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方法文章

HIV-1感染人源化小鼠的口服联合抗逆转录病毒治疗

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DOI：

10.3791/63696

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2022年10月6日

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1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

本方案描述了一种新型的口服联合抗逆转录病毒药物递送方法，该方法在人源化小鼠中成功抑制了HIV-1 RNA的复制。

摘要

人类免疫缺陷病毒（HIV-1）大流行仍在全球范围内持续蔓延，目前尚无针对 HIV 的有效疫苗。尽管联合抗逆转录病毒疗法（cART）在抑制病毒复制方面已取得成功，但仍无法彻底清除 HIV 感染者体内的病毒储存库。实现对 HIV 感染安全且有效的治愈策略需要采用多种手段，因此建立适用于 HIV-1 感染的动物模型对于推动 HIV 治愈研究至关重要。人源化小鼠能够重现 HIV-1 感染的关键特征。该人源化小鼠模型可被 HIV-1 感染，并可通过 cART 方案控制病毒复制。此外，在停止 cART 治疗后，人源化小鼠会出现迅速的病毒反弹。然而，向动物施用 cART 可能效果不佳、操作困难或具有毒性，许多临床上重要的 cART 方案难以得到最佳应用。此外，研究人员常用每日多次注射的方式给药，这种高强度注射过程不仅可能对研究人员造成安全风险，还会因对动物进行物理束缚而引发应激反应。本文所述的新型口服 cART 方法用于治疗 HIV-1 感染的人源化小鼠，可将病毒血症抑制至检测水平以下，提高 CD4+ 细胞恢复速率，并改善 HIV-1 感染人源化小鼠的整体健康状况。

引言

随着联合抗逆转录病毒治疗（cART）的应用，慢性人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者的预期寿命已显著改善1,2。在大多数慢性HIV-1感染者中，cART能有效抑制HIV-1的复制，并使CD4+ T细胞计数恢复至正常水平3，从而改善整体健康状况，并显著减缓疾病进展4。然而，即使在急性感染期即开始抗逆转录病毒治疗（ART），仍会形成潜伏的HIV-1储存库5,6,7。这些储存库可在ART期间持续存在多年，且在ART中断后病毒迅速反弹的现象已有充分记录8,9。接受ART治疗的HIV感染者还面临更高的共病风险，如心血管疾病、癌症和神经功能障碍10,11,12。因此，实现HIV的功能性治愈至关重要。HIV-1感染的动物模型在开发和验证新型HIV治愈策略方面具有明显优势13,14,15。人源化小鼠作为一种小型动物模型，可在不同组织中重建多谱系的人类免疫细胞，从而便于深入研究HIV感染过程16,17,18,19。在各类人源化模型中，人源化骨髓-肝脏-胸腺（BLT）模型能够成功模拟慢性HIV-1感染以及针对HIV-1感染的功能性人类免疫应答20,21,22,23,24。因此，人源化BLT小鼠模型已被广泛应用于HIV研究领域的多个方面。人源化BLT小鼠不仅是模拟持续性HIV-1感染和致病机制的成熟模型，也是评估基于细胞治疗的干预策略的重要工具。本研究作者及其他研究者已证实，人源化BLT小鼠模型能够再现持续性HIV-1感染和致病过程25,26,27，并为评估基于细胞治疗的干预策略提供了有效工具28,29,30,31,32,33。

