通过高分辨率呼吸测定法评估坐骨神经中的线粒体功能

摘要

高分辨率呼吸测定结合荧光传感器可测定线粒体的耗氧量和活性氧（ROS）的生成。本方案描述了一种用于评估通透化坐骨神经中线粒体呼吸速率和ROS产生的技术。

摘要

外周神经中的线粒体功能障碍伴随多种与外周神经病变相关的疾病，这些疾病可由多种因素引发，包括自身免疫性疾病、糖尿病、感染、遗传性疾病和肿瘤。由于样本量小、组织中线粒体数量有限以及存在髓鞘结构，评估小鼠外周神经中的线粒体功能具有挑战性。本研究中描述的技术通过采用一种源自肌纤维实验的特异性透化方案，直接评估坐骨神经的线粒体功能，而无需从组织中分离线粒体，从而显著降低了上述困难。通过使用Amplex Red/过氧化物酶法测定荧光性活性物质的生成，并在皂苷透化的神经组织中比较不同的线粒体底物与抑制剂，可同时检测线粒体呼吸状态、活性氧（ROS）水平以及线粒体复合物的活性。因此，与其它技术相比，本文所提出的方法在评估线粒体功能方面具有优势。

引言

线粒体对于维持细胞活力至关重要，并执行多种细胞功能，例如能量代谢（包括葡萄糖、氨基酸、脂质和核苷酸代谢通路）。作为活性氧（ROS）产生的主要场所，线粒体在多种细胞信号传导过程（如细胞凋亡）中发挥核心作用，并参与铁硫（Fe-S）簇的合成、线粒体蛋白质的导入与成熟，以及其基因组和核糖体的维持^1,2,3。线粒体膜动力学网络由融合和分裂过程调控，同时还具备质量控制机制和线粒体自噬（mitophagy）系统^4,5,6。

线粒体功能障碍与多种病理状态的出现相关，例如癌症、糖尿病和肥胖症⁷。在线粒体功能紊乱中，可观察到影响中枢神经系统的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病^8,9、帕金森病^10,11、肌萎缩侧索硬化症

方案

本方案已获得 CCS/UFRJ 动物研究伦理委员会（CEUA-101/19）以及美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南批准。坐骨神经取自四月龄雄性 C57BL/6 小鼠，小鼠依据机构指南通过颈椎脱位法实施安乐死。本方案步骤经过优化，以避免线粒体功能退化。因此，在本方案中，先于小鼠坐骨神经组织的分离与通透化处理之前，完成对极谱氧传感器的校准。

1. 试剂的准备

1. 配制组织保存缓冲液（TP缓冲液）。
   1. 使用超纯水溶液配制以下试剂：含0.1 μM游离钙的10 mM Ca-EGTA缓冲液、20 mM咪唑、20 mM牛磺酸、50 mM K-MES、0.5 mM DTT、6.56 mM MgCl₂、5.77 mM ATP、15 mM磷酸肌酸（见材料表），pH值调至7.1。置于-20°C保存。
2. 配制线粒体呼吸缓冲液（MR缓冲液）。
   1. 使用超纯水溶液配制以下试剂：0.5 mM K₂EGTA、3 mM MgCl₂、60 mM MES、20 mM牛磺酸、10 mM KH₂PO₄、20 mM HEPES、110 mM D-蔗糖、1 mg/mL BSA（无脂肪酸）（见材料表

结果

通透化坐骨神经的线粒体耗氧量以如下方式表示 图2. 红色轨迹代表 O₂ 每毫克组织每秒皮摩尔氧通量（pmol/s·mg）。在记录内源性底物支持下的基础耗氧量（常规呼吸）后，加入琥珀酸（SUCC）以检测复合体II（琥珀酸脱氢酶）驱动的呼吸，导致耗氧速率升高。随后加入饱和浓度的ADP，激活ATP合酶，推动氧化磷酸化过程，使线粒体呼吸进入磷酸化状态。磷酸化状态下的呼吸是指ATP合酶利用质子梯度形成的膜电位作为质子驱动力，将ADP与无机磷酸盐（Pi）合成为ATP。²⁶随着ATP合酶活性促进膜电位降低，氧气消耗加快，可观察到氧流增加。外源性细胞色素c（CYTC）的加入仅引起呼吸的轻微增强，证明本实验所用线粒体外膜结构完整。组织透化处理可能损伤膜完整性并导致细胞色素c丢失。若呼吸速率增加超过10%-15%，则提示线粒体受损及组织制备不当^28,29在此代表性结果中，呼吸作用增加了8.7%，表明组织制备质量良.......

讨论

多种伴随神经病变的疾病或病理状态均以线粒体功能障碍作为风险因素。评估外周神经中线粒体的功能对于阐明线粒体在这些神经退行性疾病中的作用至关重要。由于分离方法困难且组织材料有限，线粒体功能的评估工作十分繁琐。因此，开发无需分离线粒体的组织透化技术至关重要。

为了评估透化组织中的线粒体功能，选择一种能够透化细胞质膜而不干扰细胞呼吸作用的化学试剂至关重要。在坐骨神经等外周神经中，髓鞘的脂质成分约占70%，其中大部分为胆固醇^33,34。选择如皂苷（saponin）和毛地黄皂苷（digitonin）等可与胆固醇分子相互作用的透化试剂，可形成允许底物进入线粒体机制的孔道，同时不干扰其他细胞结构^35,36。本方案借鉴了Pesta和Gnaiger²⁴所描述的、用于肌纤维透化的成熟方法，并将其应用于坐骨神经。透化过程还包括.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5'三磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	A26209
腺苷-5′-二磷酸钠盐	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red 试剂	Thermo Fisher Scientific	A12222	Amplex Red 根据产品说明书用 DMSO 配制
抗霉素 A（源自链霉菌属）	Sigma-Aldrich	A8674
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030	热激组分，无蛋白酶，无脂肪酸，基本无球蛋白，pH 7，≥98%
碳酸钙	Sigma-Aldrich	C6763
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920
细胞色素 c	Sigma-Aldrich	C7752	（源自马心；小分子血红素蛋白）
DataLab 版本 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
数字轨道微量板振荡器 120V	Thermo Fisher Scientific	88882005
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43819
EGTA 钠盐	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton 注射器	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 µL、25 µL 和 50 µL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
过氧化氢溶液 30% W/W	Merck	H1009
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-苹果酸	Sigma-Aldrich	M7397
氯化镁六水合物	Sigma-Aldrich	M2393
MES 钠盐	Sigma-Aldrich	M3885
显微解剖镊子，弯头	Sigma-Aldrich	F4142
显微解剖镊子，直头	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Amplex Red 滤光片组	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-荧光测定法：小鼠脑线粒体中的高分辨率呼吸和 H2O2 生成。Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - 荧光 LED2 模块组件 荧光传感器绿色	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876	（源自淀粉液化链霉菌；寡霉素 A、B 和 C 的混合物）
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
棕榈酰肉碱（棕榈酰-DL-肉碱盐酸盐）	Sigma-Aldrich	P4509
辣根过氧化物酶	Sigma-Aldrich	P8375
培养皿，聚苯乙烯材质	MERCK	P5606
磷酸肌酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	P7936
磷酸二氢钾（一元碱式）	Sigma-Aldrich	PHR1330
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	221473
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
皂苷	Sigma-Aldrich	SAE0073
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280
琥珀酸钠二碱式六水合物	Sigma-Aldrich	S2378
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625