针对咖啡浆果螟子下皮测试控制剂和杀虫剂 的方法

咖啡浆果螟（CBB）， 即汉贝亚螟，于1988年在哥伦比亚首次被发现，此后成为咖啡作物中最重要的害虫种类。CBB雌性离开已经受精的出生果实，在它们排放的挥发性化学物质的指导下寻找新的果实^1，2。在25°C的温度下，在23天³ 内完成一个完整的循环。 这个循环从创始人雌性穿透种子并在果实胚乳中产卵开始。蜕皮的幼虫吃掉种子。如果此时解剖果实，就有可能同时观察创始雌性和她的后代。14天后，幼虫变成蛹 - 一般来说，蛹期持续5天。在成年期，雌性与兄弟姐妹交配，新受精的雌性从受损的水果中飞走，寻找新的咖啡果实，开始新的周期⁴。

渗透过程和幼虫喂养的结果都会损害咖啡种子，降低咖啡饮料的质量并显着降低收入;咖啡种植园中超过5%的感染通常被认为是经济阈值。

CBB控制基于病虫害综合治理（IPM）策略，包括文化控制和农艺实践，天然生物制剂以及化学杀虫剂的使用，这需要安全条件和及时应用⁴.

为了评估用于控制CBB的新杀虫剂，需要低成本的方法，以便能够快速获得结果。目前正在使用实验室和现场程序，包括含有含有杀虫剂的咖啡的人工日粮^5，6，或将杀虫剂喷洒在干羊皮纸咖啡^7，8，9上。此外，据报道，使用覆盖有昆虫学套筒的咖啡树枝在野外进行的实验有^10，11;然而，这些方法需要高强度的劳动和漫长的评估周期。

一种类似于自然场条件的条件，也是快速和廉价的，是使用绿色或成熟的咖啡水果。但是，这些水果必须在适合开发CBB的条件下进行维护，避免微生物的改变和污染物，以保持其质量和性能。为此，使用了不同的消毒剂，以及涉及热和辐射^{的程序7，9}，^{12，13，14，15，16}。

此外，针对CBB的杀虫剂评估方法需要模拟成年雌性飞行寻找水果或穿透这些水果^17，18。为此，人工水果侵扰已经在现场^{进行了8，11，19}，尽管该过程是劳动密集型的并且取决于环境条件。

在这里，我们描述了一种标准化的产品评估方法，这些产品在类似于现场条件的受控环境条件下可能对CBB产生不同影响。

注意:该协议涉及不同的方法来识别实验室条件下对CBB的不同影响。

1. 水果收藏

1. 清晨从咖啡种植园的树上开花后约120-150天的发育年龄的GF。

2. 水果消毒²⁰

1. 将大约300个GF带到实验室。选择大小均匀且健康的GF并取出花梗。
2. 将GF浸入肥皂溶液中（2毫升液体洗碗皂在998毫升自来水中），然后摩擦以洗涤GF。然后，用水冲洗水果，换水三次。
3. 将GF浸入0.5%次氯酸钠溶液（100mL在900mL自来水中），并在振荡器中以110rpm搅拌15分钟。然后，通过在振荡器中搅拌并更换水三次，每10分钟用水冲洗GF。
4. 用无菌纸巾擦干GF。
5. 将GF放入托盘（33 cm x 25 cm x 2 cm）中并照射15分钟，将GF放置在距UV源55 cm的距离处，位于启用UV的水平层流站内。
6. 在15分钟期间，每5分钟移动一次GF以确保整个水果的照射。

3. 昆虫消毒²¹

1. 使用新出现的（当天）CBB昆虫来设置生物测定。
2. 将CBB浸入0.5%次氯酸钠溶液中，用刷子缓慢搅拌10分钟。
3. 用平纹细布过滤CB，并用无菌蒸馏水清洗三次。
4. 用无菌纸巾去除多余的水。

