防治咖啡果小蠹 Hypothenemus hampei 的控制药剂与杀虫剂测试方法

摘要

建立了一种利用绿色咖啡果实（GFs）检测杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）毒性的方法。在CBB侵染前或侵染后，将杀虫剂或有毒物质施用于已消毒的GFs上。评估了昆虫死亡率、驱避性、繁殖能力以及其他相关参数。

摘要

在推荐使用杀虫剂防治咖啡果小蠹（CBB）Hypothenemus hampei之前，了解这些杀虫剂对成虫的致死作用和驱避效应，或其对繁殖能力的影响具有重要意义。然而，目前可用的方法仅评估成虫死亡率，这限制了具有不同作用机制的新型杀虫剂的筛选。本研究通过考察多种实验方法，旨在鉴定在实验室条件下对CBB产生的多种影响。为此，采集青咖啡果实（GFs），通过浸泡于次氯酸钠溶液并辅以紫外光照射进行消毒。同时，来自种群的CBB成虫也通过浸泡于次氯酸钠溶液进行消毒。为评估果实保护效果（预防侵染），将果实置于塑料盒中，并施用杀虫剂，随后以每颗青咖啡果实释放2只CBB成虫的比例放入成虫。将青咖啡果实置于受控环境下培养，并在1、7、15和21天后评估CBB的侵染情况和存活率。为评估CBB侵染后果实上杀虫剂的防治效果（后侵染处理），将CBB成虫以2:1的比例释放至青咖啡果实中，在21 °C下持续3小时。选择侵染后CBB成虫腹部部分外露的果实，将其置于96孔板架中，并对正在钻入果实的CBB个体进行直接处理。20天后解剖果实，记录每颗果实内CBB各生物学阶段的情况。青咖啡果实作为基质，可模拟自然条件，用于评估对CBB具有毒性、化学性和生物性的杀虫剂效果。

引言

咖啡果小蠹（CBB），Hypothenemus hampei，于1988年首次在哥伦比亚被发现，现已成为咖啡作物最重要的害虫种类。雌性CBB在已受精的状态下离开其出生的果实，依靠果实释放的挥发性化学物质寻找新的果实^1,2。在25 °C温度条件下，其完整生活周期为23天³。该周期始于“奠基雌虫”钻入种子并在果实质体中产卵。孵化出的幼虫以种子为食。若在此阶段解剖果实，可同时观察到奠基雌虫及其后代。14 天后，幼虫化蛹，通常蛹期持续5天。成虫阶段，雌虫与兄弟交配，新受精的雌虫随后飞离受害果实，寻找新的咖啡果实以开启下一个生活周期⁴。

幼虫的侵入过程及其取食活动均会损害咖啡种子，降低咖啡饮品的品质，并显著减少经济收益；咖啡种植园中虫害发生率超过5%通常被视为经济阈值。

玉米根叶甲（CBB）的防治基于综合害虫管理（IPM）策略，包括农业生态控制和农艺措施、天然生物防治因子，以及在安全条件下及时使用化学杀虫剂⁴。

为了评估新型杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）的防治效果，需要采用低成本的方法以快速获....

方案

注意：本方案介绍了在实验室条件下识别对CBB产生不同影响的多种方法。

1. 果实采集

1. 清晨时分，在咖啡种植园中选择开花后发育年龄约为120至150天的绿果（GFs）。

2. 果实消毒²⁰

1. 将约300个火龙果（GFs）带入实验室。选择大小均匀且健康的火龙果，并切除果柄。
2. 将火龙果浸入肥皂溶液（2 mL 液体洗洁精溶于998 mL 自来水中），随后轻轻揉搓清洗。然后用清水冲洗果实，每次更换清水，共冲洗三次。
3. 将火龙果浸入0.5%次氯酸钠溶液（100 mL 次氯酸钠加入900 mL 自来水中），在摇床中以110 rpm振荡处理15分钟。随后在摇床中加水振荡冲洗，每10分钟更换一次水，共更换三次。
4. 用无菌纸巾将火龙果表面擦干。
5. 将火龙果放置于托盘（33 cm × 25 cm × 2 cm）中，在紫外光水平层流洁净台内，使果实与紫外光源保持55 cm距离，照射15分钟。
6. 在照射期间，每隔5分钟翻动一次火龙果，以确保整个果实表面均得到充分照射。

3. 昆虫消毒<....

结果

结果表明，咖啡果小蠹雌虫能够识别果实，并根据果实表面的特征及释放的气味，在21 °C条件下于3小时内开始侵入或钻入果实。

在咖啡果实上施用杀虫剂（感染前处理）后24小时及随时间变化对咖啡果小蠹（CBB）的影响如图4所示。两种杀虫剂（5%和6%的生物碱乳剂）在第20天导致了较高的昆虫死亡率（表1），根据LSD检验，与清水绝对对照组相比具有显著差异（P < 0.001）。关于未受侵染的健康种子百分比（表1），根据Dunnett检验（5%水平），对照组与杀虫剂处理组之间也存在显著差异（P < 0.001）。在对照组中，有37%的种子未被侵染，而施用杀虫剂后对种子具有保护作用，使用杀虫剂2时94%的种子保持健康，使用杀虫剂1时则为89%。

讨论

在本实验方案中，果实和昆虫的消毒是关键步骤。当从田间采集的果实用于实验室时，由于表皮存在微生物和螨类，果实常常表现出严重的污染和脱水现象^7,15,16。因此，若使用未经消毒的果实或昆虫，会因细菌或真菌等微生物污染导致昆虫死亡，从而干扰生物测定结果。此前，Tapias 等人²⁰曾评估过其他用于果实消毒的抗菌剂，如多菌灵和苯扎氯铵；然而，尽管这些化合物对果实的消毒效果良好，但对咖啡果小蠹（CBB）或环境具有高度毒性。

通过将果实分别浸入0.5%次氯酸钠溶液中30分钟和15分钟，评估了该溶液的使用效果。在两种处理时间下，微生物均受到抑制，但由于该溶液具有较强的氧化性，浸渍30分钟后，CBB也受到不利影响²³。紫外线可破坏微生物的DNA²⁴，从而减少污染。然而，在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
500 mL 低型带嘴烧杯	BRAND PP	BR87826
台式摇床	New Brunswick Scientific Innova 4000 恒温振荡培养箱
洗洁精-AXION	Colgate-Palmolive	AXION
罩；水平层流工作台	Terra Universal		粉末涂层钢，1930 mm 宽 × 1118 mm 深 × 1619 mm 高，120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html)
昆虫 咖啡果小蠹	BIOCAFE		（http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html）
多折白色纸巾	科	73551
Preval 喷雾装置	普雷瓦尔·默克	Z365556-1KT	https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ 5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB
可逆式96孔架	heathrowscientific	HEA2345A	https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a
11号手术刀片	默克	S2771-100EA
N3 型手术刀柄	默克	S2896-1EA
次氯酸钠	科洛克斯公司	Clorox
体视显微镜	蔡司	Stemi 508	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html