分离肺内动脉和平滑肌细胞以研究血管反应

Summary

动脉肺循环的血管反应可以使用肺内动脉 （IPA） 和血管平滑肌细胞 （VSMC） 进行探索。本研究详细描述了IPA的分离以及用于研究对生理刺激的反应的血管松弛的方案。

Abstract

从大鼠肺分离的肺内动脉（IPA）和血管平滑肌细胞（VSMC）可用于研究血管收缩和血管松弛的潜在机制。分离IPA和VSMC后，可以在没有神经信号，激素，细胞因子等外在因素的情况下评估生理和病理条件下血管反应的特征。因此，IPA和VSMC是研究血管生理学/病理生理学以及各种实验研究的优秀模型，例如药物调节，膜片钳电生理分析，钙成像等。在这里，我们使用了一种分离IPA的技术来研究器官浴设置中的血管反应。通过腔内导线将IPA段安装在器官浴室上，并受到各种药物的刺激。使用等长力传感器和生理数据分析软件程序记录IPA血管张力的变化（即血管收缩和血管松弛）。我们实施了几种实验方案，可以调整用于研究血管松弛/血管收缩的机制，以研究植物化学或合成药物的药理活性。这些协议还可用于评估药物在调节各种疾病中的作用，包括肺动脉高压。IPA模型使我们能够研究浓度-反应曲线，这对于评估药物的药效学参数至关重要。

Introduction

肺脉管系统是一种低压血管系统，其主要功能是将脱氧血液输送到肺部的气体交换区域。肺中的肺动脉排列在平行于支气管树的分支中，最终形成一个广泛的毛细血管网络，该网络在几个肺泡上连续，最后汇聚成小静脉和静脉。肺动脉的血管张力受多种因素控制，涉及内皮和血管平滑肌细胞（VSMC）之间的相互作用¹。

在这项研究中，我们专注于肺内动脉（IPA）的内皮依赖性和非依赖性血管松弛。关于内皮依赖性血管松弛，内皮细胞表面发生的各种机制可以增加细胞内Ca²⁺浓度（例如乙酰胆碱[ACh]与毒蕈碱受体[M3]结合），导致一氧化氮（NO），前列环素（_{PGl 2}）和内皮衍生的超极化因子（EDHF）的形成（图1).NO是主要的内皮衍生松弛因子，由L-精氨酸通过内皮一氧化氮合酶（eNOS）²合成，然后从内皮细胞解离为VSMC（图1）并刺激可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）酶;这种酶将鸟苷三磷酸（GTP）转变为环鸟苷单磷酸（cGMP），其激活蛋白激酶G（PKG）并降低胞质^{Ca 2+}水平，从而导致血管松弛（图1）。_{PGl 2} 由内皮细胞通过环加氧酶 （COX） 途径<....

Protocol

本研究中进行的实验已获得Naresuan大学动物护理和使用委员会（NUACUC）伦理委员会的批准，协议号为NU-AE620921，用于科学目的的动物护理和使用。

1.生理溶液的组成

1. 通过将化学物质溶解在蒸馏水中来配制克雷布斯溶液，以达到以下最终浓度:122 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM KCl、0.5 mM KH 2 PO 4、0.5 mM NaHPO₄、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl ₂ 和 11 mM 葡萄糖⁸。用1M NaOH将溶液的pH值调节至7.3，并在使用前预热至37°C。
2. 制备冷克雷布斯溶液，如步骤1.1中所述。用作 IPA 的分离介质，如步骤 2 中所述。

2. 肺内动脉隔离

1. 腹膜内注射硫喷妥钠（100mg / kg）麻醉8周龄雄性Wistar大鼠⁹。通过使用夹在脚上的镊子检查大鼠在深度睡眠中对疼痛刺激的反应，然后在步骤2.2中对大鼠实施安乐死之前确保大鼠没有脚拉回反应。
2. 用剪刀（尺寸14厘米）切开大鼠的中胸和....