4.评估对水果具有保护作用的产品（预感染） （图1）

1. 每个实验单元使用一组GF。通常，每个实验单元使用一组30个GF。
2. 将GF放入塑料盒中（实验单元）。
3. 将测试产品以不同的浓度进行评估。使用便携式喷雾器装置进行应用。这里对生物碱乳液的5%和6%进行了测试。
4. 作为对照，用水喷洒一组GF。
5. 每次处理至少使用三次重复（实验单元），一个接一个地喷洒。
6. 在无菌罩中，每个GF释放两个CBB成虫（总共60个CBB被引入塑料盒中）。30分钟后，盖上盒子。
7. 将装有受感染GF的塑料盒放在受控条件下（黑暗，25±2°C，相对湿度71%±5%）。
8. 1、7、15 和 21 天后，计算每个盒子中水果外的螟虫果实以及活昆虫和死虫的数量。
9. 感染后20天，在立体显微镜下解剖每个GF，放大10倍。
10. 计算每个水果中被昆虫破坏的健康种子或种子的数量。
11. 计算观察到的不同CBB生物阶段²² ，并计算每个种子中死亡昆虫的数量，以确定每个实验单元的昆虫死亡率。

5. CBB感染后（感染后）产品效果的评估 （图3）

1. 每次护理使用 200 个水果的组。
2. 在无菌罩中，将CBB成虫（CBB成虫与GF的比例为2:1）释放到先前消毒的GF中，使感染在21°C下进行3小时。
3. 检查 GF。3小时后，大多数应该被感染，CBB的腹部仍然暴露（位置A²⁰），如图 2所示。
4. 选择46个受感染的GF（位置A）并将它们放置在96孔塑料架（实验单元）中。水果应保持在此位置，以便处理可以直接喷洒在CBB上穿孔水果上。
5. 每次治疗至少喷洒三次（三个架子），一个接一个，30分钟后覆盖架子。
6. 将装有受感染的GF的架子放在受控条件（黑暗，25±2°C，相对湿度71%±5%）下。
7. 20天后，在立体显微镜下以10倍放大率解剖GF。
8. 计算每个水果中被昆虫破坏的健康种子或种子的数量。
9. 计算不同的CBB生物阶段²² 和每个种子中死亡昆虫的数量，以确定每个实验单元的昆虫死亡率。

6. 对CBB具有威慑作用的产品进行评估

1. 按照概述的步骤4.1-4.6评估对水果具有保护作用的产品。
2. 将CBB成虫放到塑料盒中后，数一数从盒子里飞走的CBB的数量以及感染GF的数量。然后，按照步骤 4.7-4.11 进行操作。
3. 按照概述的步骤5.1-5.5在CBB感染后评估产品。
4. 在将每种处理喷洒在位置A的昆虫上后，计算离开GF和/或飞离GF的CBB的数量。然后，按照步骤 5.6-5.9 进行操作。

7. 统计分析

注意:响应变量是一段时间内的死亡率百分比和健康未感染的咖啡种子的百分比。

1. 估计每次治疗的每个响应变量的平均值和标准偏差。
2. 使用完全随机设计的模型执行每个响应变量的方差分析。
   注意:Dunnett的5%比较测试是将处理与绝对控制（水控制）进行比较的。
3. 当治疗与绝对对照显着不同时，使用5%最小显着差异（LSD）测试来比较治疗。
4. 评估测试的功效;如果大于 85%，则满足方差的正态性和同质性假设。

图1:评估杀虫剂对CBB的预感染影响的程序。 使用绿色水果（GF）评估杀虫剂对 汉贝下颌 骨（CBB）的侵扰前影响的步骤。（A） 水果选择。（二）将杀虫剂喷洒在咖啡果实上。（C） 咖啡果实的CBB感染率为每GF2:1 CBB。（D） 受感染的水果。（E）在受控条件下孵化水果。（F）水果解剖。（G）计算种子内的CBB种群。 请点击此处查看此图的大图。

图2:加工咖啡果实的CBB感染。 受感染的水果含有CBB成虫，其腹部部分暴露（位置A）。 请点击此处查看此图的大图。

图3:评估杀虫剂对CBB的危害作用的程序。 使用GF评估杀虫剂对CBB的侵扰后影响的步骤。（B） 以每GF2:1 CBB的比例侵扰果实。（C） 选择受感染的水果。（D） 在水果上喷洒杀虫剂。（E） 果实的孵化。（F）水果解剖。（G） 计算建立信任措施的人口。请点击此处查看此图的大图。

