可通过肺内动脉（IPA）和血管平滑肌细胞（VSMCs）研究肺动脉循环的血管反应。本研究详细描述了肺内动脉的分离方法，以及用于检测其对生理刺激产生血管舒张反应的实验方案。
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摘要
摘要
从大鼠肺组织中分离出的肺内动脉（IPA）和血管平滑肌细胞（VSMCs）可用于研究血管收缩和血管舒张的潜在机制。在分离获得IPA和VSMCs后，可在排除神经信号、激素、细胞因子等外部因素干扰的情况下，评估生理和病理条件下血管反应的特征。因此，IPA和VSMCs是研究血管生理学/病理生理学的优良模型，适用于多种实验研究，例如药理学药物的调节作用、膜片钳电生理分析、钙成像等。本文介绍了一种用于分离IPA并在器官浴系统中研究其血管反应的技术。将IPA节段通过管腔内金属丝固定于器官浴槽中，并用多种药理学试剂进行刺激。利用等长张力换能器和生理数据采集分析软件，记录IPA血管张力的变化（即血管收缩和血管舒张）。我们实施了多个实验方案，可用于研究植物化学成分或合成药物的药理活性，探讨其介导血管舒张/收缩的作用机制。这些方案也可用于评估药物在调控多种疾病（包括肺动脉高压）中的作用。IPA模型可帮助我们研究浓度-反应曲线，这对于评价药物的药效动力学参数至关重要。
引言
肺血管系统是一个低压的血管系统，其主要功能是将去氧血液输送至肺部的气体交换区域。肺内的肺动脉与支气管树呈平行分支排列，最终形成一个广泛分布的毛细血管网络，该网络连续覆盖多个肺泡，最后汇合成微静脉和静脉。肺动脉的血管张力受多种因素调控，涉及血管内皮细胞与血管平滑肌细胞（VSMCs）之间的相互作用1。
本研究聚焦于肺内动脉（IPA）的内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张作用。关于内皮依赖性血管舒张，内皮细胞表面发生的多种机制可增加细胞内Ca2+浓度（例如乙酰胆碱[ACh]与毒蕈碱受体[M3]结合），从而促进一氧化氮（NO）、前列环素（PGl2）和内皮源性超极化因子（EDHF）的生成（图1）。NO是内皮细胞通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）由L-精氨酸合成的主要内皮源性舒张因子2，其从内皮细胞释放后进入血管平滑肌细胞（VSMCs）（图1），并激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）；该酶将鸟苷三磷酸（GTP）转化为环磷酸鸟苷（cGMP），进而激活蛋白激酶G（PKG），降低胞浆Ca2+水平，从而引起血管舒张（图1）。PGl2由内皮细胞通过环氧化酶（COX）途径合成3,4。它与VSMCs上的前列环素受体（IP）结合，并激活腺苷酸环化酶（AC），后者将腺苷三磷酸（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP）（图1）3,4。cAMP激活蛋白激酶A（PKA），降低胞浆Ca2+水平，导致血管舒张5（图1）。EDHF通路也通过多种内皮介质和电学事件参与内皮依赖性血管舒张。EDHF通路的激活导致VSMCs超极化，从而关闭电压门控Ca2+通道（VOCCs），降低细胞内Ca2+水平，诱导血管舒张6。内皮非依赖性血管舒张则直接作用于VSMCs，通过多种机制实现，如降低细胞内Ca2+水平、抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）、激活肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP），以及降低VSMCs收缩装置对Ca2+的敏感性。在本研究中，我们重点关注由多种K+通道开放、VOCCs阻断以及肌浆网Ca2+释放受抑制所引起的血管舒张7，这些作用导致细胞内Ca2+水平下降，从而分别减少VSMCs中肌球蛋白轻链的磷酸化及肌球蛋白-肌动蛋白结合或横桥形成，最终引起血管舒张。