由多种抗逆转录病毒药物组成的每日服用cART方案可抑制HIV-1复制，使接受成功治疗个体的病毒载量长期保持在检测不到的水平34。在人源化小鼠中使用临床相关cART方案治疗的结果与接受ART治疗的HIV-1感染者中观察到的结果相似22：HIV-1水平被抑制至检测限以下，而中断cART会导致潜伏病毒库中的HIV复制反弹35。皮下（SC）27,36,37或腹腔内（IP）37,38,39注射是目前人源化小鼠cART治疗常用的给药途径。然而，频繁的每日注射因需对动物进行物理固定而引发动物应激反应40。此外，该方法劳动强度高，且由于使用锐器时研究人员暴露于HIV的风险增加，可能存在安全隐患。口服给药方式能够更好地模拟HIV-1感染者服用cART药物时的吸收、分布和排泄过程，因此更为理想。口服给药通常需要将抗逆转录病毒药物加入经灭菌处理的饲料24,37,41或饮水中42,43,44,45,46，这一过程往往需要定制化操作且较为繁琐；同时，灭菌步骤对于免疫缺陷小鼠而言是必要的。然而，许多抗逆转录病毒药物可能与饲料或水在化学上不相容，或导致小鼠不愿进食或饮水，从而影响实际给药剂量及体内药物浓度。本文提出的新型经口cART给药方法克服了以往递送方式的局限性，具有与多种抗逆转录病毒药物兼容、制备和操作安全简便，以及减少因每日注射所致动物应激和焦虑等优势。

替诺福韦二吡呋酯（TDF）、艾维雷韦（ELV）和拉替格拉韦（RAL）均为水溶性较差的药物。有趣的是，高脂饮食可提高TDF的生物利用度，提示食物中的脂肪可能通过竞争性抑制脂肪酶对TDF起到一定保护作用47。因此，选择DietGel Boost营养凝胶杯替代常规啮齿类动物饲料作为给药方式，因其脂肪含量适中（每100克含20.3克），相较于常规啮齿类饲料（每100克含10克）和典型的小鼠高脂饮食（每100克含40–60克）更为适宜48。每个营养杯总重为75克，因此每杯所提供的食物量（即药物量）足以满足五只小鼠3天的需求。

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方案

匿名的人类胎儿组织通过商业途径获得。动物实验根据加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物研究委员会（ARC）批准的方案进行，符合所有联邦、州和地方的指导原则。具体而言，所有实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）和国际实验动物护理评估与认证协会（AALAC）关于实验动物饲养和护理的建议与指南，实验方案编号为UCLA ARC 2010-038-02B。所有手术均在氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（5 mg/kg）和异氟烷麻醉（2-3 vol%）下进行，并尽一切努力减轻动物的疼痛与不适。

1. 感染 HIV-1 的人源化小鼠

注意：人源化小鼠的构建方法如先前文献30,31,49所述。以下简要描述该方案。

  1. 从人胎肝中纯化CD34+造血祖细胞 通过 根据制造商方案使用抗CD34磁珠。
  2. 麻醉6至8周大的NOD/SCID/IL2Rγ−/−（NSG）雄性和雌性小鼠，并在手术前进行亚致死剂量照射（2.7 Gy）。
  3. 将来自与胎肝相同供体的胸腺植入肾包膜下，与肝脏一同移植。
  4. 植入后，通过静脉注射向小鼠注入50万至100万个CD34+细胞。
  5. 8–10 周后，采集 100 µL 小鼠血液 通过 眼后静脉丛采血50 加入含有5 µL EDTA的微量离心管中，于350 x g 3 分钟。
  6. 将血浆储存于 -80 °C，用于监测小鼠感染 HIV-1 后的病毒载量。加入 2 mL 83% NH4Cl 溶液，室温孵育 5 分钟以裂解红细胞。
  7. 加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基以终止裂解。300 x g离心 g 5 分钟。
  8. 吸弃上清液。用抗体组合对细胞进行染色（参见 材料表并通过流式细胞术分析以检测人免疫细胞的植入情况。
  9. 通过眶后静脉注射感染外周血中CD45+细胞比例超过50%的小鼠51,52 含有至少 200 ng p24 的 HIV-1 毒株（例如 NFNSXSL9）30,53,54使用胰岛素注射器采集血液，每两周一次，用于流式细胞术分析及病毒载量测定。

