行评分：0 = 行为无变化，1 = 口部及面部运动，2 = 点头动作，3 = 单侧前肢阵挛，4 = 双侧前肢阵挛伴直立，5 = 全身性强直-阵挛发作伴姿势张力丧失，有时伴有跳跃，6 = 持续且过度的跳跃与过度活跃。记录癫痫发作次数与强度。
    3. 用笔在笼子外侧滑动制造噪音。
    4. 将每只动物转移至另一盒子后再移回原笼。
    5. 轻轻前后晃动笼子，注意避免剧烈摇晃导致动物撞击笼壁或顶部，以防造成身体损伤。
    6. 观察笼内所有动物是否出现癫痫发作。一旦某只小鼠发生癫痫，立即将其移回原笼，并记录发作等级，不再施加噪音或操作刺激。
    7. 对于未自发发作或经轻柔晃动笼子后仍未发作的动物，可通过更强烈的操作诱发癫痫：小心抓住小鼠尾部，将其从左向右翻转。
      注：癫痫发作动物处于高度兴奋状态，可能容易跳动。
    8. 再次观察每只动物的癫痫行为表现。重复上述过程处理后续笼子。
      注：癫痫监测的示例性方案见补充材料 1第 6–7 页。
  4. 化合物效应的数据报告
    1. 采用重复测量方差分析（RM ANOVA）分析每日体重变化。
    2. 使用每日累计癫痫负担值进行数据图示化表达。以“保护动物数/测试动物总数”形式呈现药效数据（即无 Racine 3–5 级癫痫发作的动物数），通常每组 N = 20。因此，使用 Fisher 精确检验比较溶剂组与药物处理组在反应情况（发作或不发作）上的差异。
      注：若动物癫痫发作等级为 2 或更低，则视为“受保护”；若发作等级为 3–5，则视为未受保护。
    3. 以类似方式分析耐受性数据，即每组中出现行为障碍或毒性反应的动物数/测试动物总数。记录任何不良反应，包括死亡事件。
    4. 若注射溶剂的小鼠中急性发作比例低于 50%，则不采纳该组数据。

结果

化合物对急性癫痫发作的影响
若在药物注射（DI）期间或随后的上午/下午癫痫发作处理/监测期间出现行为性癫痫发作，则予以记录。处理期间观察到的癫痫发作可用热图表示，LEV（350 mg/kg）的结果如图2所示。在癫痫发作负荷分析中，以溶剂对照组在实验第7天的累积癫痫发作负荷平均值为基础，通过Mann-Whitney U检验与化合物处理组进行比较（癫痫发作负荷值包含注射后观察期间收集的数据）。对于化合物疗效的评估，采用Fisher精确检验判断溶剂组与药物处理组之间的疗效是否存在统计学差异。同样，耐受性数据也采用Fisher精确检验进行分析。体重变化分析采用重复测量方差分析（ANOVA），以评估实验过程中体重的动态变化以及化合物处理组与溶剂对照组小鼠之间的差异。

癫痫发作评分热图，小鼠给药组与对照组的比较；颜色编码强度图。
图 2：经溶剂（0.5%甲基纤维素）或左乙拉西坦（LEV，350 mg/kg）处理后小鼠行为性癫痫发作的热图。 每日两次给药，均在操作和癫痫发作观察前1小时进行。若癫痫发作发生在给药期间（DI）或随后的上午/下午操作/监测期间，则予以记录。在为期5天的观察期内，LEV（350 mg/kg）显著减少了操作期间观察到的癫痫发作（仅为溶剂组癫痫负荷的35.9%）。热图中，将癫痫发作1–3级标为绿色，4级为黄色，5级为橙色。本图基于已发表的数据集重新绘制19。 请点击此处查看本图的高清版本。

慢性癫痫
除了报道中感染后第一周的癫痫发作负担外，还有若干项读数可根据具体研究和假设选择使用。若长期饲养动物，部分感染动物将在感染后数周出现自发性癫痫发作，其发生频率低于急性发作，因此需要进行脑电图（EEG）记录。为记录小鼠的脑电图，需通过立体定位手术植入电极24。图3展示了TMEV感染小鼠慢性期通过脑电图记录到的多种癫痫事件8。

神经活动波形图、脑电图数据分析、时间序列、电信号变化。
图3：小鼠感染DA病毒后慢性期（感染后14周）典型的脑电图（EEG）记录。（A-C）未观察到行为性运动相关表现的代表性脑电事件，即（A）单个尖波，（B）尖波簇，（C）以及一次电生理记录上的、可能为局灶性癫痫发作。（D-F）伴有行为相关表现的代表性脑电事件。D图所示小鼠出现类似癫痫的事件，伴随肌阵挛性抽动（以“M”表示，伴有运动伪迹）、刻板动作（以“head press”表示，即小鼠将头部平压于地面）或行为停滞；“Scr”表示抓挠引起的运动伪迹；（E）和（F）显示全面性强直-阵挛性癫痫发作期间典型的脑电图改变：（E）一次持续22秒、频率为1 Hz的Racine 3级癫痫发作，（F）一次持续34秒、频率为5.4 Hz的5级癫痫发作。该图此前已发表8，经Elsevier许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

