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通过高分辨率呼吸测定法评估坐骨神经中的线粒体功能

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DOI：

10.3791/63690

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2022年5月5日

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

本文内容

摘要

高分辨率呼吸测定结合荧光传感器可测定线粒体的耗氧量和活性氧（ROS）的生成。本方案描述了一种用于评估通透化坐骨神经中线粒体呼吸速率和ROS产生的技术。

摘要

外周神经中的线粒体功能障碍伴随多种与外周神经病变相关的疾病，这些疾病可由多种因素引发，包括自身免疫性疾病、糖尿病、感染、遗传性疾病和肿瘤。由于样本量小、组织中线粒体数量有限以及存在髓鞘结构，评估小鼠外周神经中的线粒体功能具有挑战性。本研究中描述的技术通过采用一种源自肌纤维实验的特异性透化方案，直接评估坐骨神经的线粒体功能，而无需从组织中分离线粒体，从而显著降低了上述困难。通过使用Amplex Red/过氧化物酶法测定荧光性活性物质的生成，并在皂苷透化的神经组织中比较不同的线粒体底物与抑制剂，可同时检测线粒体呼吸状态、活性氧（ROS）水平以及线粒体复合物的活性。因此，与其它技术相比，本文所提出的方法在评估线粒体功能方面具有优势。

引言

线粒体对于维持细胞活力至关重要，并执行多种细胞功能，例如能量代谢（包括葡萄糖、氨基酸、脂质和核苷酸代谢通路）。作为活性氧（ROS）产生的主要场所，线粒体在多种细胞信号传导过程（如细胞凋亡）中发挥核心作用，并参与铁硫（Fe-S）簇的合成、线粒体蛋白质的导入与成熟，以及其基因组和核糖体的维持1,2,3。线粒体膜动力学网络由融合和分裂过程调控，同时还具备质量控制机制和线粒体自噬（mitophagy）系统4,5,6。

线粒体功能障碍与多种病理状态的出现相关，例如癌症、糖尿病和肥胖症7。在线粒体功能紊乱中，可观察到影响中枢神经系统的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病8,9、帕金森病10,11、肌萎缩侧索硬化症12,13和亨廷顿病14,15。在周围神经系统中，轴突中的线粒体功能丧失可见于免疫性神经病，如吉兰-巴雷综合征16,17；并且轴突中高水平的线粒体活性氧（ROS）产生与这些事件相关，可导致施万细胞中MAP激酶的激活18。这表明线粒体生理功能可能不仅对特定部位的细胞至关重要，而且对整个组织都具有关键作用。在与HIV相关的远端感觉多发性神经病（HIV-DSP）中，线粒体在转录反式激活蛋白（HIV-TAT）介导HIV高效复制的机制中发挥重要作用，同时也参与HIV感染致病过程中的其他多种功能19,20。

坐骨神经线粒体生理学的评估已成为研究神经病变的关键靶点7,21,22。在糖尿病性神经病变中，蛋白质组学和代谢组学分析表明，糖尿病中大多数分子改变会影响坐骨神经线粒体的氧化磷酸化和脂质代谢7。这些改变似乎也是肥胖诱导糖尿病的早期征象21。在化疗诱导疼痛性神经病变的小鼠模型中，坐骨神经线粒体功能障碍表现为氧化磷酸化降低22，以及线粒体复合物活性、膜电位和ATP含量的减少23。然而，尽管已有多个研究组提及神经病变中的线粒体功能障碍，但这些研究仅限于测定线粒体复合物的活性，未保留线粒体膜结构，缺乏对线粒体完整性的评估，也未将ATP含量作为线粒体ATP生成能力的检测指标。通常，对线粒体氧消耗和活性氧（ROS）生成的准确评估需要通过Percoll/蔗糖梯度差速离心法分离线粒体。由于所需组织量较大，且存在线粒体丢失和破坏的问题，线粒体的分离对于坐骨神经组织而言也可能成为限制因素。

本研究旨在提供一种用于测量坐骨神经线粒体生理功能的实验方案，包括线粒体耗氧量和活性氧（ROS）的产生，同时保持线粒体膜的完整性，且无需分离线粒体。该方案改编自利用高分辨率呼吸测定法（HRR）对通透化肌纤维进行耗氧量检测的方法24。该方法的优势在于能够使用少量组织（如坐骨神经）评估线粒体功能，并在原位（in situ）条件下检测线粒体参数，从而保留线粒体所处的微环境、结构及生物能量特征，获得具有生理可信度的结果。在线粒体呼吸状态的测定中，通过对坐骨神经进行通透化处理后，使用底物和抑制剂来准确评估线粒体生物能量状态以及细胞色素c释放系数，以反映线粒体膜的完整性，同时提供线粒体电子传递链（ETS）评估步骤及关键参数计算的指导。本研究可为探索坐骨神经代谢参与的病理生理机制（如周围神经病变）相关科学问题提供技术工具。

