通过高分辨率呼吸测量法评估坐骨神经的线粒体功能

Summary

高分辨率呼吸测量与荧光传感器相结合，可测定线粒体耗氧量和活性氧 （ROS） 生成。本方案描述了一种评估透化坐骨神经中线粒体呼吸频率和ROS产生的技术。

Abstract

周围神经的线粒体功能障碍伴随着与周围神经病变相关的几种疾病，这些疾病可由多种原因引发，包括自身免疫性疾病，糖尿病，感染，遗传性疾病和肿瘤。评估小鼠周围神经中的线粒体功能可能具有挑战性，因为样本量小，组织中存在有限数量的线粒体以及髓鞘的存在。本工作中描述的技术通过使用适用于肌肉纤维的独特透化方案来评估坐骨神经线粒体功能，而不是从组织中分离线粒体，从而最大限度地减少了这些挑战。通过使用 Amplex Red/过氧化物酶测量荧光反应物的产生，并比较皂苷透化神经中的不同线粒体底物和抑制剂，可以同时检测线粒体呼吸状态、活性氧 （ROS） 和线粒体复合物的活性。因此，与通过其他技术评估线粒体功能相比，这里介绍的方法具有优势。

Introduction

线粒体对于维持细胞活力至关重要，并执行许多细胞功能，如能量代谢（葡萄糖，氨基酸，脂质和核苷酸代谢途径）。作为活性氧（ROS）产生的主要部位，线粒体是细胞凋亡等几个细胞信号传导过程的核心，并参与铁硫（Fe-S）簇的合成，线粒体蛋白的导入和成熟，以及维持其基因组和核糖体^1，2，3。线粒体膜动力学网络由融合和裂变过程控制，它们还具有质量控制和线粒体自噬^4，5，6的机制。

线粒体功能障碍与几种病理状况的出现有关，例如癌症，糖尿病和肥胖^症7。线粒体功能紊乱在影响中枢神经系统的神经退行性疾病中检测到，如阿尔茨海默病^8，9，帕金森病^10，11，肌萎缩性侧索硬化症^12，13和亨廷顿舞蹈症^14，15.在周围神经系统中，在免疫神经病变中观察到轴突线粒体功能的丧失，例如吉兰 - 巴雷综合征^16，17，并且与轴突中的高线粒体ROS产生相关联，这些事件导致Schwann细胞中的MAP激酶激活¹⁸。这表明线粒体生理学可能不仅对位点特异性细胞至关重要，而且对整个组织也至关重要。在 HIV 相关的远端感觉多发性神经病 （HIV-DSP） 中，线粒体在转录的反式激活剂 （HIV-TAT） 蛋白允许 HIV 有效复制的机制中发挥作用，以及在 HIV 感染发病机制中的几个其他作用^19，20。

坐骨神经线粒体生理学的评估已成为研究神经病变^7，21，22的重要目标。在糖尿病性神经病变中，蛋白质组学和代谢组学分析表明，糖尿病中的大多数分子改变都会影响坐骨神经线粒体氧化磷酸化和脂质代谢⁷。这些变化似乎也是肥胖引起的糖尿病的早期迹象²¹。在化疗诱导的疼痛性神经病变的小鼠模型中，坐骨神经中的线粒体损伤被检测为氧化磷酸化²²的减少，以及线粒体复合物活性，膜电位和ATP含量²³的降低。然而，尽管一些小组引用了神经病变中的线粒体功能障碍，但这些研究仅限于线粒体复合物活性的测量，没有保留线粒体膜，缺乏线粒体完整性的评估或ATP含量的测量作为线粒体ATP产生的参数。一般来说，对线粒体耗氧量和ROS产生的正确评估需要通过在percoll/蔗糖梯度中的差异离心分离线粒体。线粒体的分离也可能是坐骨神经组织的限制因素，因为需要大量的组织以及线粒体的丢失和破坏。

本研究旨在提供一种测量线粒体生理学的方案，如坐骨神经中的线粒体耗氧量和ROS产生，保留线粒体膜并且不需要分离线粒体。该方案通过高分辨率呼吸测量（HRR）根据透化肌肉纤维²⁴ 中的耗氧量测量进行调整。该程序的优点是可以评估少量组织（例如坐骨神经）中的线粒体并 原位评估线粒体参数，从而保留线粒体环境，结构和生物能量谱，以获得生理上值得信赖的结果。坐骨神经通透后，用底物和抑制剂测定线粒体呼吸状态，以正确评估线粒体生物能量学和线粒体膜完整性的细胞色素c系数，为线粒体电子传递系统（ETS）评估和基本参数计算的步骤提供指导。这项研究可以为回答与坐骨神经代谢有关的病理生理学机制中的问题提供工具，例如周围神经病变。

