可通过肺内动脉（IPA）和血管平滑肌细胞（VSMCs）研究肺动脉循环的血管反应。本研究详细描述了肺内动脉的分离方法，以及用于检测其对生理刺激产生血管舒张反应的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
从大鼠肺组织中分离出的肺内动脉（IPA）和血管平滑肌细胞（VSMCs）可用于研究血管收缩和血管舒张的潜在机制。在分离获得IPA和VSMCs后，可在排除神经信号、激素、细胞因子等外部因素干扰的情况下，评估生理和病理条件下血管反应的特征。因此，IPA和VSMCs是研究血管生理学/病理生理学的优良模型，适用于多种实验研究，例如药理学药物的调节作用、膜片钳电生理分析、钙成像等。本文介绍了一种用于分离IPA并在器官浴系统中研究其血管反应的技术。将IPA节段通过管腔内金属丝固定于器官浴槽中，并用多种药理学试剂进行刺激。利用等长张力换能器和生理数据采集分析软件，记录IPA血管张力的变化（即血管收缩和血管舒张）。我们实施了多个实验方案，可用于研究植物化学成分或合成药物的药理活性，探讨其介导血管舒张/收缩的作用机制。这些方案也可用于评估药物在调控多种疾病（包括肺动脉高压）中的作用。IPA模型可帮助我们研究浓度-反应曲线，这对于评价药物的药效动力学参数至关重要。
引言
肺血管系统是一个低压的血管系统，其主要功能是将去氧血液输送至肺部的气体交换区域。肺内的肺动脉与支气管树呈平行分支排列，最终形成一个广泛分布的毛细血管网络，该网络连续覆盖多个肺泡，最后汇合成微静脉和静脉。肺动脉的血管张力受多种因素调控，涉及血管内皮细胞与血管平滑肌细胞（VSMCs）之间的相互作用1。
本研究聚焦于肺内动脉（IPA）的内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张作用。关于内皮依赖性血管舒张，内皮细胞表面发生的多种机制可增加细胞内Ca2+浓度（例如乙酰胆碱[ACh]与毒蕈碱受体[M3]结合），从而促进一氧化氮（NO）、前列环素（PGl2）和内皮源性超极化因子（EDHF）的生成（图1）。NO是内皮细胞通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）由L-精氨酸合成的主要内皮源性舒张因子2，其从内皮细胞释放后进入血管平滑肌细胞（VSMCs）（图1），并激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）；该酶将鸟苷三磷酸（GTP）转化为环磷酸鸟苷（cGMP），进而激活蛋白激酶G（PKG），降低胞浆Ca2+水平，从而引起血管舒张（图1）。PGl2由内皮细胞通过....
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方案
本研究中进行的实验已获得那黎宣大学动物护理与使用伦理委员会（NUACUC）的批准，方案编号为 NU-AE620921，用于动物在科学目的中的护理与使用。
1. 生理溶液的组成
- 通过将化学试剂溶解于蒸馏水中，配制Krebs溶液，终浓度如下：122 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM KCl、0.5 mM KH2PO4、0.5 mM NaHPO4、 1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2 和 11 mM 葡萄糖8。使用1 M NaOH将溶液pH值调节至7.3，并在使用前预热至37 °C。
- 参照步骤1.1的方法配制冷Krebs溶液，用于步骤2中所述的IPA分离介质。
2. 肺动脉（IPA）的分离
- 通过腹腔注射硫喷妥钠（100 mg/kg）对8周龄雄性Wistar大鼠进行麻醉9。使用镊子夹住大鼠足部，检查其在深睡眠状态下对疼痛刺激的反应，确认在执行步骤2.2实施安乐死前，大鼠无足部回缩反应。
- 用剪刀（14 cm）剪开大鼠胸腔中部....