Results

本研究中的方案已被开发用于确定测量在分离的IPA制剂的血管反应中观察到的生理现象的最佳实验条件。进行试点实验以描述有助于理解植物提取物血管松弛作用的血管效应和机制基础的潜在结果，如下所示。

植物提取物的血管松弛作用
如图6A，B所示，在内皮完整IPA（E +）中，植物提取物引起血管松弛的浓度依赖性反应（EC₅₀ = 66.88μg/ mL，图6C）。根除内皮（E-）大大降低了植物提取物诱导的血管松弛（p < 0.01），如EC 50增加2.2倍（E-，EC_{50 =} 150.60μg/mL，图6C）所反映的那样。车辆DMSO没有任何效果。因此，植物提取物主要通过内皮依赖性途径产生血管松弛，部分通过内皮依赖性途径产生血管松弛。

Discussion

在这篇手稿中，我们描述了分离大鼠IPA和VSMC的技术。已经采用了几种实验方案来研究体 外IPA的血管反应，可用于表征植物提取物诱导的IPA血管松弛的药理作用和机制基础。

关于植物提取物的内皮依赖性血管扩张作用，采用了各种阻断剂，如L-NAME（eNOS），吲哚美辛（COX）和apamin+charybdotoxin（EDHF）。代表性数据显示阳性结果（即，在存在eNOS或EDHF抑制剂的情况下血管扩张剂反应显着降低）和阴性结果（即，在COX抑制剂存在下血管扩张剂反应没有变化），表明植物提取物通过eNOS和EDHF内皮途径起作用。通过参与K⁺通道，细胞外^Ca 2+内流和SR释放的Ca²⁺来评估植物提取物诱导的内皮非依赖性血管松弛作用。结果表明，K_Ca通道阻断剂（伊比利亚毒素）降低了对植物提取物的血管松弛反应，但K_V通道阻断剂（4-AP）或K_ATP通道阻断剂（格列本脲）没有减少，这表明提取物通过_Kca通道的打开起作.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma-Aldrich	D0632 CAS NO. 348-12-3
4-氨基吡啶 （4-AP）	Aldrich Chemical	A78403 CAS NO. 504-24-5
乙酰胆碱	Sigma-Aldrich	A6625 CAS NO. 60-31-1
Apamin	Sigma-Aldrich	A9459 CAS NO. 24345-16-2
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A2153 CAS NO. 9048-46-8
胆酸钙	Ajax Finechem	AJA960 CAS NO. 1707055184
Charybdotoxin	Sigma-Aldrich	C7802 CAS NO. 95751-30-7
胶原酶 1A 型	Sigma-Aldrich	C9891 CAS NO. 9001-12-1	来自溶组织梭菌
D（+）-葡萄糖一水合	物 Millipore Corporation	K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma-Aldrich	D4540 CAS NO. 67-68-5
乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （EGTA）	Sigma-Aldrich	E3889 CAS NO. 67-42-5
乙二胺四乙酸 （EDTA）	Sigma-Aldrich	E9884 CAS NO. 60-00-4
镊子 11 厘米。	不生锈的 Dumoxel	镊
子 14 厘米。	不锈的杜莫塞尔	-
格列本脲	Sigma-Aldrich	G6039 CAS NO. 16673-34-0
GraphPad Prism 程序	软件版本 5.0（美国加利福尼亚州圣地亚哥）
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375 CAS NO. 7365-45-9
黑霉毒素	Sigma-Aldrich	I5904 CAS NO. 1002546960	重组来自 Mesobuthus tamulus
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378 CAS NO. 53-86-1
Labchart 程序	软件版本 7.0（AD Instrument，Castle Hill，澳大利亚）。
氯化镁	Ajax Finechem	296 CAS NO. 1506254995
雄性 Wistar 大鼠	野村暹罗国际有限公司，泰国
NG-硝基-L-精氨酸甲酯 （L-NAME）	Sigma-Aldrich	N5751 CAS NO. 51298-62-5
尼卡地平	Sigma-Aldrich	N7510 CAS NO. 54527-84-3
器官浴 15 mL。	-	-	研究人员的具体顺序
木瓜	蛋白酶 Sigma-Aldrich	P4762 CAS NO. 9001-73-4	来自木瓜乳
胶 Phenal red	Sigma-Aldrich	P5530 CAS NO. 34487-61-1
去氧肾上腺素	Sigma-Aldrich	P6126 CAS NO. 61-76-7
氯化钾	Kemaus	KA383 CAS NO.7447-40-7
磷酸二氢钾	Aldrich Chemical	EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0
S+A2：E36odium chloride	Kemaus	KA465 CAS NO. 7647-14-5
剪刀 11 厘米。	剥落不锈钢
剪刀 14 厘米。	散落不锈钢
碳酸氢钠	Ajax Finechem	475 CAS NO. 912466
磷酸二氢钠	Aldrich Chemical	33,198-8 CAS NO. 7558-80-7
氢氧化钠	Ajax Finechem	482 CAS NO. 1506196602
硫喷妥钠	Anesthal	JPN3010002 CAS NO. 1C314/47
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625 CAS NO. 107-35-7
Waterbath WBU 45	Memmert	2766 CAS NO. -