2. 抗逆转录病毒药物的制备

  1. 称量单个药物；例如，制备10个含cART的食物杯时，在生物安全柜中使用无菌细胞刮刀，分别将250 mg的FTC（恩曲他滨）、375 mg的TDF和500 mg的RAL或ELV称量至各自的无菌15 mL离心管中。
  2. 向250 mg FTC管中加入1 mL DMSO（终浓度为250 mg/mL），向375 mg TDF管中加入1.5 mL DMSO（终浓度为250 mg/mL），向500 mg RAL或ELV管中加入1 mL DMSO（终浓度为500 mg/mL）。搅拌或使用移液器混匀药物混合物，直至完全溶解并获得澄清溶液。
  3. 使用孔径为0.22 µm的亲水性PVDF膜滤器和无菌注射器对溶液进行除菌过滤。单个药物溶液可在-20 °C下保存12周。
  4. 使用前，将每种药物溶液的一份等分试样在37 °C下新鲜解冻至溶液澄清。使用移液器充分混匀。
  5. 混合药物并充分混匀以制备母液：1 mL溶于DMSO的FTC、1.5 mL溶于DMSO的TDF和1 mL溶于DMSO的ELV或RAL。
    注意：此剂量可制备10个食物杯。
  6. 向一个食物杯中加入350 µL cART母液，制成一个DietGel Boost cART食物杯。
  7. 向该食物杯中加入0.75 mL甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（终浓度为0.48 mg/mL）。
  8. 使用1 mL无菌移液器吸头充分搅拌。
  9. 根据需要，使用微型刮刀将含cART的食物从原杯分装至60 mm培养皿中。在天平上称量食物重量，根据小鼠数量计算每个笼子所需的含cART食物杯用量。

3. 向 HIV-1 感染小鼠施用抗逆转录病毒药物

  1. 将普通饲料从笼中移除，并替换为含有 cART 的食杯。
    注意：小鼠平均每天最多可摄食 5 g 食物。大约一个食杯可供五只小鼠摄食 2 天。
  2. 每周更换三次 cART 食物。
  3. 称量使用过的食杯以监测摄食量。每周称量小鼠体重以确认摄食情况。

4. 通过实时 PCR 监测病毒载量

  1. 每两周通过眼后静脉采血评估BLT小鼠体内的人类免疫细胞（CD4和CD8 T细胞水平）以及HIV-1的复制情况。按照步骤1.5–1.8的说明收集血浆。
  2. 监测HIV-1感染小鼠在口服cART治疗前及治疗期间共8周的血浆病毒载量。使用病毒RNA提取试剂盒从血浆中提取血浆病毒RNA，并如前所述27,30,31，利用引物和探针（见材料表）通过实时PCR进行定量。采用以下扩增程序：48 °C（15分钟），95 °C（10分钟），然后进行45个循环：95 °C（15秒）、60 °C（1分钟）。

通过流式细胞术评估 CD4/CD8 比值

  1. 按照步骤 1.5–1.8，从双周采血的外周血中制备单细胞悬液。
  2. 使用表面标志物抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。流式细胞术中使用以下表面标志物抗体27,30,43,49：CD45（克隆号 HI30）、CD8（克隆号 SK1）、CD3（克隆号 OKT3）、CD4（克隆号 RPA-T4）27,30,42,49。

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结果

假设一只平均体重为25 g的小鼠每天消耗4 g食物，则通过口服给药的每日药物剂量相当于2.88 mg/kg的替诺福韦（TFV）、83 mg/kg的恩曲他滨（FTC）以及768 mg/kg的拉替拉韦（RAL）。为了检测优化后的食物给药方案相较于每日注射cART是否具有毒性并影响整体健康状况，我们在cART治疗前及治疗期间每周监测小鼠体重，给药途径包括口服和皮下注射。各组在开始cART治疗前体重无显著差异（图1）。然而，在每日皮下注射cART期间，小鼠体重持续下降。相比之下，通过DietGel口服给予FTC/TDF/ELV或FTC/TDF/RAL的小鼠在5周后体重恢复至ART治疗前水平。此外，拉替拉韦组与艾维雷韦组之间未观察到显著的体重变化差异。

为了检测口服cART给药是否能像每日注射一样有效抑制病毒载量，采用RT-PCR方法每两周评估一次血浆病毒载量。图2显示，FTC/TDF/ELV ART食物给药方案可在4周内以100%的效率将病毒复制抑制至检测不到的水平；FT...