评估离体肺内动脉（IPA）血管收缩与舒张功能的技术在啮齿类动物中已有成熟方法，但实验数据因实验方案不同而存在差异。本研究描述了用于评价大鼠IPA组织血管反应性的方法 体外，这些反应是在无外部因素调节血管反应的情况下产生的 体内例如神经信号、激素、细胞因子、血压等。
我们采用多种实验方案，以植物提取物为例，研究IPA的血管反应性。使用了多种阻断剂（图1），以明确植物提取物诱导的内皮依赖性和非依赖性血管舒张的作用机制。然而，这些相同的方案也可适用于评估IPA对任何用于治疗各种肺部病理疾病的药物、提取物或植物化学物质的血管反应。
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方案
本研究中进行的实验已获得那黎宣大学动物护理与使用伦理委员会（NUACUC）的批准，方案编号为 NU-AE620921，用于动物在科学目的中的护理与使用。
1. 生理溶液的组成
- 通过将化学试剂溶解于蒸馏水中，配制Krebs溶液，终浓度如下：122 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM KCl、0.5 mM KH2PO4、0.5 mM NaHPO4、 1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2 和 11 mM 葡萄糖8。使用1 M NaOH将溶液pH值调节至7.3，并在使用前预热至37 °C。
- 参照步骤1.1的方法配制冷Krebs溶液，用于步骤2中所述的IPA分离介质。
2. 肺动脉（IPA）的分离
- 通过腹腔注射硫喷妥钠（100 mg/kg）对8周龄雄性Wistar大鼠进行麻醉9。使用镊子夹住大鼠足部，检查其在深睡眠状态下对疼痛刺激的反应，确认在执行步骤2.2实施安乐死前，大鼠无足部回缩反应。
- 用剪刀（14 cm）剪开大鼠胸腔中部及心脏末端，再用剪刀（14 cm）定位肺根部。用剪刀剪下整个肺组织，并将其浸入冷克雷布斯溶液中10,11。
- 用剪刀（11 cm）切取单个肺叶，置于培养皿（9 cm）中，使肺的内侧/肺根朝上（图2A，B）。自上而下观察并识别静脉、支气管和动脉的排列顺序（图2B）。
- 用剪刀（11 cm）纵向剪开支气管，再用镊子（11 cm）夹住支气管尖端，轻柔地解剖并将其与静脉一同从肺组织中分离。注意，肺动脉（IPA）在解剖结构上始终位于支气管下方。
- 随后即可观察到主肺动脉（IPA）（图2C）。用镊子（11 cm）夹住IPA尖端，再用剪刀（11 cm）小心地将其从肺组织中解剖分离。
- 将分离出的IPA保存于冷克雷布斯溶液中，直至完成器官浴装置的设置（pH 7.3，温度 4 °C）11。
3. 血管平滑肌细胞（VSMCs）的分离
- 按照之前步骤2所述方法分离IPA。用剪刀（11 cm）纵向剪开IPA的主支，并切成小条状（2 mm）（图3A）。
