本方案描述了一种新型的口服联合抗逆转录病毒药物递送方法，该方法在人源化小鼠中成功抑制了HIV-1 RNA的复制。
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摘要
摘要
人类免疫缺陷病毒（HIV-1）大流行仍在全球范围内持续蔓延，目前尚无针对 HIV 的有效疫苗。尽管联合抗逆转录病毒疗法（cART）在抑制病毒复制方面已取得成功，但仍无法彻底清除 HIV 感染者体内的病毒储存库。实现对 HIV 感染安全且有效的治愈策略需要采用多种手段，因此建立适用于 HIV-1 感染的动物模型对于推动 HIV 治愈研究至关重要。人源化小鼠能够重现 HIV-1 感染的关键特征。该人源化小鼠模型可被 HIV-1 感染，并可通过 cART 方案控制病毒复制。此外，在停止 cART 治疗后，人源化小鼠会出现迅速的病毒反弹。然而，向动物施用 cART 可能效果不佳、操作困难或具有毒性，许多临床上重要的 cART 方案难以得到最佳应用。此外，研究人员常用每日多次注射的方式给药，这种高强度注射过程不仅可能对研究人员造成安全风险，还会因对动物进行物理束缚而引发应激反应。本文所述的新型口服 cART 方法用于治疗 HIV-1 感染的人源化小鼠，可将病毒血症抑制至检测水平以下，提高 CD4+ 细胞恢复速率，并改善 HIV-1 感染人源化小鼠的整体健康状况。
引言
随着联合抗逆转录病毒治疗（cART）的应用，慢性人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者的预期寿命已显著改善1,2。在大多数慢性HIV-1感染者中，cART能有效抑制HIV-1的复制，并使CD4+ T细胞计数恢复至正常水平3，从而改善整体健康状况，并显著减缓疾病进展4。然而，即使在急性感染期即开始抗逆转录病毒治疗（ART），仍会形成潜伏的HIV-1储存库5,6,7。这些储存库可在ART期间持续存在多年，且在ART中断后病毒迅速反弹的现象已有充分记录8,9。接受ART治疗的HIV感染者还面临更高的共病风险，如心血管疾病、癌症和神经功能障碍10,11,12。因此，实现HIV的功能性治愈至关重要。HIV-1感染的动物模型在开发和验证新型HIV治愈策略....
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方案
匿名的人类胎儿组织通过商业途径获得。动物实验根据加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物研究委员会（ARC）批准的方案进行，符合所有联邦、州和地方的指导原则。具体而言，所有实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）和国际实验动物护理评估与认证协会（AALAC）关于实验动物饲养和护理的建议与指南，实验方案编号为UCLA ARC 2010-038-02B。所有手术均在氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（5 mg/kg）和异氟烷麻醉（2-3 vol%）下进行，并尽一切努力减轻动物的疼痛与不适。
1. 感染 HIV-1 的人源化小鼠
注意：人源化小鼠的构建方法如先前文献30,31,49所述。以下简要描述该方案。
- 从人胎肝中纯化CD34+造血祖细胞 通过 根据制造商方案使用抗CD34磁珠。
- 麻醉6至8周大的NOD/SCID/IL2Rγ−/−（NSG）雄性和雌性小鼠，并在手术前进行亚致死剂量照射（2.7 Gy）。
- 将来自与胎肝相同供体的胸腺植入肾包膜下，与肝脏一同移植。
- 植入后，通过静脉注射向小鼠注入50万至100万个CD....
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结果
假设一只平均体重为25 g的小鼠每天消耗4 g食物，则通过口服给药的每日药物剂量相当于2.88 mg/kg的替诺福韦（TFV）、83 mg/kg的恩曲他滨（FTC）以及768 mg/kg的拉替拉韦（RAL）。为了检测优化后的食物给药方案相较于每日注射cART是否具有毒性并影响整体健康状况，我们在cART治疗前及治疗期间每周监测小鼠体重，给药途径包括口服和皮下注射。各组在开始cART治疗前体重无显著差异（图1）。然而，在每日皮下注射cART期间，小鼠体重持续下降。相比之下，通过DietGel口服给予FTC/TDF/ELV或FTC/TDF/RAL的小鼠在5周后体重恢复至ART治疗前水平。此外，拉替拉韦组与艾维雷韦组之间未观察到显著的体重变化差异。
为了检测口服cART给药是否能像每日注射一样有效抑制病毒载量，采用RT-PCR方法每两周评估一次血浆病毒载量。图2显示，FTC/TDF/ELV ART食物给药方案可在4周内以100%的效率将病毒复制抑制至检测不到的水平；FT.......
