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利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

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DOI：

10.3791/63685

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2022年6月9日

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1Virology Section, Department of Life Sciences, Shiv Nadar University, 2Gastroenterology, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10 kb的正义链RNA病毒基因组研究。

摘要

缺乏一种便捷的方法来迭代生成多样化的全长病毒变异体，阻碍了RNA病毒定向进化研究的进展。通过整合全长RNA基因组的易错PCR与反向遗传学技术，可诱导全基因组范围的随机替换突变。我们已开发出一种利用该技术合成多样化文库的方法，以鉴定具有特定表型的病毒突变体。该方法称为全长突变RNA合成法（FL-MRS），具有以下优势：（i）可通过高效的一次性易错PCR构建大规模文库；（ii）通过调节DNA聚合酶的保真度，可构建具有不同遗传多样性水平的文库组；（iii）生成的全长PCR产物可直接作为突变RNA合成的模板；（iv）可生成RNA，将其作为未筛选的输入池递送至宿主细胞，用于筛选具有目标表型的病毒突变体。我们通过反向遗传学方法发现，FL-MRS是一种可靠工具，可用于研究丙型肝炎病毒JFH1分离株生命周期各阶段的病毒定向进化。该技术似乎是一种不可替代的工具，可用于实施定向进化，以深入理解正链RNA病毒的适应性、复制机制、病毒基因在致病性及抗病毒耐药性中的作用。

引言

正向遗传筛选从感兴趣的病毒表型开始，随后通过测序其基因组并与原始毒株进行比较，尝试鉴定导致该表型的突变位点。相比之下，反向遗传筛选则是先在目标基因中引入随机突变，再观察所产生的表型1。在反向遗传学方法中，体外诱变（in vitro mutagenesis）是最常用的技术，用于构建变异体文库，进而筛选感兴趣的表型。目前已报道多种可用于RNA病毒全基因组随机诱变的遗传工具，包括易错PCR（ep-PCR）2,3、环状聚合酶延伸4以及Mu转座子插入诱变5,6,7。后两种方法产生的文库序列多样性有限，且容易引入较大的插入或缺失，这对病毒而言具有高度致死性，严重限制了感染性病毒变异体的获得。

易错PCR（ep-PCR）是一种广为人知且功能强大的诱变技术，广泛应用于蛋白质工程中，用于产生突变酶，以筛选具有理想特性的表型，例如增强的热稳定性、底物特异性和催化活性8,9,10。该技术操作简便，仅需常规设备，无需繁琐的操作步骤，使用市售试剂，且耗时短；此外，还能生成高质量的突变文库。

本文中，我们开发了一种全长突变RNA合成（FL-MRS）的新方法，通过整合表型错误倾向PCR（ep-PCR）与反向遗传学技术，实现丙型肝炎病毒（HCV）完整基因组的构建。ep-PCR可诱导全基因组范围的随机碱基替换突变。对于正义单链RNA病毒（[+]ssRNA），单个核苷酸的插入或缺失通常具有高度致死性；因此，基于PCR的碱基替换突变技术是构建具有较高存活率的大容量、多样性全长（+）ssRNA病毒基因组文库的首选方法。

全长突变逆转录病毒筛选（FL-MRS）是一种简单直接的方法，可通过精心设计的一组引物应用于任何基因组长度约为10 kb的正义链RNA病毒，该引物可结合病毒cDNA克隆。pJFH1是一种具有感染性的cDNA克隆，编码丙型肝炎病毒（HCV）2a基因型，能够重现病毒生命周期的全部步骤。通过采用FL-MRS方法，我们展示了可合成随机诱变的全长基因组文库（突变文库[MLs]），从而获得具有复制能力的JFH1变异体，且无需预先了解与这些突变相关的特性。在抗病毒药物作用下，部分病毒变异体迅速克服了药物压力，并表现出预期的表型改变。利用本文所述的实验方案，可生成大量病毒变异体，为研究（+）ssRNA病毒的进化提供了新的机会。