- 将IPA条浸入解离液（DM）10,12 中，解离液成分包括：110 mM NaCl、5 mM KCl、0.5 mM KH2PO4、0.5 mM NaH2PO4、10 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.03 mM 酚红、10 mM 牛磺酸、0.5 mM EDTA、2 mM MgCl2、11 mM 葡萄糖和0.16 mM CaCl2，用1 M NaOH调节pH至7.0。在含有1 mg/mL木瓜蛋白酶、0.04%牛血清白蛋白（BSA）和0.4 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）的解离液中，于4 °C孵育1小时，随后在37 °C继续孵育15分钟。再向解离液中加入1 mg/mL I型胶原酶，在37 °C继续孵育5分钟。
注：DM 是一种用于维持细胞活性的溶液。木瓜蛋白酶和I型胶原酶是可降解细胞外基质蛋白以分离单个细胞的酶。BSA是一种血清白蛋白蛋白，用于在储存和酶促反应过程中稳定酶活性。DTT 是一种还原剂，用于在细胞分离过程中稳定并促进酶的活性。牛磺酸是一种氨基磺酸，用于稳定细胞膜和维持细胞完整性。 - 将组织转移至新鲜的解离液中，使用玻璃巴斯德移液管轻轻吹打进行分散（图3B）。持续吹打，直至在显微镜下观察到浴液中出现分离的VSMC（图3C）。
注：新分离的VSMC可用于研究血管生理学/病理生理学，以及多种实验研究，如药物调节作用、膜片钳电生理分析、钙成像等。然而，本研究仅聚焦于利用器官浴技术研究分离IPA的血管舒张功能。
4. 器官浴技术
- 按照步骤2中所述方法分离IPA，将IPA主支切成约2 mm长的环状片段（图2D）13。
- 将IPA环固定在器官浴槽室中（图4），方法是将其穿在两根直径为40 µm的不锈钢丝上（图2E）11,13,14。
- 将带有IPA环的不锈钢丝连接至等长力传感器，并与数据采集设备及安装有适当生理学软件的计算机系统相连，随后缓慢施加张力至1 g11。
- 使血管段在1 g的静息张力下平衡约45分钟。在平衡期间，确保每15分钟更换一次Krebs溶液。平衡结束后，通过测定血管对高细胞外K+（80 mM）溶液（含47.4 mM NaCl、80 mM KCl、10 mM HEPES、0.5 mM KH2PO4、0.5 mM NaHPO4、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2和11 mM葡萄糖）的收缩反应来评估其活性10,11。
- 通过计算乙酰胆碱（1 × 10−5 M）在苯肾上腺素（PE，1 × 10−5 M）预收缩的血管环中的舒张反应，评估内皮是否存在（注意：加入PE后血管收缩可稳定维持1小时）。若舒张幅度超过70%，则视为内皮完整（图5A）；若舒张幅度小于10%，则视为去内皮（图5B）13。通过用细钢丝轻轻摩擦血管内壁以机械方式去除内皮。
- 在开始测试实验前，再次将动脉环平衡30分钟。
5. 植物提取物的血管舒张反应
- 通过使用PE（1 × 10−5 M）预收缩IPA环，研究植物提取物的舒张作用。
- 随后，逐步累积加入植物提取物（1–1,000 µg/mL）至内皮完整环和去内皮环中，以诱导血管舒张（图6A、B），并获得浓度依赖性反应曲线（图6C）。
- 务必同时以溶剂二甲基亚砜（DMSO）进行相同条件下的评估，作为阴性对照（图6C）。
6. 通过内皮介导的植物提取物诱导血管舒张的机制
