一种用于小鼠腹膜透析导管置入的逆行植入方法

摘要

本文介绍了一种改良的小鼠腹膜透析导管植入手术方法，旨在避免传统技术中出现的主要技术问题。

摘要

小鼠模型被用于研究腹膜透析（PD）的多个方面，例如腹膜炎症和纤维化。这些事件在人类中可导致腹膜膜功能衰竭，由于其在终末期肾病（ESKD）患者管理中具有重要的临床意义，因此仍是深入研究的领域。尽管腹膜透析及其相关并发症具有重要的临床价值，目前的小鼠实验模型仍存在关键技术难题，影响了模型的性能表现。这些问题包括腹膜透析导管移位和扭曲，通常需要提前拔除导管。这些局限性也导致研究中需要使用更多的动物数量。为克服这些缺陷，本研究引入了技术改进和手术细节优化，以预防小鼠模型中常见的腹膜透析导管并发症。此外，本研究通过注射脂多糖诱导腹膜炎症和纤维化，对改进后的模型进行了验证。本质上，本文描述了一种建立腹膜透析实验模型的优化方法。

引言

终末期肾病的负担
慢性肾病（CKD）是一个全球性的健康问题¹。目前估计，全球有超过8.5亿人患有肾病。肾病的患病人数几乎是糖尿病患者人数（4.22亿）的两倍，是癌症（4200万）或艾滋病（HIV/AIDS，3670万）患者人数的20多倍²。大约每7名美国人中就有1人患有CKD，每1000名美国人中有2人患有终末期肾病（ESKD），需要进行肾移植或透析治疗³。鉴于全球ESKD负担不断加重，优化透析技术至关重要³。

腹膜透析
在美国，腹膜透析（PD）是一种治疗终末期肾病（ESKD）显著未被充分利用的方式。根据美国肾脏数据系统（USRDS）的数据，2020年接受PD治疗的现患患者比例仅为11%^4,5。与中心血液透析（HD）相比，PD具有多项优势，包括更优的生活质量、更少的门诊就诊次数以及更低的联邦医疗保险（Medicare）支出^6,7。此外，PD是一种居家治疗方式，与血液透析导管相关的严重感染（如菌血症和心内膜炎）风险显著降低。同时，PD可通过紧急启动方案迅速开始治疗，从而减少使用留置血管导管进行透析起始的需求⁸。在儿童ESKD人群中，PD被认为是首选的透析方式⁹。

腹膜透析引起的腹膜功能损害
腹膜透析（PD）需要将透析液注入腹膜腔，长期可导致腹膜炎症及腹膜结构重塑。腹膜炎症会引发纤维化，最终可能导致腹膜超滤功能逐渐丧失。在腹膜透析过程中，保护腹膜结构完整性是一项重大挑战，进一步的研究对于确保临床医生能够获得最佳实践指导至关重要。目前已有成熟的鼠类模型，可用于深入研究腹膜感染与炎症的病理生理机制、溶质和水的转运动力学以及腹膜功能衰竭过程；然而，导管相关的技术问题常常限制了这些模型的应用¹⁰。

分析腹膜的变化
在终末期肾病（ESKD）患者中，透析液传统上通过带有深部和浅部涤纶套的Tenkhoff导管引入腹腔。患者可能会出现与导管相关的并发症，包括导管移位、灌注疼痛以及透析液引流不畅^11,12,13。为减少这些并发症，已开发出两种主要类型的人用腹膜透析导管：卷曲型和直型¹²。为了延长腹膜透析导管的使用寿命，已在传统双套管导管基础上进行了多种改良，例如增加额外的涤纶套¹¹。导管植入技术因多种因素而异，旨在预防导管移位以提高长期存活率，具体选择取决于资源可及性和操作者的专业水平¹⁴。

相比之下，小鼠腹膜透析模型在技术与目的上均与人类腹膜透析导管存在根本性差异。例如，小鼠模型中的腹膜透析导管主要用于研究腹膜的结构改变，而较少用于实现双向引流功能。目前的技术存在潜在的端口移位和导管迁移问题，原因在于对动物的操作过程。在传统的小鼠模型中，通路端口未被固定于皮肤上，这一缺陷导致端口不稳定，在清醒动物中可能发生移位，进而引起导管迁移。鉴于小鼠模型在腹膜研究中的重要性，建立有效的外科技术以生成可靠的动物模型显得尤为必要。因此， 我们着手优化传统的腹膜透析导管置入模型。需要特别指出的是，导管本身会引起腹膜的组织病理学改变，因此，在动物实验中关于腹膜透析液作用的任何结论，都必须结合导管作为异物这一背景进行解读^15,16,17。

腹膜组织病理学
腹膜透析失败主要与纤维化和过度血管生成有关，导致渗透压浓度梯度的丧失。此外，腹膜炎可能会影响腹膜的滤过功能。同时，感染性腹膜炎是导致透析方式由腹膜透析转为血液透析的明确原因¹⁸。