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方案

注意：本实验所用的 JFH1 野生型（WT）毒株由日本国立感染症研究所的 Takaji Wakita 惠赠。人肝癌细胞系 Huh7.5 由洛克菲勒大学的 Charles Rice 惠赠。图 1 展示了本方法的示意图。

1. 利用易错PCR对JFH1进行全基因组替代突变

  1. 为了进行表观突变PCR（ep-PCR），请准备四组实验的预混液，所用引物为J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' 和 J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC-3'（图1A），以及文中所述的反应组分 表1 不含pJFH1质粒模板（从JFH1株分离的质粒）。
  2. 将主混合液分装至四个试管中，分别向各管加入100 ng、50 ng、25 ng和10 ng的模板，并将反应总体积调整至50 µL。采用如下循环条件： 表 2 扩增一个包含T7启动子和全长HCV基因组的9736碱基对（bp）片段（图2).
    注意：ep-PCR 产物必须包含 T7 启动子序列，以促进后续操作 体外 病毒基因组的转录。因此，上游引物必须位于病毒cDNA克隆T7启动子的上游，下游引物序列应终止于病毒基因组3'端，以促进转录终止。在Taq DNA聚合酶生产商推荐的范围内优化ep-PCR反应的各个组分，以实现高产量扩增。除了调整模板用量外，使用不平衡的dNTP（特别是低浓度的dATP和/或dGTP）也可增加长度为6-8 kb病毒基因组的多样性3.
  3. 通过加载等体积的PCR产物（5 µL）并使用0.8%基于Tris-乙酸-EDTA（TAE）的琼脂糖凝胶电泳，与已知量的1千碱基（kb）DNA ladders进行比较，估算ep-PCR产物的扩增情况11使用柱纯化试剂盒，按照制造商说明纯化产物。
  4. 使用微量分光光度计在260 nm处测定吸光度，以估算纯化产物的浓度12如有需要，可真空浓缩ep-PCR产物，以获得浓度≥100 ng/µL的产物。
    ​注意：通过加载ep-PCR产物的两倍系列稀释液，并将其条带强度与已知量的1 kb DNA Ladder进行比较，可获得更准确的估算结果。

2. 病毒RNA合成

  1. 设置一个40 µL反应体系，用4 U限制性内切酶消化5 µg克隆质粒pJFH1 XbaI 37 °C 下酶促反应 2 小时，随后进行柱层析纯化，并使用微量分光光度计在 260 nm 处测定吸光度12. 设置一个20 µL的反应体系 体外 使用市售的大规模RNA生产系统，按照制造商说明书对柱纯化的ep-PCR产物或克隆型pJFH1（WT）进行转录反应。
  2. 在200 µL的微量离心管中，加入约1 µg纯化的ep-PCR产物（突变文库）或 XbaI 消化后的克隆质粒pJFH1、10 µL含核糖核苷酸的2x缓冲液以及2 µL T7酶混合物。混合所有组分后短暂离心。将反应体系在37 °C孵育45分钟，随后加入1 U无RNase的DNase酶，并在37 °C继续孵育30分钟（图1C).
  3. 纯化 体外 使用RNA纯化试剂盒按照制造商说明书纯化合成的RNA，用40 µL无RNase和DNase的水洗脱，并利用微量分光光度计在260 nm处测定吸光度以估算纯化后RNA的浓度12根据需要分装（5 µg 或 2 µg），以避免反复冻融，并于 −80 °C 保存。取 2 µg RNA 进行 MOPS 变性 0.8% 琼脂糖凝胶电泳，以检测病毒转录本的完整性和大小。13 (图3).

