本文介绍了一种建立抗生素诱导的伪无菌右旋糖酐硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型的实验方案，用于研究肠道微生物群在调控Bacillus cereus对结肠炎积极作用中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
肠道菌群失调被认为在结肠炎的进展中发挥作用。然而，益生菌在缓解结肠炎中的具体应用标准仍不明确。大多数分析方法依赖于肠道微生物有限的多样性和丰度，因此观察性研究无法确立因果关系。本研究采用抗生素诱导的拟无菌小鼠模型，探究肠道菌群在调控Bacillus cereus（B. cereus） 对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的益生作用中的角色。该方法可评估补充B. cereus 对健康的双向调节效应，并提供稳定且可重复的结果。本文提供了B. cereus培养、灌胃操作、粪便采集以及结肠炎小鼠抗生素清除处理的详细实验方案。这些优化方法也可适用于其他慢性炎症相关疾病的研究。结果显示，给予B. cereus可减轻体重下降、结肠缩短、疾病活动指数及组织病理学评分。然而，抗生素治疗会抑制B. cereus对结肠炎的积极作用。这些结果表明，肠道菌群是B. cereus发挥缓解结肠炎效应所必需的。因此，在本研究中探索益生菌的有益作用，为开发缓解慢性炎症相关疾病症状的新型治疗策略提供了有前景的方向。
引言
炎症性肠病（IBD）是一类常见的慢性胃肠道炎症性疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎（UC）1。目前治疗炎症性结肠炎的药物主要包括5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、硫唑嘌呤和抗生素2。此外，这些药物具有明显的副作用3。因此，我们应更加关注益生菌在结肠炎治疗中的作用。
替代性治疗策略包括益生菌给药，该方法已在动物模型和临床试验中应用。既往研究表明，不同种类的益生菌给药，例如Bacillus cereus或Bifidobacterium infantis，可缓解结肠炎4,5。在临床前研究中，益生菌的有效性和安全性必须在动物模型中进行评估。
葡聚糖硫酸钠（DSS）结肠炎小鼠模型有助于探索结肠炎的发病机制并评估益生菌的积极作用。DSS诱导会导致肠道黏膜糜烂、肠道屏障功能障碍以及肠上皮通透性增加6。目前大多数用于研究益生菌的小鼠模型主要侧重于生物学效应。然而，由于难以进一步验证益生菌与结肠炎缓解之间的因果关系，益生菌发挥作用的具体机制仍难以探究。因此，有必要建立一种标准化的方法来研究益生菌的作用....
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方案
所有操作均按照中国安徽大学实验动物护理和使用指南进行，并经中国安徽大学动物伦理委员会批准（编号：IACUC(AHU)-2020-014）。
1. 抗生素的给药
- 通过将氨苄青霉素（1 g/L）、硫酸新霉素（1 g/L）、甲硝唑（0.5 g/L）和万古霉素（0.5 g/L）溶解于1 L饮用水中，配制抗生素混合液5。
- 完全溶解后，将溶液储存于4 °C条件下。
- 将抗生素混合液装入饮水瓶中，并将瓶子置于小鼠笼具上方。
注意：请使用棕色瓶或将瓶子用铝箔包裹，以避免抗生素溶液暴露于光照下。 - 每周更换两次新鲜的抗生素混合液。
- 让小鼠自由饮用抗生素混合液，持续4周。
2. DSS 饮用水的配制及结肠炎的诱导
- 配制2.5%的葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液：将2.5 g DSS溶解于100 mL蒸馏水中11。
- 用2.5% DSS溶液替换结肠炎模型小鼠组的饮用水。确保结肠炎组小鼠 无法接触其他饮用水。同时，对照组小鼠仅给予不含DSS的蒸馏水。
- 将雄性C57BL/6J小鼠（平均体重20 ....