组织学
由于癫痫和发作通常伴随患者海马病理改变，而实验模型可重现这一特征，因此大多数实验室也会分析海马的改变，或评估潜在抗发作治疗对病理的影响。常分析的指标包括海马神经元变性与萎缩，以及通过标记特定免疫细胞群来评估炎症反应。进行此类分析时，在实验结束时，小鼠需深度麻醉直至呼吸停止且心率显著减慢或出现心律失常。随后通过心脏灌注磷酸盐缓冲液（PBS）清除血液，再灌注4%多聚甲醛（PFA）25以固定组织。组织经冷冻切片和（免疫）染色处理26后，进行显微镜下分析。

显示 PBS 和 TMEV 作用的小鼠脑组织学图像；包括海马结构及分析图。
图 4：感染 TMEV 的癫痫小鼠海马变性。 （A，B）甲酚紫染色的冠状切片显示（A）对照组（PBS）小鼠具有正常的细胞结构，而（B）TMEV 感染小鼠在感染后 2 个月出现海马变性。注意：侧脑室扩大、alveus 塌陷以及锥体细胞层变薄。（C）对损伤的定量分析显示，与 PBS 小鼠（N = 6）相比，TMEV 小鼠（N = 7）的海马面积显著减小，同时脑室面积显著增加（数据以均值 ± 标准误表示；p < 0.001；Student t 检验）。（D，E）NeuN 标记进一步展示了感染后 6 个月取材切片中神经元细胞丢失的程度。箭头指示完全缺失锥体细胞的区域。（E）即使在癫痫小鼠中，齿状回似乎仍相对完整。比例尺 = （A，B）2 mm；（D，E）0.5 mm。该图此前已发表6，经牛津大学出版社许可重印。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学显微照片、免疫组织化学、脑组织、染色模式、显微镜分析。
图5：感染后7天急性脑炎导致T细胞浸润程度不同的代表性显微照片。 连续切片包含同侧背侧海马，使用抗CD3抗体进行染色以标记T淋巴细胞。(A,D) 假感染动物中未出现T细胞浸润的正常海马。(B,E) 多数TMEV感染小鼠中可见的中度T细胞浸润。(C, F) 仅在部分感染小鼠中观察到的严重T淋巴细胞浸润。该图此前已发表8，经Elsevier许可转载。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件 1：本补充文件包含在 TMEV 模型中进行化合物测试所使用的表格。第 1 页概述了实验设置。化合物、溶剂及化合物溶液配制的相关信息记录在第 1–2 页。化合物给药记录在第 3 页。第 4–5 页的评分表用于记录由执行化合物注射的实验人员观察并量化的小鼠惊厥情况。第 4 页可记录 4 个笼子（每笼 5 只小鼠）的数据，第 5 页可记录第 5–8 个笼子的数据，这是我们常规进行化合物测试的标准动物数量。第 6–7 页的评分表由盲法观察者使用，该观察者在每次化合物注射后 1 小时进行观察、操作及轻柔摇晃笼子。在这两份示例评分表上，总共可记录八个笼子的惊厥评分。最后一页（第 8 页）可用于记录其他任何观察结果或备注。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

这是首个基于感染的啮齿类动物癫痫模型，可用于研究急性与慢性癫痫发作的发展过程。该模型将有助于针对癫痫最常见病因之一，发现药物作用靶点以及用于疾病预防或干预的新化合物。

如上所述，可能需要仔细考虑病毒批次和滴度，以确保接受TMEV处理的小鼠中有足够比例出现由操作诱发的癫痫发作。如果动物的癫痫发作次数少于正常情况，应使用20只动物（N = 20）的批次来验证病毒的有效性。如果其活性降低（低于50%），则应制备新的分装样品并用20只动物（N = 20）进行测试。如果新分装的样品效率未提高，则应纯化新的病毒批次。对于某些转基因小鼠品系，可能需要使用较低的病毒滴度；因此，在初步实验后应根据需要对病毒滴度进行稀释。目前关于B6 小鼠的大多数数据来源于杰克逊实验室（美国缅因州巴港或德国苏尔茨费尔德查尔斯河实验室）；然而，从德国艾斯特鲁普哈兰实验室（Harlan）获得的B6 小鼠也已证实具有相似的癫痫发作率8。具有B6遗传背景的转基因动物的癫痫发作率与野生型B6小鼠相当，但如果遗传改变影响病毒侵袭、炎症反应或神经退行性变，则可能有所不同21。急性癫痫发作可自发出现，但常由操作和噪音诱发，因此在比较癫痫发作率时，以相似方式处理所有动物至关重要。既往研究表明，每天两次的操作可导致较高的癫痫发作负荷，并在感染后第3至7天有更高比例的小鼠出现癫痫发作6,8,19。此外，也可在第1天和第2天增加操作次数，以提高癫痫发作负荷。同时，可在每次操作前观察动物，确保未发生自发性癫痫发作。例如，嘈杂的实验室环境可能诱发癫痫发作，进而导致动物在测试期间对操作诱发的癫痫发作产生耐受性。