3. 估计错误引发PCR产物（突变文库）中突变的比例

注意：在此步骤中，通过亚克隆第2步获得的产物，估算核苷酸发生突变的比例，以证明采用错误倾向PCR（ep-PCR）构建遗传异质性的优势，所用材料包括两个全基因组突变文库（ML50和ML25）以及克隆来源的pJFH1病毒RNA。本研究中突变比例的估算针对HCV NS5A基因进行，该基因同时也是本研究的表型读出基因（药物抗性）。

  1. 按照制造商的建议，通过添加约 1 µg 第 2 步中合成的病毒 RNA、5 µM 反向引物 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' 以及 200 U 逆转录酶，配制 20 µL 的 cDNA 合成反应体系。
  2. 以 cDNA 为模板，扩增包含完整 NS5A 基因的 2571 bp 片段。为此，配制一个总反应体积为 50 µL 的反应混合液，其中包含 0.5 µM 的 5272F 和 7848R 引物（终浓度；表 3）、1.5 mM MgCl2、 1x PCR 缓冲液和 1 U 高保真 Taq 聚合酶，并按照 表 4 所述条件进行扩增循环。
  3. 将扩增产物在 0.8% TAE 琼脂糖凝胶上电泳，以确认产物大小为 2571 bp，然后按照制造商说明使用柱纯化试剂盒纯化产物，用 40 µL 无菌水洗脱柱纯化产物。
  4. 为在产物末端添加 3' A 突出端，向反应体系中加入 0.5 µM dATP 和 1 U 低保真 Taq DNA 聚合酶，并在含有 1x PCR 缓冲液和 1.5 mM MgCl2 （终浓度）的条件下，将全部 PCR 产物于 70 °C 孵育 30 分钟。随后按照制造商说明使用柱纯化试剂盒纯化该混合物。
    注意：也可从第 1.4 步的凝胶中切下约 9.7 kb 的长片段产物，根据制造商说明使用市售的长片段 PCR 产物克隆试剂盒进行克隆，或使用 Illumina 平台对 ep-PCR 产物进行高通量测序2。
  5. 配制连接反应体系：加入 5 µL 2x 连接缓冲液、50 ng T 载体 DNA、约 3 倍摩尔过量的第 3.4 步合成的插入 DNA、3 Weiss 单位 T4 DNA 连接酶以及无核酸酶水，总体积为 10 µL。室温孵育 3 小时后，加入 100 µL Escherichia coli DH5α 感受态细胞，并在 42 °C 热激 35 秒（图 1B）。
  6. 加入 1 mL 无抗生素的 Luria-Bertani (LB) 培养基，37 °C 轻柔振荡培养 1 小时以恢复细胞生长。将菌液在 13,800 x g 条件下离心，弃去上清液，用 200 µL 新鲜 LB 培养基重悬菌体。
  7. 取 100 µL 转化后的 E. coli DH5α 菌液涂布于含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板，37 °C 培养 16 小时。挑选 25–30 个单菌落，分别接种于 5 mL 含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 °C 过夜培养以进行质粒小提。
  8. 次日，按照制造商说明使用质粒纯化试剂盒提取质粒 DNA，并对所有菌落的 200 ng 提取质粒进行限制性内切酶消化反应，反应体系为 10 µL，包含 2 U EcoR1 和 1x 限制性缓冲液。
  9. 将酶切反应体系于 37 °C 孵育 3 小时后，在 0.8% TAE 琼脂糖凝胶上电泳分离产物，以确认质粒 DNA 中的插入片段。
  10. 使用 M13 正向引物、M13 反向引物、6208-SPF 和 6748-SPF 引物（表 3）对 25 个阳性克隆的质粒进行 Sanger 测序，以确定来源于文库及克隆质粒 pJFH1 的病毒 RNA 中突变的比例（以发生突变的核苷酸比例表示）（图 1B 和 图 4）。

