方法文章

探究缓解效应 Bacillus cereus 通过肠道微生物群调节治疗结肠炎

DOI：

10.3791/63707

⸱

2022年7月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Anhui University, 2Key Laboratory of Human Microenvironment and Precision Medicine of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, 4Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种建立抗生素诱导的伪无菌右旋糖酐硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型的实验方案，用于研究肠道微生物群在调控Bacillus cereus对结肠炎积极作用中的作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肠道菌群失调被认为在结肠炎的进展中发挥作用。然而，益生菌在缓解结肠炎中的具体应用标准仍不明确。大多数分析方法依赖于肠道微生物有限的多样性和丰度，因此观察性研究无法确立因果关系。本研究采用抗生素诱导的拟无菌小鼠模型，探究肠道菌群在调控Bacillus cereus（B. cereus） 对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的益生作用中的角色。该方法可评估补充B. cereus 对健康的双向调节效应，并提供稳定且可重复的结果。本文提供了B. cereus培养、灌胃操作、粪便采集以及结肠炎小鼠抗生素清除处理的详细实验方案。这些优化方法也可适用于其他慢性炎症相关疾病的研究。结果显示，给予B. cereus可减轻体重下降、结肠缩短、疾病活动指数及组织病理学评分。然而，抗生素治疗会抑制B. cereus对结肠炎的积极作用。这些结果表明，肠道菌群是B. cereus发挥缓解结肠炎效应所必需的。因此，在本研究中探索益生菌的有益作用，为开发缓解慢性炎症相关疾病症状的新型治疗策略提供了有前景的方向。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

炎症性肠病（IBD）是一类常见的慢性胃肠道炎症性疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎（UC）1。目前治疗炎症性结肠炎的药物主要包括5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、硫唑嘌呤和抗生素2。此外，这些药物具有明显的副作用3。因此，我们应更加关注益生菌在结肠炎治疗中的作用。

替代性治疗策略包括益生菌给药，该方法已在动物模型和临床试验中应用。既往研究表明，不同种类的益生菌给药，例如Bacillus cereus或Bifidobacterium infantis，可缓解结肠炎4,5。在临床前研究中，益生菌的有效性和安全性必须在动物模型中进行评估。

葡聚糖硫酸钠（DSS）结肠炎小鼠模型有助于探索结肠炎的发病机制并评估益生菌的积极作用。DSS诱导会导致肠道黏膜糜烂、肠道屏障功能障碍以及肠上皮通透性增加6。目前大多数用于研究益生菌的小鼠模型主要侧重于生物学效应。然而，由于难以进一步验证益生菌与结肠炎缓解之间的因果关系，益生菌发挥作用的具体机制仍难以探究。因此，有必要建立一种标准化的方法来研究益生菌的作用机制。

传统上，这些研究需要将特定的益生菌接种到无菌小鼠体内7。然而，使用无菌小鼠作为益生菌受体存在一些实验局限性，例如免疫能力低下以及无菌设施成本高昂8。为了克服这些局限性，研究人员建立了利用假无菌小鼠的DSS诱导结肠炎模型。假无菌小鼠模型是通过使用抗生素建立的，方法如先前所述9,10。

本文中，我们使用抗生素混合物建立伪无菌小鼠模型。同时详细描述了建立和评估小鼠结肠炎模型的方法，并研究了益生菌对缓解结肠炎症状的作用。以下方案还提供了通过灌胃给予益生菌的方法。

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方案

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所有操作均按照中国安徽大学实验动物护理和使用指南进行，并经中国安徽大学动物伦理委员会批准（编号：IACUC(AHU)-2020-014）。

1. 抗生素的给药

  1. 通过将氨苄青霉素（1 g/L）、硫酸新霉素（1 g/L）、甲硝唑（0.5 g/L）和万古霉素（0.5 g/L）溶解于1 L饮用水中，配制抗生素混合液5。
  2. 完全溶解后，将溶液储存于4 °C条件下。
  3. 将抗生素混合液装入饮水瓶中，并将瓶子置于小鼠笼具上方。
    注意：请使用棕色瓶或将瓶子用铝箔包裹，以避免抗生素溶液暴露于光照下。
  4. 每周更换两次新鲜的抗生素混合液。
  5. 让小鼠自由饮用抗生素混合液，持续4周。