尽管TMEV感染会在大多数小鼠中引发由抓握操作诱发的癫痫发作，但目前尚不清楚为何部分动物对此处理具有抗性。如上所述，可能存在脑电图记录的癫痫发作（伴随极少或无明显行为表现），但由于缺乏同步的脑电图记录，这类发作通常未被量化。此外，注射位点的微小差异可能导致病毒在脑内的作用减弱；然而，由于该病毒对海马具有趋向性，已有研究报道在皮层和纹状体感染后仍可出现癫痫发作5,6,8,9。在此模型中进行药物筛选研究时，若需识别癫痫发作的减少（例如癫痫负担减少50%），每组需要更多的动物数量（例如，N = 20）。此外，该模型中癫痫行为的变异性要求药物组与对照组之间的效应差异足够大，才能检测到显著的癫痫发作减少。因此，该模型的一个局限性在于需要较大的样本量。尽管如此，足够大的样本量仍可使该模型有效识别出抗癫痫和抗炎作用19。

在此模型中，绝大多数可观察到的癫痫发作发生在急性感染期。尽管经TMEV处理的小鼠会出现海马变性、免疫细胞活化以及认知功能障碍，但最终仅有少数动物发展为慢性自发性癫痫发作。这种总体较低的癫痫发作负担需要使用大量感染小鼠才能对此模型中的自发性癫痫发作进行充分研究，而这超出了许多项目的范围和能力。植入深部电极和进行脑电图（EEG）监测还会增加实验动物的负担。虽然深部电极可能有助于识别自发性癫痫活动，但感染后海马解剖结构的变化可能使电极定位的一致性成为挑战。

迫切需要找到癫痫的新治疗方法，这要求建立可用于快速筛选抗惊厥疗效的模型。该模型具备应对这一迫切需求的特性。此外，由于该模型无需任何立体定向手术，因此非常适合用于抗惊厥化合物的研究，且操作简便。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

SB 获得了柏林自由大学启动资金的支持。KSW 获得了 R37 NS065434 和 ALSAM 基金会的支持。LAB 获得了 D-SPAN 奖项 1F99NS125773-01 的支持。我们感谢罗伯特·藤波博士（Robert Fujinami, Ph.D.）为我们提供 Theiler 病毒，以及犹他大学细胞成像核心设施在显微镜技术支持方面的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸水纸--任何
分析天平Mettler Toledo（美国俄亥俄州哥伦布市）302165420.1 mg–220 g 
动物平衡奥豪斯（美国新泽西州帕西帕尼）STX22020.01 g–2200 g 
BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器BD（密西沙加，安大略省，加拿大） BD329461Lo-Dose 无菌注射器，带永久性 BD Micro-Fine IV 针头 - 1 mL
TMEV 的 Daniel 毒株由 Robert Fujinami（犹他大学）惠赠-3 × 105 斑块形成单位 分装样本（份）
消毒剂，例如 VennoVet 1 superMenno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH，德国-校园兽医推荐，酒精含量小于或等于5%
Fisherbrand 中号无菌酒精消毒垫 C7 Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）22-363-750
FlurisoVETone（美国爱达荷州博伊西）502017异氟烷 250 mL，2%–5%
烟雾吸收器 Labconco（美国密苏里州堪萨斯城）--
通用防护一次性SMS白色实验服  赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）17-100-810A
GraphPad Prism 版本 9 （美国加利福尼亚州拉霍亚）
冰桶--任何
Microsoft Excel Microsoft （美国华盛顿州雷德蒙）
Microsoft Word Microsoft （美国华盛顿州雷德蒙德）
小鼠笼具--任何至少饲养5只小鼠的笼子
PrecisionGlide 针头 BD（加拿大安大略省密西沙加）329652BD滑动式针头精密滑动针胰岛素注射器 - 26 G × 3/8 - 0.45 mm × 10 mm
自封灭菌袋 Fisher Scientific（美国纽约州汉普顿）NC9241087 12.6 x 25.5 厘米
小型玻璃烧瓶--任意，体积 25 mL
无菌 PBS赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）10010056
搅拌子卡尔·罗斯有限责任公司 & CO. KGX171.1根据溶液体积确定尺寸
磁力搅拌器卡尔·罗斯有限公司 & CO. KGAAN2.1
注射器鲁尔锁BD（加拿大安大略省密西沙加）309628仅使用1 mL注射器
超声波清洗器，加热器/机械定时器Cole-Parmer（美国伊利诺伊州弗农山）EW-08895-23浴式超声波清洗器 - 0.5 加仑，115 伏特
溶剂对照液--取决于化合物溶剂
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参考文献

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369(2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).

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