研究清除大脑中星形胶质细胞和神经元之间的空间相互作用

摘要

使用CLARITY方法结合病毒载体转导和大脑清除，可以同时研究大量神经元和星形胶质细胞。

摘要

使用CLARITY方法将病毒载体转导和组织清除相结合，可以同时研究几种类型的脑细胞及其相互作用。病毒载体转导能够在同一组织内以不同的荧光颜色标记不同的细胞类型。细胞可以通过活动或投射进行遗传识别。使用改进的CLARITY方案，星形胶质细胞和神经元的潜在样本量增加了2-3个数量级。CLARITY的使用允许对完整的星形胶质细胞进行成像，这些星形胶质细胞太大而无法将其全部放入切片中，并检查体细胞及其所有过程。此外，它还提供了研究星形胶质细胞与不同神经元细胞类型之间的空间相互作用的机会，即每个星形细胞域中锥体神经元的数量或星形胶质细胞与特定抑制神经元群体之间的接近程度。本文详细介绍了如何应用这些方法。

引言

近年来，星形胶质细胞功能以及它们如何与神经元回路相互作用的知识急剧增加。星形胶质细胞可以影响可塑性^1，2，帮助神经元损伤后恢复^3，4，甚至诱导 从头 神经元增强，最近的研究表明星形胶质细胞在记忆获取和奖励中的重要性，以前被认为是纯粹的神经元功能^5，6，7.星形胶质细胞研究中特别感兴趣的一个特征是细胞的空间排列，其在海马体和其他大脑结构中保持独特的空间组织^8，9，10。与在细胞体瘤之间交织的神经元树突不同，海马星形胶质细胞栖息在视觉上可区分的区域，其过程之间略有重叠，形成不同的结构域^{8，11，12，}

方案

实验方案由希伯来大学动物护理和使用委员会批准，并符合国家卫生研究所实验室动物护理和使用指南的指导方针。

1. 病毒载体转导

注意:病毒载体转导用于表达大脑中的荧光团。

1. 使用图集（例如，Allen Brain Atlas）来定位目标区域的相关协调。
   注意:3D地图集可以在线找到（例如，http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer）。
2. 使用立体定向手术，将病毒载体注射到相关的大脑结构中。有关详细协议，请参见⁹ 。
3. 等待3-6周以进行荧光基团表达。
   注意:如果只需要标记细胞体，则短时间就足够了。如果轴突投影与该问题相关，则需要很长一段时间，因为荧光团以轴突表达需要更长的时间，轴突可能长达几毫米。
4. 事先验证荧光团表达（病毒表达和TG动物）的特异性和外显率（图1A）。在进行CLARITY程序之前，为薄片指定至少一个大脑，并确保荧光团表达既强又特定于靶细胞特征。

2. 清晰度

注意:这种方法在2-6周内使大脑透....

结果

成功清除厚脑组织切片会导致一系列新的问题，这些问题可以询问有关大细胞群的特性，而不是单个细胞或相邻细胞群的特性。为了获得成功的结果，应该严格遵守CLARITY协议，因为需要考虑广泛的参数来减少样品之间的差异（例如，透明度百分比，荧光信息，肿胀度参数）。

图1 描述了从荧光蛋白表达验证到清除方法所有阶段的整个清除过程。 图2 描述了如何为澄清的组织准备一个腔室，最适合在双光子或共聚焦显微镜下成像。与其他腔室制备方案相比，该协议中所需的材料非常便宜。

图3 显示了 视频1中描述的立方体，其中超过300个星形胶质细胞显示在小鼠海马体CA1部分的清除部分。 图4 显示了 视频2中描述的立方体，其中星形胶质细胞和兴奋性神经元体都显示在.......

讨论

组织清除方法是大脑研究中的革命性工具，引发了以前无法提出的问题。通过靶向一小群细胞，单个细胞甚至单个突触的特性，CLARITY现在可以通过使用相关的荧光团来靶向总细胞群或远距离连接特征。

荧光基团表达和CLARITY程序组合的结果不是二元的;许多因素可能会干扰导致次优结果的程序。首先，荧光基团的表达必须事先验证。由于CLARITY程序会导致一些信息丢失，因此在CLARITY过程结束时，足够的荧光团蛋白表达对于图像的有效性至关重要。其次，必须小心处理经颅灌注，确保所有血液都流出大脑，因为血液的自发荧光会导致厚片中数据不可靠。第三，方案中讨论的所有参数必须在清除过程的每个步骤中精确地处理，例如，聚合前HS中的O₂ 残基或每个阶段的温度不精确将阻止活性材料之间发生化学反应。

先前的方案^17，22 推荐在HS中使用不同浓度的丙烯酰胺。丙烯酰胺的主要目的是用胺残基（蛋白质和核酸）更好地固定分子。浓度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV1-GFAP：：TdTomato	ELSC 载体核心设施 （EVCF）		用于检测星形胶质细胞的病毒载体
AAV5-CaMKII：：eGFP	ELSC 载体核心设施 （EVCF）		用于检测神经元的病毒载体
AAV5-CaMKII：：H2B-eGFP	ELSC 载体核心设施 （EVCF）		用于检测神经元核的病毒载体
AAV5-CaMKII：：TdTomato	ELSC 载体核心设施（EVCF）		用于检测神经元的病毒载体
丙烯酰胺 （40%）	Bio-rad	#161-0140
双丙烯酰胺 （2%）	Bio-rad	#161-0142
硼酸	Sigma	#B7901	分子量 - 61.83 g/mol
共聚焦显微镜，扫描，FV1000	奥林巴斯		4x 物镜（UPlanSApo，0.16 NA）
Imaris 软件	Bitplane，英国		一种允许对图像进行 3D 分析的软件
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS#	15710
RapiClear	SunJin 实验室	#RC147002
RapiClear CS	SunJin 实验室	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass 软件			一种允许使用虚拟现实对图像进行 3D 分析的软件
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	分子量 - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
双光子显微镜	神经实验室器具		钛蓝宝石激光器（Chameleon Discovery TPC，相干公司）、GaAsP 光电倍增管（滨松，H10770-40）、带通滤光片（Semrock）、水浸 16 倍物镜（尼康，0.8 NA）
VA-044 启动器	Wako	#011-19365