方案

本研究使用了八只雌性C57BL/6J小鼠，年龄为8至12周，平均体重为20 g。小鼠在标准条件下饲养，并可自由摄取饲料和水。ad libitum。本研究经波士顿大学医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（AN-1549）。此处描述的操作均在无菌条件下进行。

1. 在异氟烷麻醉舱中对小鼠进行麻醉，并皮下注射镇痛剂

1. 用非惯用手从尾根部抓住动物，并使其仰卧于非惯用手的掌背表面。
2. 将动物转移至充满3%-4%异氟烷的持续麻醉诱导舱中。通过检测双侧后肢足趾夹捏反射消失确认全身麻醉充分。以1%-3%异氟烷维持全身麻醉状态。
3. 在双眼涂抹眼用软膏。
4. 皮下注射布托啡诺。
   1. 将布托啡诺原液用0.9%氯化钠（NaCl）溶液稀释至终浓度为0.03 mg/mL（原液浓度为0.3 mg/mL）。
   2. 在手术前20分钟，对一只20 g小鼠注射0.03 mg/mL布托啡诺0.05–0.1 mg/kg，并同时注射500 µL无菌0.9% NaCl溶液（每只小鼠注射量为2 µg或66 µL的0.03 mg/mL布托啡诺）。

2. 皮肤准备

1. 将完全麻醉的小鼠置于左侧卧位，使其右侧腹侧面向加热垫。剃除腹部右侧靠近中线至脊柱旁区域直至尾部的毛发。
2. 使用棉签以环形方式从手术切口部位向外周擦拭，交替使用消毒液或消毒剂与70%酒精或无菌生理盐水，共消毒三次。每次使用后丢弃棉签。注意避免酒精或消毒剂过度浸湿动物非手术区域，以免加重低体温。
   注意：必须正确稀释消毒液，且手术过程中不应让消毒剂残留在皮肤上，因其可能具有刺激性，需冲洗干净。操作过程中应频繁检查加热垫温度，确保动物体温不下降。

3. 测量导管长度，并在腹腔内以及准备好的皮肤表面的导管走行路径上标记插入位置

1. 将通路端口放置位置定于动物尾部上方1 cm处。用非优势手的拇指和食指固定安装段，置于尾部附近已标记的区域上方。
2. 将导管置于皮肤上方，估算导管管路进入腹腔的穿刺位置。标记管路插入的预定位置，注意保持导管在腹前正中线附近弯曲程度最小。
   注意：所有操作必须佩戴无菌手套进行，测量过程中应保持导管无菌。手术器械使用前须在121 °C下高压灭菌。所需器械详见补充图S1。

4. 定制腹膜透析导管储液段

1. 使用小鼠耳标器在储液腔支架部分打一个侧孔（图1 和 图2）。需要注意的是，耳标器是一种外科工具，必须保持无菌。

5. 放置灌注端口

1. 在距尾部上方1 cm处做一长约1 cm的横向皮肤切口。钝性分离皮下层与下方肌层，形成一个用于放置导管的皮下囊袋，以确保灌注端口可自由位于理想的端口囊袋内。
2. 保持虹膜剪尖端朝向中线，为导管建立一个斜行隧道（图3A）。
3. 从定制的侧孔处穿过3.0缝线。通过拉紧已穿过的缝线将通路端口固定于肌床，并使导管走向朝向头侧。

6. 制作导管尖端插入部位的切口

1. 在先前标记的靠近中线区域做1 cm切口。用剪刀穿过隧道以确认隧道已充分形成。
2. 用镊子轻轻夹住导管尖端，使导管呈逆行方向置入。
   注意：避免夹压导管侧孔。
3. 将导管经已制备好的隧道穿过（图3B）。在靠近右侧中线的肌层做1 cm切口。

7. 确认导管功能正常

1. 在关闭所有切口之前，确保已放置的导管功能正常。使用连接至专用穿刺针的1 mL注射器检查导管功能。
2. 向灌注端口注入200 µL生理盐水。观察液体流动是否顺畅，不得有任何阻力。
3. 用10%肝素冲洗端口和导管，以保持通畅。

8. 缝合皮肤切口

1. 使用3-0可吸收缝线闭合端口储液囊周围的皮肤切口（图3C）。

9. 将导管尖端固定在腹腔内

1. 在切开的腹壁肌肉周围用4-0圆形可吸收缝线做一个松散的荷包缝合。将导管近端的涤纶垫片穿过切口置入腹腔内。
2. 收紧预先准备好的荷包缝线，固定导管，同时确保第二个涤纶垫片位于荷包缝线之外、肌层之上（图3D），然后用3-0可吸收缝线缝合皮肤（图2）。