4. Huh7.5 细胞系的病毒RNA转染

注意：使用无 RNase/DNase 的组织培养材料，并在 II 级生物安全柜中进行无菌操作。根据机构的生物安全指南，在推荐的生物安全防护设施中进行操作。

  1. 在含有15 mL完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的T75 cm2组织培养瓶中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养Huh7.5细胞，培养基中添加10%（体积比）胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL；图1D）。
  2. 当细胞融合度达到90%时，按1:3比例传代。用1×预热的磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）洗涤细胞。加入5 mL 1×胰蛋白酶-EDTA溶液，完全覆盖细胞层，轻轻摇动培养瓶，然后在37 °C下孵育5分钟。
    注意：孵育时间可能有所不同；孵育至细胞层完全从培养瓶表面脱落为止。
  3. 加入10 mL 1×预热的完全DMEM，通过反复吹打使细胞分散，将细胞悬液收集至15 mL或50 mL无菌离心管中。在室温下以252 × g 离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL完全DMEM中，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。
  4. 为持续维持未处理、转染或病毒感染的Huh7.5细胞，重复步骤4.2和步骤4.3。
  5. 转染前一天，按照步骤4.1–4.3所述方法传代细胞，使用血细胞计数板计数活细胞数量，以每35 mm培养皿0.6 × 106的密度接种Huh7.5细胞于2 mL完全DMEM中，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。
  6. 次日，制备转录本-脂质复合物。将10 µL转染试剂用50 µL最低必需培养基稀释，另取5 µg病毒转录本用50 µL最低必需培养基单独稀释。
  7. 将两种混合物在室温下孵育10分钟，然后将其混合于一个无菌微量离心管中，继续在室温下孵育30分钟，以形成转录本-脂质复合物。
  8. 细胞孵育16小时后，从培养皿中移除培养基，用预热的1× PBS洗涤细胞两次，加入1.5 mL最低必需培养基。缓慢将转录本-脂质复合物加入培养皿中，并用手轻轻摇动以确保复合物均匀分布。
  9. 将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中孵育10小时。然后移除培养基，用1 mL预热的1× PBS洗涤转染后的细胞两次，再加入2 mL完全DMEM。

5. 病毒制备

  1. 当转染的 Huh7.5 细胞达到 90% 汇合度时，每 2 天或 3 天传代一次。每次传代时收集病毒上清液，并于 −80 °C 保存以备后续分析。
  2. 每次传代时，按照步骤 6.2 所述方法，使用焦点形成实验（FFA）监测病毒的扩散情况。持续收获病毒，直至病毒扩散范围达到转染细胞的 >80%（图 1D）。
    注意：在前几次传代中，以 1:1 的比例传代转染细胞，以拯救最大数量的病毒变异体。随着全基因组 MLs 中突变比例的增加，病毒扩散速度减慢，细胞活力下降2。