Protocol

本议定书由研究中使用的动物伦理委员会CCS / UFRJ（CEUA-101 / 19）和美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南批准。坐骨神经从四个月大的雄性C57BL / 6小鼠中分离出来，根据机构指南通过宫颈脱位安乐死。方案步骤经过优化，以避免线粒体恶化。因此，在该方案中，在小鼠坐骨神经组织解剖和透化之前进行极谱法氧传感器的校准。

1. 试剂的制备

1. 准备组织保存缓冲液（TP缓冲液）。
   1. 在超纯水溶液中制备以下试剂:10 mM Ca-EGTA缓冲液与0.1μM游离钙，20mM咪唑，20mM牛磺酸，50mMK-MES，0.5mMDTT，6.56mM氯化镁₂，5.77mMATP，15mM磷酸肌酸（见 材料表），pH 7.1。储存在-20°C。
2. 准备线粒体呼吸缓冲液（MR缓冲液）。
   1. 在超纯水溶液中制备以下试剂:0.5 mM K₂EGTA，3 mM氯化镁₂，60 mM MES，20 mM牛磺酸，10 mM KH₂PO₄，20 mM HEPES，110 mM D-蔗糖，1mg / mLBSA（无脂肪酸）（见 材料表），pH 7.4。储存在-20°C。
3. 通过将5mg皂苷（参见 材料表）溶解在1mLTP缓冲液（步骤1.1）中并将其保存在冰上来制备皂苷储备溶液。皂苷是新鲜烹制的。
4. 通过用DMSO重悬粉末（参见 材料表）来制备 Amplex Red，以获得 2 mM 的储备浓度，并储存在 -20 °C 的避光小瓶中。
   注意:为避免冻融使探针磨损，请制作小等分试样，储存时间不超过6个月²⁵。

2. 用于高分辨率呼吸测量（HRR）的极谱法氧传感器的校准

1. 清洁仪器和注射器的HRR室（见 材料表）。
   1. 打开HRR室，将蒸馏水填充到顶部，搅拌5分钟3次。用乙醇重复，然后用水再次重复。用水/乙醇/水清洗塞子和注射器，每个3x。
2. 在HRR软件中应用以下校准设置（参见 材料表）。
   1. 在HRR软件控制中，添加实验温度（37°C），氧传感器（增益，2;极化电压，800 mV）和电化学传感器（增益，1000;极化电压，100 mV）的参数。
3. 校准氧传感器。
   1. 将2.1 mL MR缓冲液（步骤1.2）移入每个腔室。用塞子关闭并将空气吸入腔室，直到形成气泡。在校准模式下在37°C下搅拌1小时，直到每个质量的氧通量稳定。
   2. 根据制造商的协议²⁴对软件中的极谱法氧传感器进行空气校准。
      注意:校准步骤仅在实验前执行一次。在相同的呼吸介质和温度下，只需在洗涤室后即可进行其他实验（步骤2.1）。

3.坐骨神经的解剖和透化

1. 按照以下步骤移除坐骨神经。
   1. 从笼子中取出后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死，并轻轻地限制在长凳上休息。
   2. 在安乐死的动物中，用剪刀在下背部做一个切口，从脊柱附近开始，沿着大腿向脚部走。去除附着在神经上的皮肤和肌肉，然后切除并去除整个坐骨神经。
   3. 立即称量组织并将其放入装有冷结核缓冲液（4°C）的小瓶中。在冰上执行步骤3.2-3.3。
      注意:湿纸巾重量用于在以下步骤中使氧气消耗和ROS生产流程正常化。如果不能立即称量组织，请将其保存在冷TB缓冲液中。该过程在新鲜组织中进行，不得冷冻以避免线粒体损伤。
2. 对于组织准备，将坐骨神经放入培养皿中，培养皿中有足够的TP缓冲液覆盖它。用镊子握住神经的一端，用另一对镊子水平拉出神经束。
   注意:该过程需要在不到10分钟的时间内完成，以避免组织恶化。当组织可以可视化为透明的雾状层时，组织将准备就绪，与先前的白色不透明组织相反（图1）。
3. 首先，将分散的组织转移到含有1mL TP缓冲液的小培养皿中以进行组织透化。为了开始透化，将带有镊子的组织转移到含有1mL TP缓冲液和10μL皂苷的培养皿中（来自储备溶液，步骤1.3）。
   1. 在微孔板振荡器中轻轻摇动30分钟，然后用镊子将组织转移到含有MR缓冲液（1mL）的新鲜培养皿中，轻轻摇动10分钟。用镊子将组织转移到校准的HRR室中。

