通过高分辨率呼吸测量法评估坐骨神经的线粒体功能

Summary

高分辨率呼吸测量与荧光传感器相结合，可测定线粒体耗氧量和活性氧 （ROS） 生成。本方案描述了一种评估透化坐骨神经中线粒体呼吸频率和ROS产生的技术。

Abstract

周围神经的线粒体功能障碍伴随着与周围神经病变相关的几种疾病，这些疾病可由多种原因引发，包括自身免疫性疾病，糖尿病，感染，遗传性疾病和肿瘤。评估小鼠周围神经中的线粒体功能可能具有挑战性，因为样本量小，组织中存在有限数量的线粒体以及髓鞘的存在。本工作中描述的技术通过使用适用于肌肉纤维的独特透化方案来评估坐骨神经线粒体功能，而不是从组织中分离线粒体，从而最大限度地减少了这些挑战。通过使用 Amplex Red/过氧化物酶测量荧光反应物的产生，并比较皂苷透化神经中的不同线粒体底物和抑制剂，可以同时检测线粒体呼吸状态、活性氧 （ROS） 和线粒体复合物的活性。因此，与通过其他技术评估线粒体功能相比，这里介绍的方法具有优势。

Introduction

线粒体对于维持细胞活力至关重要，并执行许多细胞功能，如能量代谢（葡萄糖，氨基酸，脂质和核苷酸代谢途径）。作为活性氧（ROS）产生的主要部位，线粒体是细胞凋亡等几个细胞信号传导过程的核心，并参与铁硫（Fe-S）簇的合成，线粒体蛋白的导入和成熟，以及维持其基因组和核糖体^1，2，3。线粒体膜动力学网络由融合和裂变过程控制，它们还具有质量控制和线粒体自噬^4，5，6的机制。

线粒体功能障碍与几种病理状况的出现有关，例如癌症，糖尿病和肥胖^症7。线粒体功能紊乱在影响中枢神经系统的神经退行性疾病中检测到，如阿尔茨海默病^8，9，帕金森病^10，11，肌萎缩性侧索硬化症^12，

Protocol

本议定书由研究中使用的动物伦理委员会CCS / UFRJ（CEUA-101 / 19）和美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南批准。坐骨神经从四个月大的雄性C57BL / 6小鼠中分离出来，根据机构指南通过宫颈脱位安乐死。方案步骤经过优化，以避免线粒体恶化。因此，在该方案中，在小鼠坐骨神经组织解剖和透化之前进行极谱法氧传感器的校准。

1. 试剂的制备

1. 准备组织保存缓冲液（TP缓冲液）。
   1. 在超纯水溶液中制备以下试剂:10 mM Ca-EGTA缓冲液与0.1μM游离钙，20mM咪唑，20mM牛磺酸，50mMK-MES，0.5mMDTT，6.56mM氯化镁₂，5.77mMATP，15mM磷酸肌酸（见 材料表），pH 7.1。储存在-20°C。
2. 准备线粒体呼吸缓冲液（MR缓冲液）。
   1. 在超纯水溶液中制备以下试剂:0.5 mM K₂EGTA，3 mM氯化镁₂，60 mM MES，20 mM牛磺酸，10 mM KH₂PO₄，20 mM HEPES，110 mM D-蔗糖，1mg / mLBSA（无脂肪酸）（见 材料表），pH 7.4。储存在-20°C。