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方案

本方案已获得 CCS/UFRJ 动物研究伦理委员会（CEUA-101/19）以及美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南批准。坐骨神经取自四月龄雄性 C57BL/6 小鼠，小鼠依据机构指南通过颈椎脱位法实施安乐死。本方案步骤经过优化，以避免线粒体功能退化。因此，在本方案中，先于小鼠坐骨神经组织的分离与通透化处理之前，完成对极谱氧传感器的校准。

1. 试剂的准备

  1. 配制组织保存缓冲液（TP缓冲液）。
    1. 使用超纯水溶液配制以下试剂：含0.1 μM游离钙的10 mM Ca-EGTA缓冲液、20 mM咪唑、20 mM牛磺酸、50 mM K-MES、0.5 mM DTT、6.56 mM MgCl2、5.77 mM ATP、15 mM磷酸肌酸（见材料表），pH值调至7.1。置于-20°C保存。
  2. 配制线粒体呼吸缓冲液（MR缓冲液）。
    1. 使用超纯水溶液配制以下试剂：0.5 mM K2EGTA、3 mM MgCl2、60 mM MES、20 mM牛磺酸、10 mM KH2PO4、20 mM HEPES、110 mM D-蔗糖、1 mg/mL BSA（无脂肪酸）（见材料表），pH值调至7.4。置于-20°C保存。
  3. 将5 mg皂苷（见材料表）溶于1 mL TP缓冲液（步骤1.1）中，配制成皂苷储备液，并置于冰上保存。皂苷需新鲜配制。
  4. 用DMSO重悬Amplex Red粉末（见材料表），配制成2 mM的储备液，分装后于-20°C避光保存。
    ​注意：为避免反复冻融导致试剂损耗，建议分装保存，储存时间不超过6个月25。

2. 高分辨率呼吸测定法（HRR）中极谱氧传感器的校准

  1. 清洁仪器的HRR室和注射器（参见材料表）。
    1. 打开HRR室，加入蒸馏水至满，搅拌5分钟，重复3次。随后用乙醇重复相同步骤，再用蒸馏水重复一次。用蒸馏水/乙醇/蒸馏水依次清洗密封塞和注射器，每种液体清洗3次。
  2. 在HRR软件中设置以下校准参数（参见材料表）。
    1. 在HRR软件控制界面中，输入实验温度（37 °C）、氧传感器参数（增益为2，极化电压为800 mV）以及安培传感器参数（增益为1000，极化电压为100 mV）。
  3. 校准氧传感器。
    1. 将2.1 mL MR缓冲液（步骤1.2）移入每个HRR室中。用密封塞封闭后，向室内抽入空气直至形成气泡。在37 °C下以校准模式持续搅拌1小时，直至单位质量的氧通量趋于稳定。
    2. 根据制造商的操作规程24，在软件中对极谱式氧传感器进行空气校准。
      ​注意：校准步骤仅在实验前进行一次。在相同呼吸介质和温度条件下进行的后续实验，只需清洗HRR室（步骤2.1）即可。

3. 坐骨神经的解剖与通透化

  1. 按照以下步骤取出坐骨神经。
    1. 将动物从笼中取出并轻轻固定于实验台面上，通过颈椎脱位法处死动物。
    2. 对已处死的动物，在其下背部以剪刀做一开口，起始于脊柱附近，沿大腿向足部方向切开。剥离附着于神经的皮肤和肌肉，随后剪断并完整取出坐骨神经。
    3. 立即称量组织重量，并将其置于装有冷TB缓冲液（4 °C）的样品瓶中。步骤3.2–3.3需在冰上操作。
      注意：湿组织重量用于后续步骤中氧气消耗和ROS生成速率的标准化。若无法立即称重，请将组织保存在冷TB缓冲液中。该操作需使用新鲜组织，禁止冷冻，以避免线粒体损伤。
  2. 进行组织制备时，将坐骨神经置于培养皿中，加入足量TP缓冲液以完全浸没组织。用一对镊子夹住神经一端，另用一对镊子水平牵拉神经束。
    注意：此操作必须在10分钟内完成，以防止组织降解。当组织呈现透明雾状层时即为制备完成，与此前白色不透明状态相反（图1）。
  3. 首先，将分散的组织转移至含1 mL TP缓冲液的小型培养皿中，用于组织透化处理。开始透化前，用镊子将组织转移至另一含1 mL TP缓冲液和10 µL皂苷（来自步骤1.3的储备液）的培养皿中。
    1. 在微量板摇床上轻柔振荡30分钟，然后用镊子将组织转移至含1 mL MR缓冲液的新培养皿中，继续轻柔振荡10分钟。最后用镊子将组织转移至已校准的高分辨率呼吸测定室（HRR chamber）中。