- 通过在内皮完整的小肺动脉环中孵育以下抑制剂30分钟，评估植物提取物经由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、环氧化酶（COX）13 和内皮源性超极化因子（EDHF）通路介导的血管舒张作用机制（图7A）：1 × 10−4 M NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，eNOS抑制剂）9、1 × 10−5 M 吲哚美辛（COX抑制剂）9，或1 × 10−7 M 阿帕辛（小电导钙激活钾通道阻断剂）与1 × 10−7 M 降钙素基因相关肽毒素（中等及大电导钙激活钾通道阻断剂）的联合使用，随后用1 × 10−5 M 去氧肾上腺素（PE）诱导小肺动脉环收缩。
- 待PE引起的收缩稳定后，加入植物提取物的累积浓度（0.1–1,000 µg/mL）。
- 以存在抑制剂时植物提取物对小肺动脉环舒张效应的百分比表示其作用效果，并与无抑制剂时小肺动脉环的反应进行比较（图7B–D），并据此绘制浓度-反应曲线。
7. 通过血管平滑肌 K+ 通道介导的植物提取物诱导血管舒张的机制
- 在诱导肺动脉环（IPA）收缩之前，先用 1 × 10−3 M 4-氨基吡啶（4-AP，电压门控钾通道（KV）阻断剂）（图 8A）、1 × 10−5 M 格列本脲（ATP 敏感性钾通道（KATP）阻断剂）或 1 × 10−7 M iberiotoxin（大电导 Ca2+ 激活的 K+ 通道（KCa）阻断剂）对去内皮的 IPA 环进行 30 分钟的预孵育，随后加入 1 × 10−5 M 去氧肾上腺素（PE）诱导收缩。
- 然后，逐次加入植物提取物的不同浓度。
- 将植物提取物的作用表示为：与未加抑制剂的 IPA 环相比，含抑制剂的 IPA 环舒张反应的百分比（图 8B-D），并据此绘制浓度-反应曲线。
8. 植物提取物通过抑制血管平滑肌细胞外钙离子（Ca2+）内流诱导血管舒张的机制
- 将去内皮的肺动脉环在含1 mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）的无Ca2+ Krebs溶液中预孵育30分钟（图9A）。
- 随后，将灌流液更换为无Ca2+、含80 mM K+的溶液，持续10分钟，以去极化血管平滑肌细胞（VSMCs），从而打开电压门控钙通道（VOCCs）（图9A）。
- 逐步累积加入CaCl2（0.01–10 mM），诱导肺动脉收缩，并绘制浓度-反应曲线（图9A）。
- 在相同的肺动脉环中重复该实验流程，但在含Ca2+、80 mM K+的溶液中预先孵育植物提取物或1 µM尼卡地平（L型Ca2+通道阻滞剂）10分钟，随后逐步累积加入CaCl28。
- 最后，将收缩反应与先前对照条件下CaCl2刺激所引发的最大收缩进行比较（图9B）。
9. 通过抑制肌浆网（SR）内钙离子（Ca2+）释放介导植物提取物诱导血管舒张的作用机制
- 将去内皮的肺动脉环暴露于80 mM K⁺溶液中+ 溶液中孵育约5分钟，使VSMCs去极化，打开VOCCs，最终产生Ca2+ 上样至SR（图10A).
- 用不含 Ca 的灌流液替换 10 分钟2+不含钙的Krebs溶液，含1 mM EGTA（图10A).
- 然后，用 1 x 10−5 M PE，可激活磷脂酶C/IP3 通路，最终释放 Ca2+ 来自肌浆网并引发肺动脉内皮细胞一过性收缩（图10A).
- 重复相同的实验方案，以确认对PE同样存在短暂的收缩反应。
- 用 80 mM K 再次挑战 IPA 环+ 溶液中约 5 分钟，然后用 Ca 替换灌流液2+含或不含植物提取物的无钙克雷布斯液（含1 mM EGTA）孵育10分钟。
- 再次用 1 x 10 的 IPA 环进行挑战−5 M PE.
- 比较植物提取物存在与不存在条件下PE诱导的IPA收缩反应图10B).