2. DSS 饮用水的配制及结肠炎的诱导

  1. 配制2.5%的葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液：将2.5 g DSS溶解于100 mL蒸馏水中11。
  2. 用2.5% DSS溶液替换结肠炎模型小鼠组的饮用水。确保结肠炎组小鼠 无法接触其他饮用水。同时，对照组小鼠仅给予不含DSS的蒸馏水。
  3. 将雄性C57BL/6J小鼠（平均体重20 g ± 2 g，7周龄）饲养于无病原体环境中，自由摄取标准饲料和水。
    注意：每笼饲养五只小鼠，置于无病原体条件下。
  4. 实验设计
    注意：动物实验分为两个阶段进行，每组包含五只小鼠。
    1. 第一阶段：为评估B. cereus缓解结肠炎的积极作用，将小鼠随机分为以下三组：对照组（control）、DSS诱导结肠炎模型组（DSS）、DSS诱导小鼠补充益生菌B. cereus组（B. cereus）。
    2. 第二阶段：为探究肠道微生物群在调节B. cereus对DSS诱导结肠炎益生作用中的角色，将小鼠随机分为以下三组：ABX（对照）、ABX（DSS）和ABX（B. cereus + DSS）。
      1. ABX（对照）组小鼠给予生理盐水处理。
      2. 经抗生素混合溶液处理4周后，ABX（DSS）组小鼠饮用含2.5% DSS的水1周，随后给予正常生理盐水2周。
      3. 在抗生素混合溶液和DSS水处理后，ABX（B. cereus + DSS）组小鼠每日通过灌胃导管给予200 µL生理盐水中含B. cereus（2 × 108 个细胞）的溶液，持续2周。
  5. 给予抗生素混合溶液后，立即开始以含2.5% DSS的饮水对雄性C57BL/6小鼠进行处理，持续7天。
  6. 在DSS干预前记录小鼠体重，作为基线体重。

3. 定量分析  B. cereus

  1. 准备八个装有 900 µL 无菌生理盐水的 1.5 mL 微量离心管。
  2. 用移液器吸取 100 µL 对数生长期的 B. cereus，溶解于 900 µL 无菌生理盐水中。
  3. 利用上述试管对 B. cereus 进行连续稀释。
  4. 将每种稀释液各取 40 µL 接种至相应标记稀释比例的 LB 琼脂平板上。每种稀释比例重复 3 次。
  5. 将平板置于 37 °C 恒温培养箱中培养 16 小时。
  6. 选择菌落数约为 20–70 的平板进行计数。根据所选平板的稀释倍数计算平均细菌浓度。

4. 准备 B. cereus 用于灌胃

  1. 定量分析 B. cereus 后，取含有 1 × 109 CFU 的 B. cereus 培养液 1 mL，在 8,000 × g 条件下离心 10 分钟。随后用无菌水将菌体洗涤两次，每次在 8,000 × g 条件下离心 10 分钟，并弃去上清液。
  2. 用无菌生理盐水将浓缩的 B. cereus 稀释至终浓度为 2 × 108 CFU/200 µL4。
  3. 反复吹打混匀，获得分散的 B. cereus 悬液。
  4. 在完成灌胃操作前，采用平板计数法对 B. cereus 浓度进行定量分析。

5. 通过灌胃法施用 B. cereus 补充剂

  1. 在固定时间通过口服灌胃的方式，将干预物质（2 x 108 CFU 益生菌溶于 200 µL 生理盐水中）给予小鼠。
  2. 为给予 B. cereus，将灌胃针（饲喂针规格：20 G，38 mm）连接至 1 mL 注射器上。每只小鼠之间用 70% 乙醇擦拭灌胃针外部，并确保剂量准确。
  3. 固定小鼠时，抓住其尾部，用操作者最后两根手指夹住尾根，同时牢固抓住背部松弛的皮肤。
  4. 保持小鼠处于垂直位置，然后小心轻柔地将灌胃针经口插入食道。若此过程中无明显阻力，可继续轻柔推进针头至胃部。
    注意：给药前应确认小鼠呼吸规律且通畅。
  5. 缓慢推进灌胃针并注入 B. cereus 溶液。灌胃完成后，轻柔拔出针头，释放小鼠并将其放回笼中。

6. 疾病活动指数的测定

注意：疾病活动指数（DAI）通过小鼠每日的体重减轻、粪便隐血和粪便性状进行计算。

  1. 每天测量小鼠的体重。根据体重下降百分比为每只小鼠分配0-4分的评分（0：0%，1：1%-5%，2：6%-10%，3：11%-18%，4：>18%）。
  2. 采集每只小鼠的新鲜粪便样本。使用棉签刺激肛门收缩以促进排便。随后立即在无菌离心管中收集排便后的粪便样本。
  3. 使用粪便隐血检测试纸检测粪便隐血。用涂药棒取10 mg粪便样本。
  4. 将样本置于检测卡上，并在卡上涂抹成薄层。打开背面翻盖，将显影剂滴加到涂片上。
  5. 然后，在120秒内使用粪便隐血检测试纸对隐血进行评分。
    注意：涂片上或边缘处出现任何蓝色痕迹均判定为隐血阳性。粪便隐血评分标准如下：0：无，1：Hemoccult阳性，2：轻微，3：粪便中可见血迹，4：明显出血。
  6. 通过检测粪便样本11判断粪便性状。评分范围为0-4分（0：正常，1：稀便，2：半成形便，3：液态便，4：腹泻）。

7. 组织采集

  1. 在实验第一阶段和第二阶段结束时，通过腹腔注射10%水合氯醛（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过夹趾缩足反射评估小鼠的麻醉深度。
  2. 随后采用颈椎脱臼法处死小鼠。
  3. 将小鼠仰卧位固定于手术台上，切开腹腔。
  4. 手术分离整个结肠，并用直尺测量其长度。
  5. 然后用装有预冷PBS的5 mL注射器轻轻冲洗结肠。