6. 病毒滴度的定量

  1. 病毒RNA的定量
    1. 根据试剂盒制造商的说明，使用病毒RNA提取试剂盒从140 µL培养上清液中提取病毒RNA。
    2. 根据商业qRT-PCR试剂盒的说明书，配制10 µL的qRT-PCR反应体系。使用正向引物R6-130-S17、反向引物R6-290-R19（终浓度均为0.2 µM）以及探针R9-148-S21FT（终浓度0.3 µM）对HCV RNA进行定量（表3）。设定反应程序为：48 °C孵育20分钟，95 °C预变性10分钟，随后进行45个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟）。
      注意：探针5'端应标记荧光报告基团6-羧基荧光素（FAM），3'端应标记淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）。
    3. 在实时荧光定量PCR仪中运行反应。同时设置阴性对照，即使用模拟感染细胞的上清液提取的RNA以及无核酸酶水作为对照，以确保无交叉污染。
    4. 平行建立标准曲线，使用已知拷贝数的HCV转录本进行10倍系列稀释（1 × 108 至 0拷贝），用于病毒RNA的定量。每个样本设三个重复（图1D）。
  2. 使用50%组织培养感染剂量（TCID50）测定感染性病毒滴度
    1. 在接种病毒前约16小时，将6.5 × 103个Huh7.5细胞/孔接种于96孔板中，并在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
    2. 在生物安全二级柜中，对收获的病毒液（在病毒扩散达到>80%细胞时收集，如步骤5所述）进行10倍系列稀释（每步1 mL），稀释范围为1 × 10−1 至 1 × 10−6（共八个稀释度）。将稀释后的病毒液各取100 µL/孔（每稀释度设八个重复孔）加入Huh7.5细胞中，在37 °C、5% CO2 条件下孵育3天。
    3. 孵育3天后，每次用0.1 mL PBS洗涤感染细胞3次，随后用0.1 mL预冷甲醇在−20 °C固定并通透细胞20分钟。用1× PBS洗涤3次，再用PBS-T（1× PBS/0.1% [v/v] Tween-20）洗涤1次。
    4. 去除PBS-T后，加入含0.2%脱脂奶粉的1%牛血清白蛋白（BSA）PBST溶液0.1 mL/孔，在室温封闭30分钟。吸去封闭液后，加入0.1 mL用1× PBS配制的3% H2O2处理细胞5分钟。
    5. 再次用1× PBS洗涤2次，PBS-T洗涤1次，然后每孔加入50 µL抗NS5A单克隆抗体9E10 mAb（1:10000稀释，原液浓度1 mg/mL；由洛克菲勒大学Charles Rice惠赠），室温孵育1小时。孵育后用1× PBS洗涤3次，PBS-T洗涤1次。
    6. 每孔加入50 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1:4000稀释），室温孵育30分钟，随后用0.1 mL 1× PBS洗涤去除未结合抗体。
    7. 每孔加入30 µL DAB（3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐）显色底物，室温轻摇孵育10分钟。底物在孔底形成棕褐色沉淀，表明存在HCV NS5A抗原。吸去DAB溶液，用1× PBS洗涤2次，蒸馏水洗涤1次，最后每孔加入含0.03%叠氮化钠的PBS 100 µL。
    8. 在倒置光学显微镜下使用10倍物镜观察各孔。统计阳性孔数量：若孔内存在一个或多个NS5A阳性细胞，则判为阳性；若无NS5A阳性细胞，则判为阴性。使用Reed和Muench法计算能使50%孔感染的终点稀释度（TCID50）14,15。TCID50对应稀释度的倒数即为单位体积内的病毒感染性滴度（空斑形成单位）。
      ​注意：不同突变文库的病毒感染性滴度可能存在差异。

7. 耐药性病毒变异株的筛选

  1. 将NS5A抑制剂pibrentasvir（PIB）溶于100% DMSO中，配制成1 mM的储存液，再用完全DMEM稀释至10 nM的工作浓度。
  2. 为测定PIB的50%有效浓度，以0.6 × 106/孔的密度将Huh7.5细胞接种于6孔板中，并在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。细胞孵育16小时后，加入ML50或克隆型JFH1病毒感染剂量，使50%的细胞被感染；感染后12小时（h p.i.），用浓度范围为0.5–100 pM的PIB进行两倍系列稀释处理。孵育3天后，按步骤6.2的方法进行荧光灶检测（FFA），并定量荧光灶形成单位（FFU）。
  3. 使用统计分析软件，根据FFU减少实验的数据绘制剂量-反应曲线。从S型曲线中获得50%有效浓度（EC50；图5）。
    注意：有效浓度范围可能因药物类别、同类HCV抗病毒药物之间以及突变文库的不同而有所差异。
  4. 实验中，将处于70%汇合度的 naïve Huh7.5细胞用ML50病毒（源自ML50 RNA的变异株）感染剂量感染12小时，使50%细胞被感染，然后在感染后24小时将感染的细胞转移至6孔板。
  5. 细胞传代后16小时，向感染细胞中加入1× EC50浓度的PIB（47.3 pM）。此后每次传代均重复此操作，连续进行六次传代（共18天），随后进行三次无药传代周期，并按照步骤6.2所述方法通过FFA监测病毒扩散情况。根据培养面积按比例放大FFA试剂用量。每次传代时收集病毒上清液，并于−80 °C保存备用。
    注意：在药物处理期间，若病毒扩散至超过50%的细胞，可定义为突破性感染（breakthrough）；在停药期间出现的病毒扩散可定义为病毒复发（viral relapse）16。
  6. 在第18天时，按照步骤6.1.1所述方法从上清液中提取病毒RNA，然后按步骤3.1进行cDNA合成。使用5 µL经1:5稀释的cDNA及步骤3.2所述PCR组分扩增NS5A基因。随后按照步骤3.3–3.5，利用NS5A测序引物6186F、6862F和6460R（表3和表4）对6–8个阳性细菌质粒进行测序，以鉴定NS5A区的耐药突变。
    注意：本研究中报告了在1× EC50 PIB处理过程中筛选出的病毒变异株中NS5A区域的氨基酸替换。该设计可排除NS5A以外的其他位点替换对PIB敏感性降低的影响。