4. 耗氧量和ROS生产测定

1. 用2.1mL MR缓冲液填充HRR室，将Applex Red（步骤1.4）加入终浓度为5μM，过氧化物酶为2 U / mL，并加入透化的坐骨神经（步骤3）。
   1. 连接仪器的荧光传感器，关闭软件控制部分中的灯，然后按 连接到氧饱和度计。在软件的"编辑方案"中，插入步骤3.1.3中测量的组织重量。
2. 转到"布局"，选择"每单位样品的特定通量"选项，然后选择 绘图 以同时访问氧气消耗读数，如果需要，还可以访问H₂O₂ 生产。等待~10分钟。
   注意:此时间需要稳定氧气消耗的基础流量，而无需添加底物（基础）。在进一步注射之前，请确保氧气流量稳定。
3. 注入两个H₂O₂脉冲，每个脉冲的终浓度为260μM，以便稍后在腔室中校准。
4. 注入20μL琥珀酸盐（参见 材料表），线粒体复合物II底物，以激活线粒体电子传递系统。
   注意:此时可以添加不同的线粒体底物，以评估不同复合物的线粒体功能。线粒体复合物I和II具有不同底物的代表性结果如图2和图3所示。在这一点上，在图3中_{观察到O 2}消耗量和H_{2 O 2}产量同时增加。
5. 加入20μL二磷酸腺苷（ADP）以激活三磷酸腺苷（ATP）合成。
   注意:ADP刺激ATP合成并降低膜电位。预计O₂ 消耗量的增加和H₂O₂ 的产量减少将达到^26，27。
6. 按顺序，加入5μL细胞色素c（参见 材料表）作为膜完整性的指示剂。
   注意:如果组织准备充分且透化，细胞色素c不应使氧气消耗量增加超过15%。如果发生这种情况，请查看疑难解答部分以获取建议。
7. 用0.2μg/mL寡霉素等分试样滴定（见 材料表），直到没有观察到O₂ 消耗的进一步减少。
   注意:寡霉素通过抑制ATP合成起作用，导致O₂流量减少和H_{2 O 2}形成增强，高膜电位^26，27有利。
8. 用0.5μmol/ L羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP） 的等分试样滴定，线粒体解偶联器，直到可以观察到O₂ 消耗的进一步增加。为了完成实验，将2μl抗霉素A注射至终浓度为5μM并等待流量稳定。
   注意:由于注射FCCP后膜电位耗散，_{观察到H2 O 2}产量的降低。抗霉素A抑制复合物III，从而阻止电子的流动。因此，线粒体依赖性O₂的消耗受损，每质量氧通量降低并刺激电子泄漏，增加H₂O₂的产生^26，27。
9. 转到命令栏，在软件中搜索"多感官"，单击" 控制>保存文件并断开连接。
   注意:可以根据正在研究的问题添加其他底物和抑制剂。代表性结果中描述了一个示例。H₂O₂ 校准在完成实验后根据制造商的协议²⁸进行。
10. 打开保存的文件并选择"每质量氧通量"迹线以获得实验耗氧量结果。通过按 Shift + 鼠标左键手动选择注射之间的窗口。
    1. 转到 标记>统计 ，以可视化每次注射底物/抑制剂/非耦合方案的结果。对于 H₂O₂ 生产，请使用"安培斜率"迹线执行相同的过程。
       注意:选择窗口时，请通过选择氧气（或H₂O₂）更稳定和恒定的窗口来避免体积注入的伪影。所选窗口的示例在代表性结果中用黑色大括号表示（图 2 和 图 3）。