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结果
本研究中建立的实验方案旨在确定测量离体肺动脉（IPA）制备物血管反应中所观察到的生理现象的最佳实验条件。预实验旨在描述有助于理解植物提取物血管舒张作用及其作用机制的潜在结果，具体如下。
植物提取物的血管舒张作用
如图6A、B所示，在内皮完整的肺动脉环（E+）中，该植物提取物可诱导呈浓度依赖性的血管舒张反应（EC50 = 66.88 µg/mL，图6C）。去除内皮（E-）后，植物提取物诱导的血管舒张作用显著减弱（p < 0.01），表现为EC50值增加至原来的2.2倍（E-，EC50 = 150.60 µg/mL，图6C）。溶剂对照DMSO无任何效应。因此，该植物提取物主要通过内皮依赖性途径，部分通过内皮非依赖性途径发挥血管舒张作用。
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讨论
在本文中，我们描述了分离大鼠IPA和VSMC的技术。已有多种实验方案被用于研究IPA的血管反应 体外可用于表征植物提取物诱导的异丙肾上腺素介导的血管舒张的药理学效应及其作用机制。
关于植物提取物对内皮依赖性血管舒张作用的研究，采用了多种阻断剂，如L-NAME（eNOS抑制剂）、吲哚美辛（COX抑制剂）以及阿帕明+查尔毒素（EDHF抑制剂）。代表性数据结果显示阳性反应（即在eNOS或EDHF抑制剂存在下，血管舒张反应显著减弱）和阴性反应（即在COX抑制剂存在下，血管舒张反应无变化），提示该植物提取物通过eNOS和EDHF内皮通路发挥作用。植物提取物诱导的内皮非依赖性血管舒张效应则通过K⁺通道参与机制进行评估+ 通道，细胞外 Ca2+ 内流，和 Ca2+ SR释放。结果表明，植物提取物引起的血管舒张作用可被K通道阻断剂减弱Ca 通道（iberiotoxin），但不受K通道阻断剂的影响V 通道（4-AP）或K⁺通道阻断剂ATP 通道（格列本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢泰国国家研究理事会、化学创新卓越中心（PERCH-CIC）以及国际研究网络（IRN61W0005）提供的经费支持，同时感谢那黎宣大学医学院生理学系提供的科研设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 | |
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 | |
| 乙酰胆碱 | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 | |
| 阿帕明 | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 | |
| 氯化钙 | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 | |
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 | |
| 胶原酶1A型 | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 | 来自溶组织梭菌 |
| D(+)-葡萄糖一水合物 | 默克密理博公司 | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’，N’四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 | |
| 11 cm 镊子 | 无锈杜莫克丝尔 | - | |
| 14 cm 镊子 | 无锈杜莫克塞尔 | - | |
| 格列本脲 | Sigma-Aldrich | G6039 CAS号：16673-34-0 | |
| GraphPad Prism 程序 | 软件版本 5.0（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 | |
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS号 1002546960 | 来自印度红蝎（Mesobuthus tamulus）的重组蛋白 |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 | |
| Labchart 程序 | 软件版本 7.0（A.D. Instrument，Castle Hill，澳大利亚） | ||
| 氯化镁 | Ajax Finechem | 296 CAS号 1506254995 | |
| 雄性Wistar大鼠 | 诺穆拉暹罗国际有限公司，曼谷，泰国 | ||
| Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME） | Sigma-Aldrich | N5751 CAS号 51298-62-5 | |
| 尼卡地平 | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 | |
| 15 mL 器官浴槽 | - | - | 研究人员指定的特定顺序 |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 | 从木瓜乳胶中 |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 | |
| 去甲肾上腺素 | Sigma-Aldrich | P6126 CAS号 61-76-7 | |
| 氯化钾 | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 | |
| 磷酸二氢钾 | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 | |
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 | |
| 剪刀 11 cm | 斯帕尔不锈钢 | - | |
| 剪刀 14 cm | 斯帕尔不锈钢 | - | |
| 碳酸氢钠 | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 | |
| 磷酸二氢钠 | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 | |
| 氢氧化钠 | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 | |
| 硫喷妥钠 | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 | |
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS 编号 - |
参考文献
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614(2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S.
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