Results

透化坐骨神经的线粒体氧消耗量如图 2所示。红色迹线表示每单位质量的O₂ 通量，以pmool/s.mg为单位。在用内源性底物（常规呼吸）记录基础氧消耗量后，注射琥珀酸盐（SUCC）以记录复合物II（琥珀酸脱氢酶）驱动的呼吸，导致耗氧速率增加。按顺序，加入饱和浓度的ADP，激活ATP合酶并驱动氧化磷酸化。这导致线粒体呼吸的磷酸化状态。磷酸化状态呼吸是指ATP合酶可以从ADP + Pi（无机磷酸盐）中产生ATP，利用质子梯度形成的膜电位作为质子动力来产生ATP²⁶。随着ATP合酶活性促进膜电位的降低，氧消耗加速，氧流量增加。外源性细胞色素c（CYTC）的添加仅促进了对呼吸的最小刺激，证明了该制剂的线粒体外膜完整性。组织的透化会破坏膜的完整性和细胞色素c的损失。呼吸速率增加超过10%-15%表明线粒体受损和组织准备不足^28，29。在该代表性结果中，呼吸增加8.7%，表明组织制备质量良好（

Discussion

伴随神经病变的几种疾病或病症将线粒体功能障碍作为危险因素。评估周围神经的线粒体功能对于阐明线粒体在这些神经退行性疾病中的行为至关重要。由于分离方法的困难和材料的稀缺性，线粒体功能的评估是费力的。因此，开发不需要分离线粒体的组织透化技术至关重要。

为了评估透化组织中的线粒体功能，选择一种能够透化细胞质膜而不干扰细胞呼吸的化学物质至关重要。在周围神经如坐骨神经中，髓鞘组成约为70%的脂质，其中大部分是胆固醇^33，34。选择与胆固醇分子相互作用的透化剂，如皂苷和洋地黄苷，导致孔隙允许底物进入线粒体机制而不会干扰其他细胞室^35，36。在该协议中，Pesta和Gnaiger²⁴ 描述的皂苷肌纤维渗透的成熟方法适用于坐骨神经。渗透化过程包括关于组织分离的另一个关键步骤，以允许根据记录感兴趣的线粒体参数所需的底物进行.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
腺苷 5' 三磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	A26209
腺苷 5′-二磷酸钠盐	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red 试剂	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red 在 DMSO 中制备，符合产品数据表
抗霉素 A（来自链霉菌属）	Sigma-Aldrich	A8674
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030	热休克组分，无蛋白酶，无脂肪酸，基本无球蛋白，pH 值 7 和 ge;98%
碳酸钙	Sigma-Aldrich	C6763
羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）苯腙 （FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920
细胞色素 c	Sigma-Aldrich	C7752	（来自马心脏;小血红素蛋白）
DataLab 版本 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利		（c） 2002 - 13 由 Erich Gnaiger 博士
数字轨道微孔板摇床 120V	Thermo Fisher Scientific	88882005
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43819
EGTA 钠盐	Sigma-Aldrich	E8145
汉密尔顿注射器	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 μL、25 uL 和 50 μL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
氢气过氧化物溶液 30% W/W	默克	H1009
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399
L-（&减;-苹果酸	Sigma-Aldrich	M7397
氯化镁六水合	Sigma-Aldrich	M2393
MES 钠盐	Sigma-Aldrich	M3885
显微解剖钳，弯曲	Sigma-Aldrich	F4142
显微解剖钳，直	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - 过滤器套装 Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利	44321-01	Fasching M， Sumbalova Z， Gnaiger E （2013） O2k 荧光测定法：小鼠脑线粒体中的 HRR 和 H2O2 产生。线粒体生理学网络 17.17。
O2K - 荧光 LED2 - 模块组件 荧光传感器 绿色	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利	44210-01
寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876	（来自散色链霉菌;寡霉素 A、B 和 C
的混合物 OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS，奥地利	http://www.oroboros.at
棕榈酰肉碱（棕榈酰-DL-肉碱-HCl）	Sigma-Aldrich	P4509
辣根过氧化物酶	Sigma-Aldrich	P8375
培养皿、聚苯乙烯	MERCK	P5606
磷酸肌酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	P7936
磷酸二氢钾二氢	Sigma-Aldrich	PHR1330
氢氧化	钾Sigma-Aldrich	221473
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
皂苷	Sigma-Aldrich	SAE0073
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280
琥珀酸钠二六水合物	Sigma-Aldrich	S2378
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625