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讨论

本研究通过将三种抗逆转录病毒药物与高营养食物混合，建立了一种用于HIV-1感染人源化小鼠的口服cART给药方法。与每日注射给药相比，口服给药使用更简便、给药频率更低、减少了对动物的操作、最大限度地降低了应激反应，并提高了安全性55。迄今为止，仅有少数针对人源化小鼠的研究24,37,41采用含有研碎抗逆转录病毒药物的饲料颗粒来治疗小鼠。然而，由于难以获得特制饲料颗粒的生产途径，该方法难以广泛推广。其他研究42,43,44,45,46则使用饮水作为cART的递送系统。但将药物配制于饮水中...

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披露

SK 是 CDR3 公司的创始人。其余作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢Gilead公司的Romas Geleziunas博士、Jeff Murry博士及其团队提供了本研究中使用的抗逆转录病毒药物。本研究由以下项目资助：NCI 1R01CA239261-01（Kitchen主持）、NIH资助项目P30AI28697（UCLA CFAR病毒学核心、基因与细胞治疗核心及人源化小鼠核心）、U19AI149504（PIs：Kitchen & Chen）、CIRM DISC2-10748、NIDA R01DA-52841（Zhen主持）、NIAID R2120200174（PIs：Xie & Zhen）以及IRACDA K12 GM106996（Carrillo主持）。本研究还得到了UCLA艾滋病研究所、James B. Pendleton慈善信托基金以及McCarthy家族基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60 mm 培养皿Thermo Scientific Nunc150288用于分装 ART 食物
APC 抗人 CD8 抗体Biolegend344722用于流式细胞术
BD LSRFortessaBD biosciences用于流式数据采集
CD34 磁珠Miltenyi Biotec130-046-702用于构建 NSG-BLT 小鼠模型
离心管Falcon14-432-22用于溶解 ART
DietGel BoostClearH2O72-04-5022用于制备 ART 食物
ElvitegravirGilead由 Gilead 赠送
EmtricitabineGilead由 Gilead 赠送
FITC 抗人 CD3 抗体Biolegend317306用于流式细胞术
FlowJo 软件FlowJo用于流式细胞术数据分析
HIV-1 正向引物：5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′；IDT定制用于病毒载量 RT-PCR 检测
HIV-1 探针：5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′；		IDT定制用于病毒载量 RT-PCR 检测
HIV-1 反向引物：5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′；IDT定制用于病毒载量 RT-PCR 检测
人胎儿组织Advanced Bioscience Resources, Inc
小鼠品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）5557用于构建人源化小鼠模型
太平洋蓝（Pacific Blue）抗人 CD45 抗体Biolegend304022用于流式细胞术
PerCP 抗人 CD4 抗体Biolegend300528用于流式细胞术
QIAamp 病毒 RNA 提取试剂盒Qiagen 52904用于测定病毒载量
Raltegravir默克（Merck）由默克公司赠送
无菌细胞刮刀Thermo Scientific179693用于分装 ART 食物
TaqMan RNA-to-Ct 一步法试剂盒Applied Biosystems4392653用于血浆病毒载量检测
富马酸替诺福韦酯（Tenofovir disoproxil fumarate）Gilead由 Gilead 赠送
甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（Trimethoprim-Sulfamethoxazole）Pharmaceutical AssociatesNDC 0121-0854-16用于保持 ART 食物无菌。每 5 mL 茶匙含
200 mg 磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole, USP）
40 mg 甲氧苄啶（Trimethoprim, USP）
非甲醇类酒精含量不超过 0.5%

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