4. 氧消耗和活性氧生成的测定

  1. 将2.1 mL MR缓冲液加入HRR chamber中，加入Amplex Red（步骤1.4），使其终浓度为5 µM，过氧化物酶至2 U/mL，并加入已透化的坐骨神经（步骤3）。
    1. 安装仪器的荧光传感器，关闭软件控制区域的灯光，点击Connect to oxygraph。在软件的"edit protocols"中，输入步骤3.1.3中测得的组织重量。
  2. 进入"layout"，选择"specific flux per unit sample"选项，并点击Plots 以同时获取氧气消耗读数，如需要，还可获取H2O2生成量。等待约10分钟。
    注意：此时间用于在未添加底物（基础状态）的情况下稳定基础氧气消耗流速。在进行后续注射前，需确保氧气流速已稳定。
  3. 注入两轮H2O2，每轮终浓度为260 µM，用于后续在chamber中进行校准。
  4. 注入20 μL琥珀酸（见材料表），作为线粒体复合体II的底物，以激活线粒体电子传递系统。
    注意：此时可添加不同的线粒体底物，以评估不同复合体的线粒体功能。使用线粒体复合体I和II不同底物的代表性结果见图2和图3。此时，在图3中可同时观察到O2消耗和H2O2生成的增加。
  5. 加入20 µL二磷酸腺苷（ADP），以激活三磷酸腺苷（ATP）的合成。
    注意：ADP可刺激ATP合成并降低膜电位。预期可观察到O2消耗增加，同时H2O2生成减少26,27。
  6. 依次加入5 µL细胞色素c（见材料表），作为膜完整性的指示剂。
    注意：若组织制备良好且已充分透化，细胞色素c引起的氧气消耗增加不应超过15%。若出现更大增幅，请参阅故障排除部分的建议。
  7. 以每次0.2 µg/mL的寡霉素（见材料表）分次滴定，直至O2消耗不再进一步下降。
    注意：寡霉素通过抑制ATP合成发挥作用，导致O2流速下降，并因高膜电位而促进H2O2的生成26,27。
  8. 以每次0.5 µmol/L的羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）（见材料表）分次滴定，即线粒体解偶联剂，直至O2消耗不再进一步增加。实验结束时，注入2 µL抗霉素A，使其终浓度为5 μM，并等待流速稳定。
    注意：注入FCCP后，由于膜电位消散，H2O2生成减少。抗霉素A抑制复合体III，从而阻断电子传递。因此，线粒体依赖的O2消耗受损，单位质量的氧通量下降，同时促进电子泄漏，导致H2O2生成增加26,27。
  9. 进入命令栏，在软件中搜索"multisensory"，点击Control > Save file and Disconnect。
    注意：可根据研究问题添加其他底物和抑制剂。代表性结果中描述了一个示例。实验结束后，按照制造商的方案进行H2O2校准28。
  10. 打开保存的文件，选择"Oxygen Flux per Mass"曲线以获取实验中的氧气消耗结果。通过按Shift + 左键手动选择两次注射之间的窗口。
    1. 进入Marks > Statistics 以查看每次底物/抑制剂/解偶联剂注射的结果。对于H2O2生成，使用"Amp-Slope"曲线执行相同操作。
      注意：选择窗口时，应避开加样体积引起的人工干扰，选择氧气（或H2O2）更稳定且恒定的区间。代表性结果中用黑色大括号标示了所选窗口示例（图2和图3）。