10. 统计分析
- 以均值 ± 标准误（SEM）表示结果。使用适当的统计软件，采用学生 t 检验比较这些数值，或进行方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey-Kramer 事后检验。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。本实验中，每种实验方案使用 n = 6 只大鼠。
注：血管收缩和血管舒张的记录可通过计算机上安装的适当软件进行评估。例如，图 5A 显示，当血管受到苯肾上腺素（PE）刺激而发生收缩时，可从原始记录曲线张力的增加中观察到该现象。记录曲线在 20–30 分钟内趋于稳定，此状态定义为 100% 收缩。随后，乙酰胆碱（ACh）刺激血管引起舒张，可从原始记录曲线张力的下降中观察到该现象。因此，张力的降低程度以相对于 100% 收缩的百分比进行计算。
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结果
本研究中建立的实验方案旨在确定测量离体肺动脉（IPA）制备物血管反应中所观察到的生理现象的最佳实验条件。预实验旨在描述有助于理解植物提取物血管舒张作用及其作用机制的潜在结果，具体如下。
植物提取物的血管舒张作用
如图6A、B所示，在内皮完整的肺动脉环（E+）中，该植物提取物可诱导呈浓度依赖性的血管舒张反应（EC50 = 66.88 µg/mL，图6C）。去除内皮（E-）后，植物提取物诱导的血管舒张作用显著减弱（p < 0.01），表现为EC50值增加至原来的2.2倍（E-，EC50 = 150.60 µg/mL，图6C）。溶剂对照DMSO无任何效应。因此，该植物提取物主要通过内皮依赖性途径，部分通过内皮非依赖性途径发挥血管舒张作用。
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讨论
在本文中，我们描述了分离大鼠IPA和VSMC的技术。已有多种实验方案被用于研究IPA的血管反应 体外可用于表征植物提取物诱导的异丙肾上腺素介导的血管舒张的药理学效应及其作用机制。
关于植物提取物对内皮依赖性血管舒张作用的研究，采用了多种阻断剂，如L-NAME（eNOS抑制剂）、吲哚美辛（COX抑制剂）以及阿帕明+查尔毒素（EDHF抑制剂）。代表性数据结果显示阳性反应（即在eNOS或EDHF抑制剂存在下，血管舒张反应显著减弱）和阴性反应（即在COX抑制剂存在下，血管舒张反应无变化），提示该植物提取物通过eNOS和EDHF内皮通路发挥作用。植物提取物诱导的内皮非依赖性血管舒张效应则通过K⁺通道参与机制进行评估+ 通道，细胞外 Ca2+ 内流，和 Ca2+ SR释放。结果表明，植物提取物引起的血管舒张作用可被K通道阻断剂减弱Ca 通道（iberiotoxin），但不受K通道阻断剂的影响V 通道（4-AP）或K⁺通道阻断剂ATP 通道（格列本...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢泰国国家研究理事会、化学创新卓越中心（PERCH-CIC）以及国际研究网络（IRN61W0005）提供的经费支持，同时感谢那黎宣大学医学院生理学系提供的科研设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 | |
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 | |
| 乙酰胆碱 | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 | |
| 阿帕明 | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 | |
| 氯化钙 | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 | |
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 | |
| 胶原酶1A型 | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 | 来自溶组织梭菌 |
| D(+)-葡萄糖一水合物 | 默克密理博公司 | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’，N’四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 | |
| 11 cm 镊子 | 无锈杜莫克丝尔 | - | |
| 14 cm 镊子 | 无锈杜莫克塞尔 | - | |
| 格列本脲 | Sigma-Aldrich | G6039 CAS号：16673-34-0 | |
| GraphPad Prism 程序 | 软件版本 5.0（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 | |
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS号 1002546960 | 来自印度红蝎（Mesobuthus tamulus）的重组蛋白 |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 | |
| Labchart 程序 | 软件版本 7.0（A.D. Instrument，Castle Hill，澳大利亚） | ||
| 氯化镁 | Ajax Finechem | 296 CAS号 1506254995 | |
| 雄性Wistar大鼠 | 诺穆拉暹罗国际有限公司，曼谷，泰国 | ||
| Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME） | Sigma-Aldrich | N5751 CAS号 51298-62-5 | |
| 尼卡地平 | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 | |
| 15 mL 器官浴槽 | - | - | 研究人员指定的特定顺序 |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 | 从木瓜乳胶中 |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 | |
| 去甲肾上腺素 | Sigma-Aldrich | P6126 CAS号 61-76-7 | |
| 氯化钾 | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 | |
| 磷酸二氢钾 | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 | |
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 | |
| 剪刀 11 cm | 斯帕尔不锈钢 | - | |
| 剪刀 14 cm | 斯帕尔不锈钢 | - | |
| 碳酸氢钠 | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 | |
| 磷酸二氢钠 | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 | |
| 氢氧化钠 | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 | |
| 硫喷妥钠 | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 | |
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS 编号 - |
参考文献
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