10. 术后监测动物并每日观察，给予术后镇痛和补液治疗，并至少维持7天的每日术后记录，直至动物完全恢复

1. 通过导管每日注射 200 µL 生理盐水，以保持导管功能通畅。

11. 液体注射

1. 通过仔细检查皮肤切口，确认术后过程顺利。
2. 按每公斤体重 2 mg 的剂量配制用于腹腔注射（i.p.）的 LPS，通过将 40 µg LPS 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至工作浓度 0.2 µ克/µL（本质上，10 µL 对于 2 µ克/克体重和200 µL of LPS 用于 20 g 小鼠。
3. 在导管植入后的第二周开始注射。
   1. 用非优势手轻轻抓住动物，同时固定灌注端口，并用食指和拇指沿头侧方向移动。
   2. 用70%异丙醇对储液囊表面的皮肤进行消毒。使用连接在Huber针头上的注射器注入LPS。
      1. 使用Huber针进入穿刺端口后，注入100 µ将1 L生理盐水注入端口，以确认通畅的通路。
      2. 注射制备好的 200 µLPS 100 L µ用正常生理盐水冲洗导管，确保无阻力。

12. 在采集腹膜前对小鼠进行麻醉，并收集腹腔灌洗液

1. 在脂多糖注射7天且导管植入2周后，计划进行腹膜活检。
2. 准备全身麻醉。
   1. 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉，并皮下注射镇痛剂。
   2. 抓住小鼠尾根部，使其背部朝上置于手背表面。
   3. 将动物转移至充满3%-4%异氟烷的持续麻醉诱导舱中。通过检测左右后肢足趾夹捏反射是否消失来确认麻醉深度。维持麻醉时使用1%-3%异氟烷。

13. 腹膜活检

1. 将动物仰卧位放置于加热毯上。从剑突下至膀胱处做正中皮肤切口。
2. 用冷磷酸盐缓冲液（PBS）灌注皮下筋膜层（图3E）。
3. 确保在不破坏腹膜完整性的前提下，完全分离筋膜下平面。从左侧下腹象限的侧腹膜反折处开始解剖腹膜，自肾门至左侧胁腹部，并向下至膀胱，以保证动物间样本的一致性（图3F）。
4. 完成腹膜取材后，通过颈椎脱位法处死动物。

结果

所有植入的导管在研究结束前均保持正常功能，且无一例出现导管脱落或扭曲。本改进技术进一步通过使用脂多糖（LPS）诱导的腹膜炎模型进行了验证。对照组小鼠每日接受 200 µL 生理盐水注射，而实验组小鼠则按照方案步骤 11 所述，在导管植入后连续 7 天每日注射 200 µL LPS。

通过苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色（Masson Trichrome）染色对腹膜进行组织病理学特征评估。H&E染色切片分析显示，在腹膜下间隙的细胞外基质（ECM）显著增加（图4A，以星号标记），该数值使用ImageJ进行测量。对照组小鼠腹膜下间隙ECM的平均值±标准差为87.10 ± 24.66 µm，而脂多糖（LPS）暴露组小鼠的ECM数值翻倍（148.9 ± 60.85 µm，P = 0.008）（图4B）。

三色染色法可检测纤维化（蓝色染色表示 图5

讨论

本文描述了三种小鼠帕金森病（PD）模型，包括盲穿腹膜表面法、开放式永久性系统以及封闭式系统¹⁰。盲穿腹膜表面法通过直接进入腹膜腔实现，类似于腹腔注射，但无法引流透析液。由于该操作为盲法进行，可能损伤腹部内脏器官。开放式永久性系统模型将透析导管和灌注端口留置于体外，但在小鼠中应用该技术常伴随多种并发症，例如动物活动导致的袋子脱落、感染以及无法开展长期实验等问题。封闭式腹膜导管系统于2009年引入，该系统将通路端口和导管均植入动物体内，从而实现经皮直接液体灌注。在人类中，腹膜透析袋可置于体外，但由于小鼠活动性强，此方法不可行。此外，导管常出现机械性阻塞，原因包括侧孔堵塞和导管弯曲²⁰。封闭式系统的储液囊具有移动性，可能发生翻转，进而导致储液囊与导管连接处受压扭曲。

为克服封闭式腹膜透析（PD）系统的上述局限性，已采用多种方法，包括行大网膜切除术和肝素灌注以防止PD导管堵塞。尽管这些方法在短期研究中可能有效，但在小鼠模型中进行较长时间实验时，导管功能挽救仍面临挑战。此外，小鼠的大网膜较人类小得...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 肝素	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	药品
布托啡诺 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
钳子	Fine Science Tools	13002-10
镊子	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF 镊子	Fine Science Tools	11252-00
Dumont 血管插管镊	Fine Science Tools	11282-11
精细剪刀 - 大环型	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand 动物耳标打孔器	Fisher Scientific	13-812-201
Hill 止血钳	Fine Science Tools	13111-12
Huber 点针头	Access  technologies	PG25-500	注射用针头
异氟烷，USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
来自 E. coli 的脂多糖	SIGMA	L4391
显微镜	Nikon Eclipse 倒置显微镜	TE2000
带滞留珠和交叉孔的 Minute Mouse Port 4French	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber 点针头 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
剪刀	Fine Science Tools	14079-10
薇乔缝线	AD-Surgical	#L-G330R24