Results

透化坐骨神经的线粒体氧消耗量如图 2所示。红色迹线表示每单位质量的O₂ 通量，以pmool/s.mg为单位。在用内源性底物（常规呼吸）记录基础氧消耗量后，注射琥珀酸盐（SUCC）以记录复合物II（琥珀酸脱氢酶）驱动的呼吸，导致耗氧速率增加。按顺序，加入饱和浓度的ADP，激活ATP合酶并驱动氧化磷酸化。这导致线粒体呼吸的磷酸化状态。磷酸化状态呼吸是指ATP合酶可以从ADP + Pi（无机磷酸盐）中产生ATP，利用质子梯度形成的膜电位作为质子动力来产生ATP²⁶。随着ATP合酶活性促进膜电位的降低，氧消耗加速，氧流量增加。外源性细胞色素c（CYTC）的添加仅促进了对呼吸的最小刺激，证明了该制剂的线粒体外膜完整性。组织的透化会破坏膜的完整性和细胞色素c的损失。呼吸速率增加超过10%-15%表明线粒体受损和组织准备不足^28，29。在该代表性结果中，呼吸增加8.7%，表明组织制备质量良好（

Discussion

伴随神经病变的几种疾病或病症将线粒体功能障碍作为危险因素。评估周围神经的线粒体功能对于阐明线粒体在这些神经退行性疾病中的行为至关重要。由于分离方法的困难和材料的稀缺性，线粒体功能的评估是费力的。因此，开发不需要分离线粒体的组织透化技术至关重要。

为了评估透化组织中的线粒体功能，选择一种能够透化细胞质膜而不干扰细胞呼吸的化学物质至关重要。在周围神经如坐骨神经中，髓鞘组成约为70%的脂质，其中大部分是胆固醇^33，34。选择与胆固醇分子相互作用的透化剂，如皂苷和洋地黄苷，导致孔隙允许底物进入线粒体机制而不会干扰其他细胞室^35，36。在该协议中，Pesta和Gnaiger²⁴ 描述的皂苷肌纤维渗透的成熟方法适用于坐骨神经。渗透化过程包括关于组织分离的另一个关键步骤，以允许根据记录感兴趣的线粒体参数所需的底物进行...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
腺苷 5' 三磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	A26209
腺苷 5′-二磷酸钠盐	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red 试剂	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red 在 DMSO 中制备，符合产品数据表
抗霉素 A（来自链霉菌属）	Sigma-Aldrich	A8674
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030	热休克组分，无蛋白酶，无脂肪酸，基本无球蛋白，pH 值 7 和 ge;98%
碳酸钙	Sigma-Aldrich	C6763
羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）苯腙 （FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920
细胞色素 c	Sigma-Aldrich	C7752	（来自马心脏;小血红素蛋白）
DataLab 版本 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利		（c） 2002 - 13 由 Erich Gnaiger 博士
数字轨道微孔板摇床 120V	Thermo Fisher Scientific	88882005
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43819
EGTA 钠盐	Sigma-Aldrich	E8145
汉密尔顿注射器	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 μL、25 uL 和 50 μL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
氢气过氧化物溶液 30% W/W	默克	H1009
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399
L-（&减;-苹果酸	Sigma-Aldrich	M7397
氯化镁六水合	Sigma-Aldrich	M2393
MES 钠盐	Sigma-Aldrich	M3885
显微解剖钳，弯曲	Sigma-Aldrich	F4142
显微解剖钳，直	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - 过滤器套装 Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利	44321-01	Fasching M， Sumbalova Z， Gnaiger E （2013） O2k 荧光测定法：小鼠脑线粒体中的 HRR 和 H2O2 产生。线粒体生理学网络 17.17。
O2K - 荧光 LED2 - 模块组件 荧光传感器 绿色	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利	44210-01
寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876	（来自散色链霉菌;寡霉素 A、B 和 C
的混合物 OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利	http://www.oroboros.at
棕榈酰肉碱（棕榈酰-DL-肉碱-HCl）	Sigma-Aldrich	P4509
辣根过氧化物酶	Sigma-Aldrich	P8375
培养皿、聚苯乙烯	MERCK	P5606
磷酸肌酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	P7936
磷酸二氢钾二氢	Sigma-Aldrich	PHR1330
氢氧化	钾Sigma-Aldrich	221473
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
皂苷	Sigma-Aldrich	SAE0073
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280
琥珀酸钠二六水合物	Sigma-Aldrich	S2378
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625