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结果

通透化坐骨神经的线粒体耗氧量以如下方式表示 图2。红色轨迹代表 O2 每毫克组织每秒的皮摩尔氧通量（pmol/s·mg）。在记录内源性底物支持下的基础耗氧量（常规呼吸）后，加入琥珀酸（SUCC）以检测复合体II（琥珀酸脱氢酶）驱动的呼吸，导致耗氧速率升高。随后加入饱和浓度的ADP，激活ATP合酶，推动氧化磷酸化过程，使线粒体呼吸进入磷酸化状态。磷酸化状态下的呼吸是指ATP合酶利用质子梯度形成的膜电位作为质子驱动力，将ADP与无机磷酸盐（Pi）合成为ATP。26随着ATP合酶活性促进膜电位降低，耗氧速度加快，可观察到氧流增加。外源性细胞色素c（CYTC）的加入仅引起呼吸的轻微增强，证明本实验所用线粒体外膜结构完整。组织透化处理可能损伤膜完整性并导致细胞色素c丢失。若呼吸速率增加超过10%-15%，则提示线粒体受损及组织制备不当28,29在该代表性结果中，呼吸作用增加了8.7%，表明组织制备质量良...

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讨论

多种伴随神经病变的疾病或病理状态均以线粒体功能障碍作为风险因素。评估外周神经中线粒体的功能对于阐明线粒体在这些神经退行性疾病中的作用至关重要。由于分离方法困难且组织材料有限，线粒体功能的评估工作十分繁琐。因此，开发无需分离线粒体的组织透化技术至关重要。

为了评估透化组织中的线粒体功能，选择一种能够透化细胞质膜而不干扰细胞呼吸作用的化学试剂至关重要。在坐骨神经等外周神经中，髓鞘的脂质成分约占70%，其中大部分为胆固醇33,34。选择如皂苷（saponin）和毛地黄皂苷（digitonin）等可与胆固醇分子相互作用的透化试剂，可形成允许底物进入线粒体机制的孔道，同时不干扰其他细胞结构35,36。本方案借鉴了Pesta和Gnaiger24所描述的、用于肌纤维透化的成熟方法，并将其应用于坐骨神经。透化过程还包括...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由Serrapilheira研究所、里约热内卢州研究支持基金会（FAPERJ）、国家科学技术发展委员会（CNPq）以及巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）资助。我们感谢Antonio Galina Filho博士、Monica Montero Lomeli博士和Claudio Masuda博士在实验室设施方面提供的支持，同时感谢Martha Sorenson博士对改进本文提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺苷-5'三磷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichA26209
腺苷-5′-二磷酸钠盐Sigma-AldrichA2754
Amplex Red 试剂Thermo Fisher ScientificA12222Amplex Red 根据产品说明书用 DMSO 配制
抗霉素 A（源自链霉菌属）Sigma-AldrichA8674
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7030热激组分，无蛋白酶，无脂肪酸，基本无球蛋白，pH 7，≥98%
碳酸钙Sigma-AldrichC6763
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）Sigma-AldrichC2920
细胞色素 cSigma-AldrichC7752（源自马心；小分子血红素蛋白）
DataLab 版本 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
数字轨道微量板振荡器 120VThermo Fisher Scientific88882005
DL-二硫苏糖醇Sigma-Aldrich43819
EGTA 钠盐Sigma-AldrichE8145
Hamilton 注射器Sigma-AldrichHAM8007510 µL、25 µL 和 50 µL
HEPESSigma-AldrichH3375
过氧化氢溶液 30% W/WMerckH1009
咪唑Sigma-AldrichI2399
L-(−)-苹果酸Sigma-AldrichM7397
氯化镁六水合物Sigma-AldrichM2393
MES 钠盐Sigma-AldrichM3885
显微解剖镊子，弯头Sigma-AldrichF4142
显微解剖镊子，直头Sigma-AldrichF4017
O2K - Amplex Red 滤光片组OROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-荧光测定法：小鼠脑线粒体中的高分辨率呼吸和 H2O2 生成。Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - 荧光 LED2 模块组件 荧光传感器绿色OROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
寡霉素Sigma-AldrichO4876（源自淀粉液化链霉菌；寡霉素 A、B 和 C 的混合物）
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Austriahttp://www.oroboros.at
棕榈酰肉碱（棕榈酰-DL-肉碱盐酸盐）Sigma-AldrichP4509
辣根过氧化物酶Sigma-AldrichP8375
培养皿，聚苯乙烯材质MERCKP5606
磷酸肌酸二钠盐水合物Sigma-AldrichP7936
磷酸二氢钾（一元碱式）Sigma-AldrichPHR1330
氢氧化钾Sigma-Aldrich221473
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875
皂苷Sigma-AldrichSAE0073
丙酮酸钠Sigma-AldrichP5280
琥珀酸钠二碱式六水合物Sigma-AldrichS2378
蔗糖Sigma-AldrichS9378
牛磺酸Sigma-AldrichT0625

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