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结果
B. cereus 补充与结肠炎
通过在饮水中添加 DSS 建立急性实验性结肠炎模型。图 1A 展示了向结肠炎小鼠模型施用 B. cereus 的实验方案。DSS 诱导显著降低了小鼠的体重（图 1B）和结肠长度。通过口服灌胃给予 B. cereus 对结肠炎模型小鼠的缓解作用被进一步研究。与 DSS 诱导的结肠炎小鼠相比，B. cereus 处理组小鼠的体重下降和结肠缩短现象均得到抑制（图 1C）。
DAI 评分被广泛用于评估结肠炎的进展。DSS 干预显著增加了结肠炎模型小鼠的 DAI 评分。然而，B. cereus 组的 DAI 评分较低（图 1D）。这些数据表明，补充 B. cereus 可改善.......
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讨论
为了在临床研究中使用益生菌，有必要在动物模型中评估益生菌的有效性和安全性。所提供的实验方案此前已针对结肠炎严重程度的评估进行了优化。使用DSS处理的小鼠是一种肠道炎症模型，可模拟溃疡性结肠炎的临床和组织学特征12。急性结肠炎模型小鼠表现为体重下降、腹泻、粪便出血以及炎性细胞浸润13。疾病活动指数（DAI）评分系统被用于对结肠炎模型的表现进行定性评估。DAI评分根据体重下降评分、粪便性状评分和粪便隐血评分计算得出14。DSS诱导导致小鼠体重减轻、结肠长度缩短，并使DAI评分升高。然而，在经B. cereus处理的结肠炎小鼠中，体重减轻、结肠缩短以及DAI评分均显著降低。通过这些实验方法观察到，给予B. cereus可缓解DSS诱导的结肠炎症状。
本研究还根据结肠长度的变化评估了小鼠结肠炎的严重程度。实验结束时，处死小鼠并切除结肠，测量从肛门至盲肠的结肠长度。收集结肠组织并用10%缓冲福尔马林固定，随后采用组.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了国家自然科学基金（K.S.，项目编号 32000081）、安徽省自然科学基金（K.S.，项目编号 1908085QC120）、江南大学食品科学与技术国家重点实验室开放课题项目（K.S.，项目编号 SKLF-KF-201920）、中国安徽省高等学校自然科学基金（K.S.，项目编号 KJ2019A0040）、安徽大学博士科研启动基金（K.S.，项目编号 J01003316）、国家自然科学基金（Y.W.，项目编号 31770066、31470218）、安徽大学物理与信息科技学院学科建设开放基金（Y.W.）以及中国安徽大学优秀人才计划（Y.W.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.01 M PBS（粉末，pH 7.2–7.4） | Solarbio | P1010-2L | |
| 无水乙醇 | Hushi | 64-17-5 | |
| 酸性乙醇快速分化液 | Beyotime | No.C0163S | |
| 琼脂 | Sangon Biotech | 9002-18-0 | |
| 氨苄青霉素 | Solarbio | 69-53-4 | 储存于 2–8 °C |
| 厌氧培养箱 | Long Yue | LA1-3T | |
| 葡聚糖硫酸钠盐（结肠炎级） | MP Biomedicals | 160110 | |
| 电热恒温培养箱 | SANFA | HP-050A | |
| 通用组织固定液 | biosharp | BL539A | |
| 甘油 | Hushi | 56-81-5 | |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | Beyotime | No.C0105 | |
| Kisser 封片剂 | Beyotime | No.C0181 | |
| 甲硝唑 | Solarbio | 443-48-1 | 储存于 2–8 °C |
| 硫酸新霉素 | Solarbio | 1405-10-3 | 储存于 2–8 °C |
| 振荡培养箱 | 上海智楚 | ZQLY-180S | |
| 氯化钠 | Sangon Biotech | 7647-14-5 | |
| 粪便隐血检测试纸 | Baso | BA2020B | |
| 胰蛋白胨 | OXOID | 2285856 | |
| 万古霉素 | Solarbio | 1404-93-9 | 储存于 2–8 °C |
| 二甲苯 | Hushi | 1330-20-7 | |
| 酵母提取物 | Sangon Biotech | 8013-01-2 |
参考文献
- Pittayanon, R., et al. Differences in gut microbiota in patients with vs without inflammatory bowel diseases: A systematic review. Gastroenterology. 158 (4), 960-946 (2020).
- Kuehn, F., Hodin, R. A. Impact of modern drug therapy o....
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