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结果

可依据所述方案生成并筛选大量全长HCV变异体，以获得特定的耐药表型 图1全基因组突变文库使用克隆型pJFH1以递减的量（100–10 ng）合成，如图所示 图2. ep-PCR 产物（突变文库）的平均得率范围为 3.8–12.5 ng/µL. 图3 显示从克隆型 pJFH1 和代表性突变文库（ML50，使用 50 ng 克隆型 pJFH1 制备）合成的病毒转录本。克隆型 pJFH1 通过线性化处理 XbaI 消化，而ML50则直接用于 体外 转录反应。如图所示，在ep-PCR反应中，随着输入的pJFH1减少，突变文库（突变病毒RNA）中的突变比例增加。 图 4使用50 ng模板（克隆型pJFH1）合成的ML50每复制10,000个碱基对含有4个突变，而使用25 ng模板合成的ML25则含有9个突变。在克隆型pJFH1测序的核苷酸范围内未发现突变。与克隆型JFH1病毒...

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讨论

在本研究中，我们详细介绍了一种简单且快速的荧光微卫星重复序列分析（FL-MRS）流程，该流程整合了错误倾向性PCR（ep-PCR）18 以及用于合成HCV全基因组文库的反向遗传学方法，这些文库可在细胞培养系统中用于产生具有复制能力的变异体，以筛选耐药表型。使用低保真度的Taq DNA聚合酶是ep-PCR的前提条件，可在全长病毒基因组的PCR扩增过程中引入碱基替换。我们测试了多种低保真度Taq DNA聚合酶，并发现Platinum Taq DNA聚合酶可产生约10 kb大小的ep-PCR产物，且产量较高（数据未显示）。我们建议使用固定的热循环次数，并通过调整模板输入量来控制全基因组文库中的突变比例。由于FL-MRS以错误的全基因组作为全长病毒RNA的模板，因此引物组的精心设计至关重要，以确保RNA合成反应生成特定长度的病毒转录本：（i）正向引物必须位于cDNA克隆T7启动子上游约50个核苷酸处，以促进T7聚合酶与ep-PCR产物的结合；（ii）反向引物序列必须终止于病毒基因组3'端，以利于转录过程中的终止脱离 体外 RNA合成