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讨论
本研究通过将三种抗逆转录病毒药物与高营养食物混合，建立了一种用于HIV-1感染人源化小鼠的口服cART给药方法。与每日注射给药相比，口服给药使用更简便、给药频率更低、减少了对动物的操作、最大限度地降低了应激反应，并提高了安全性55。迄今为止，仅有少数针对人源化小鼠的研究24,37,41采用含有研碎抗逆转录病毒药物的饲料颗粒来治疗小鼠。然而，由于难以获得特制饲料颗粒的生产途径，该方法难以广泛推广。其他研究42,43,44,45,46则使用饮水作为cART的递送系统。但将药物配制于饮水中.......
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披露
SK 是 CDR3 公司的创始人。其余作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
我们感谢Gilead公司的Romas Geleziunas博士、Jeff Murry博士及其团队提供了本研究中使用的抗逆转录病毒药物。本研究由以下项目资助：NCI 1R01CA239261-01（Kitchen主持）、NIH资助项目P30AI28697（UCLA CFAR病毒学核心、基因与细胞治疗核心及人源化小鼠核心）、U19AI149504（PIs：Kitchen & Chen）、CIRM DISC2-10748、NIDA R01DA-52841（Zhen主持）、NIAID R2120200174（PIs：Xie & Zhen）以及IRACDA K12 GM106996（Carrillo主持）。本研究还得到了UCLA艾滋病研究所、James B. Pendleton慈善信托基金以及McCarthy家族基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 60 mm 培养皿 | Thermo Scientific Nunc | 150288 | 用于分装 ART 食物 |
| APC 抗人 CD8 抗体 | Biolegend | 344722 | 用于流式细胞术 |
| BD LSRFortessa | BD biosciences | 用于流式数据采集 | |
| CD34 磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | 用于构建 NSG-BLT 小鼠模型 |
| 离心管 | Falcon | 14-432-22 | 用于溶解 ART |
| DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | 用于制备 ART 食物 |
| Elvitegravir | Gilead | 由 Gilead 赠送 | |
| Emtricitabine | Gilead | 由 Gilead 赠送 | |
| FITC 抗人 CD3 抗体 | Biolegend | 317306 | 用于流式细胞术 |
| FlowJo 软件 | FlowJo | 用于流式细胞术数据分析 | |
| HIV-1 正向引物：5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′； | IDT | 定制 | 用于病毒载量 RT-PCR 检测 |
| HIV-1 探针：5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT TAACTG [Tamra-Q]-3′； | IDT | 定制 | 用于病毒载量 RT-PCR 检测 |
| HIV-1 反向引物：5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′； | IDT | 定制 | 用于病毒载量 RT-PCR 检测 |
| 人胎儿组织 | Advanced Bioscience Resources, Inc | ||
| 小鼠品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | 杰克逊实验室（The Jackson Laboratory） | 5557 | 用于构建人源化小鼠模型 |
| 太平洋蓝（Pacific Blue）抗人 CD45 抗体 | Biolegend | 304022 | 用于流式细胞术 |
| PerCP 抗人 CD4 抗体 | Biolegend | 300528 | 用于流式细胞术 |
| QIAamp 病毒 RNA 提取试剂盒 | Qiagen | 52904 | 用于测定病毒载量 |
| Raltegravir | 默克（Merck） | 由默克公司赠送 | |
| 无菌细胞刮刀 | Thermo Scientific | 179693 | 用于分装 ART 食物 |
| TaqMan RNA-to-Ct 一步法试剂盒 | Applied Biosystems | 4392653 | 用于血浆病毒载量检测 |
| 富马酸替诺福韦酯（Tenofovir disoproxil fumarate） | Gilead | 由 Gilead 赠送 | |
| 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（Trimethoprim-Sulfamethoxazole） | Pharmaceutical Associates | NDC 0121-0854-16 | 用于保持 ART 食物无菌。每 5 mL 茶匙含 200 mg 磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole, USP） 40 mg 甲氧苄啶（Trimethoprim, USP） 非甲醇类酒精含量不超过 0.5% |
参考文献
- Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
- May, M. T., et al.
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