8. 组织学损伤的评估

  1. 将结肠组织切成小块，用4%多聚甲醛固定，并使用组织包埋机将其包埋于石蜡中。
  2. 然后用切片机对石蜡包埋的组织进行切片，制备厚度为4 µm的结肠组织切片。对结肠切片进行脱蜡和水化处理，随后用苏木精-伊红（H&E）染色。
    注意：染色后的结肠样本由研究人员采用以下评分系统进行评估：炎症细胞浸润程度（无：0，轻度：1，中度：2，重度：3）、黏膜损伤（无：0，黏液层：1，黏膜下层：2，肌层和浆膜层：3）、隐窝损伤（无：0，1/3：1，2/3：2，全部：3，全部+上皮细胞丢失：4）、病变范围（%）（0%：0，1%-25%：1，26%-50%：2，51%-75%：3，76%-100%：4）。每项指标单独评分后，计算总组织学损伤评分5。
  3. 由两名独立的实验人员在盲法条件下使用光学显微镜评估样本的组织学评分。

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结果

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B. cereus 补充与结肠炎
通过在饮水中添加 DSS 建立急性实验性结肠炎模型。图 1A 展示了向结肠炎小鼠模型施用 B. cereus 的实验方案。DSS 诱导显著降低了小鼠的体重（图 1B）和结肠长度。通过口服灌胃给予 B. cereus 对结肠炎模型小鼠的缓解作用被进一步研究。与 DSS 诱导的结肠炎小鼠相比，B. cereus 处理组小鼠的体重下降和结肠缩短现象均得到抑制（图 1C）。

DAI 评分被广泛用于评估结肠炎的进展。DSS 干预显著增加了结肠炎模型小鼠的 DAI 评分。然而，B. cereus 组的 DAI 评分较低（图 1D）。这些数据表明，补充 B. cereus 可改善...

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讨论

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为了在临床研究中使用益生菌，有必要在动物模型中评估益生菌的有效性和安全性。所提供的实验方案此前已针对结肠炎严重程度的评估进行了优化。使用DSS处理的小鼠是一种肠道炎症模型，可模拟溃疡性结肠炎的临床和组织学特征12。急性结肠炎模型小鼠表现为体重下降、腹泻、粪便出血以及炎性细胞浸润13。疾病活动指数（DAI）评分系统被用于对结肠炎模型的表现进行定性评估。DAI评分根据体重下降评分、粪便性状评分和粪便隐血评分计算得出14。DSS诱导导致小鼠体重减轻、结肠长度缩短，并使DAI评分升高。然而，在经B. cereus处理的结肠炎小鼠中，体重减轻、结肠缩短以及DAI评分均显著降低。通过这些实验方法观察到，给予B. cereus可缓解DSS诱导的结肠炎症状。

本研究还根据结肠长度的变化评估了小鼠结肠炎的严重程度。实验结束时，处死小鼠并切除结肠，测量从肛门至盲肠的结肠长度。收集结肠组织并用10%缓冲福尔马林固定，随后采用组...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究部分得到了国家自然科学基金（K.S.，项目编号 32000081）、安徽省自然科学基金（K.S.，项目编号 1908085QC120）、江南大学食品科学与技术国家重点实验室开放课题项目（K.S.，项目编号 SKLF-KF-201920）、中国安徽省高等学校自然科学基金（K.S.，项目编号 KJ2019A0040）、安徽大学博士科研启动基金（K.S.，项目编号 J01003316）、国家自然科学基金（Y.W.，项目编号 31770066、31470218）、安徽大学物理与信息科技学院学科建设开放基金（Y.W.）以及中国安徽大学优秀人才计划（Y.W.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M PBS（粉末，pH 7.2–7.4）SolarbioP1010-2L
无水乙醇Hushi64-17-5
酸性乙醇快速分化液BeyotimeNo.C0163S
琼脂Sangon Biotech9002-18-0
氨苄青霉素Solarbio69-53-4储存于 2–8 °C
厌氧培养箱Long YueLA1-3T
葡聚糖硫酸钠盐（结肠炎级）MP Biomedicals160110
电热恒温培养箱SANFAHP-050A
通用组织固定液biosharpBL539A
甘油Hushi56-81-5
苏木精-伊红染色试剂盒BeyotimeNo.C0105
Kisser 封片剂BeyotimeNo.C0181
甲硝唑Solarbio443-48-1储存于 2–8 °C
硫酸新霉素Solarbio1405-10-3储存于 2–8 °C
振荡培养箱上海智楚ZQLY-180S
氯化钠Sangon Biotech7647-14-5
粪便隐血检测试纸BasoBA2020B
胰蛋白胨OXOID2285856
万古霉素Solarbio1404-93-9储存于 2–8 °C
二甲苯Hushi1330-20-7
酵母提取物Sangon Biotech8013-01-2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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