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了印度政府生物技术部的资金支持（资助编号 BT/PR10906/MED/29/860/2014）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 kb plus DNA 标准品 Thermo Fisher10787018
1.5 ml 离心管Tarsons500010
15 ml 离心管Tarsons546021
35 mm 细胞培养皿 Tarsons960010
50 ml 离心管Tarsons546041
乙酸MerckA6283
琼脂糖 HiMediaMB080
琼脂糖凝胶电泳装置BioRad1704406
II 级生物安全柜ESCOAC2 4S
牛血清白蛋白HiMediaMB083
离心机 Eppendorf5424-R
CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统BioRad1855201
90 mm 克隆平板 Tarson460091
CO2 培养箱 New BrunswickGalaxy 170R
Colibri 微体积分光光度计Titertek-Berthold11050140
DAB 底物 试剂盒 Abcamab94665
dATP 溶液NEBN0440S
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液套装NEBN0446
焦碳酸二乙酯（DEPC） SRL chemical46791
二甲基亚砜（DMSO）HiMediaMB058
DMEM 高糖培养基LonzaBE12-604F
EcoR1-HFNEBR3101
EDTA 四钠盐二水合物HiMediaGRM4918
溴化乙锭AmrescoX328
胎牛血清 Gibco26140079
甲醛 Fishser Scientific12755
凝胶成像系统ALPHA IMAGER
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，HRP 标记Thermo FisherA16066
30% 过氧化氢Merck107209
倒置显微镜Nickon ECLIPSE Ts2
LB 肉汤 HiMediaM1245
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher116680270转染试剂
机械移液器套装Eppendorf  3120000909
甲醇Merck106009
0.2–10 µl 微量吸头 Tarsons521000
10–100 µl 微量吸头 Tarsons521010
200–1000 µl 微量吸头 Tarsons521020
MOPS 缓冲液 GeNei3601805001730
非必需氨基酸（NEAA）Gibco11140050
One Shot TOP10 化学感受态 E. coliInvitrogenC404010E.coli DH5α
Opti-MEMGibco1105-021最低必需培养基
0.2 ml PCR 管Tarsons510051
青霉素/链霉素 Gibco15070063
pGEM-T Easy 载体系统PromegaA1360T 载体 DNA
磷酸盐缓冲液（PBS）HiMediaTI1099
Phusion 高保真 DNA 聚合酶NEBM0530S
PibrentasvirCayman Chemical27546
移液器控制器 Gilson F110120
Platinum Taq DNA 聚合酶 Thermo10966034
PrismGraphPad统计分析软件
QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒 Qiagen52904病毒提取试剂盒
QIAprep Spin 小量提取试剂盒Qiagen27106
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104cokum 纯化试剂盒
RNeasy 小量提取试剂盒 QIAGEN74104RNA 纯化试剂盒
25 ml 血清移液管Thermo Fisher170357N
5 ml 血清移液管Thermo Fisher170355N
10 ml 血清移液管Thermo Fisher170356N
单链 RNA 标准品 0.2–10 kbMerckR7020
脱脂奶粉 HiMediaM530
0.1 M 叠氮化钠溶液Merck8591
SuperScript III 逆转录酶 Invitrogen18080044逆转录酶
T100 梯度 PCR 仪BioRad1861096
T175 细胞培养瓶 Tarsons159910
T25 细胞培养瓶 Tarsons950040
T7 RiboMax Express 大规模 RNA 生产系统 PromegaP1320 大规模 RNA 生产系统 
T75 细胞培养瓶 Tarsons950050
Taq DNA 聚合酶Genetix Biotech (Puregene)PGM040
TaqMan RNA-to-CT 一步法试剂盒Applied Biosystems4392653
TaqMan RNA-to-CT 一步法 试剂盒Thermo Fisher4392653商用 qRT-PCR 试剂盒 
TOPO-XL--2 完整 PCR 克隆试剂盒Thermo FisherK8050-10长片段 PCR 产物克隆试剂盒 
Tris 碱HiMediaTC072
胰蛋白酶-EDTA 溶液HiMediaTCL007
吐温 20HiMediaMB067
真空浓缩仪 Eppendorf, Concentrator Plus100248
水浴锅 GRANTJBN-18
Xba1NEBR0145S

参考文献

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PCR RNA NS5A RNA

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