结果表明，CBB雌性识别果实，根据果实表面的特征和散发的气味，CBB雌性在21 °C下3 h内开始穿透或结出果实。

当在24小时后施用于咖啡果实（预感染程序）时，杀虫剂对CBB的影响如图 4所示。根据LSD试验，两种杀虫剂（生物碱乳液为5%和6%）在第20天（表1）造成高昆虫死亡率，与水绝对对照（P <0.001）相比差异显着。关于未感染的健康种子的百分比（表1），根据Dunnett在5%（P <0.001）的测试，对照组和杀虫剂组之间也存在差异。在对照组中，37%的种子没有受到感染，而杀虫剂的使用保护了种子，使用杀虫剂2时94%的种子保持健康，使用杀虫剂1时保持89%的种子健康。

图4:对照杀虫剂的感染前效应与两组杀虫剂的对比。 杀虫剂的预感染作用。在感染后第 1、7、15 和 21 天评估成年汉贝 血吸虫的死亡率百分比。 请点击此处查看此图的大图。

表1:预感染处理对CBB的影响。 20天后死亡率百分比和百健康种子。*对于每个变量，根据Dunnett在5%处的测试，与对照（水）的差异。

21天后的预感染结果如 表1所示， 随时间推移的结果如图 4所示。在这种情况下，咖啡果实上覆盖着一种导致昆虫死亡的有毒物质。当昆虫走过水果，用手掌品尝水果或开始咀嚼水果的表皮时，它们就会怀孕。此外，施加在水果表面的物质可以改变或改变水果的自然气味，因此CBB个体可能会阻止感染过程，要么飞走，要么宁愿与水果分离而不接触或感染它。根据产品的作用时间，昆虫死亡或避免侵扰行为可持续24小时或更长时间。

另一方面，如果在昆虫开始结出果实（感染后）后施用产品，则产品可以穿透昆虫角质层，导致昆虫死亡（表2 和 图5）。杀虫剂2的死亡率最高（P <0.01）。如果死亡迅速发生，昆虫将在进入种子之前死亡，并且在种子内不会发现卵或昆虫种群。

图5:杀虫剂的侵扰后影响。 在感染后第 1、7、15 和 21 天评估成年 汉贝 血吸虫的死亡率百分比。 请点击此处查看此图的大图。

表2:感染后处理对CBB的影响。 20天后死亡率百分比和健康种子百分比。*对于每个变量，根据Dunnett在5%处的测试，与对照（水）的差异。对于每个变量，不同的字母表示根据LSD 5%的差异。

杀虫剂的影响反映在评估的第20天健康未感染种子的百分比（表2）。由于昆虫死亡率高，昆虫没有穿透咖啡种子并损坏它们。应用产品保护了79%-90%的咖啡种子，显示出与对照的差异，其中57%的种子被发现是健康的（P <0.01）。两种杀虫剂间差异也显著（P <0.01）。

在某些情况下，昆虫死亡得非常快，甚至在对种子造成损害之前。然而，如果昆虫的死亡需要更长的时间，昆虫可以到达种子并沉积一些卵，后来，成虫就会死亡。在这种情况下，与用水喷洒的对照组中发现的昆虫种群相比，在咖啡种子内发现昆虫种群减少（表3）。

表3:用昆虫病原体真菌和驱虫剂处理后的感染后效果。 种子内的昆虫种群。胃食管反光镜在15天时被解剖。*对于每个变量，根据Dunnett在5%处的测试，与对照（水）的差异。对于每个变量，不同的字母表示根据LSD 5%的差异。

图6 显示了具有感染后效应的产品，昆虫病原体和驱虫物质的效果，以及它们的组合作用。

图6:昆虫病原体真菌和驱虫物质的感染后效应。 成年 汉佩猪笼草 和种子损伤的死亡率百分比。 请点击此处查看此图的大图。

这些方法可以快速确定有毒产品对CBB的不同影响。

作者均无任何利益冲突可声明。