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方法文章

原位 杂交联合免疫组织化学在冰冻切片斑马鱼胚胎中的应用

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DOI：

10.3791/63715

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2022年3月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Nantong University, 2Medical School, Nantong University, 3Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu Province and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, 4Nantong Maternal and Child Health Care Hospital, 5Laboratory Animals Center, Nantong University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了如何通过结合获取图像的方法 原位 斑马鱼胚胎切片的杂交与免疫组织化学 原位 杂交在冷冻切片前进行，随后进行抗体染色。当抗体资源有限时，该方法可用于检测斑马鱼中两个基因的表达模式。

摘要

作为一种脊椎动物，斑马鱼已被广泛应用于生物学研究。斑马鱼与人类具有高度的基因同源性，因此可作为人类疾病的研究模型。基因功能研究依赖于基因表达模式的检测。尽管免疫组织化学是一种检测蛋白质表达的有力方法，但斑马鱼中 commercially available 抗体数量有限，限制了共染色技术的应用。In situ 杂交技术在斑马鱼胚胎中被广泛用于检测 mRNA 的表达。本实验方案描述了如何通过结合 in situ 杂交与免疫组织化学方法，对斑马鱼胚胎切片进行成像。In situ 杂交在冷冻切片前完成，随后进行抗体染色。在 in situ 杂交之后，再对单个冷冻切片进行免疫组织化学染色及成像。该方案有助于在同一组织切片中解析两个基因的表达模式：首先通过 in situ 转录本检测，然后通过针对蛋白质的免疫组织化学染色。

引言

斑马鱼是研究发育和遗传学的有力脊椎动物模型1,2。斑马鱼与人类具有高度的基因同源性（70%的基因与人类基因组共享），因此可作为人类疾病的研究模型3。在斑马鱼中，检测两个基因的表达模式及其空间关系十分常见。免疫组织化学技术最早于1941年被用于通过FITC标记的抗体检测感染组织中的病原体4。该方法首先用一抗标记组织切片中的靶蛋白，再用针对一抗宿主物种免疫球蛋白的二抗标记切片。抗体染色是一种检测蛋白质定位的可靠方法，可在细胞内水平提供高光学分辨率。然而，适用于斑马鱼的抗体种类非常有限。最近一项研究表明，目前 commercially available 的小鼠抗体约有112,000种，但在斑马鱼中被证实可靠的抗体却极少5。

相反，在斑马鱼中， 原位 杂交技术已广泛应用于基因表达模式分析。该方法最初被用于评估基因表达 果蝇 20世纪80年代的胚胎6,7，自那时起，该技术不断得到发展与改进。最初采用放射性标记的DNA探针来检测mRNA转录本，但其空间分辨率相对较低，且存在放射性带来的潜在健康风险。随后， 原位 杂交依赖于用地高辛（DIG）或荧光素（Fluo）标记的RNA探针，这些探针可与碱性磷酸酶（AP）偶联，或通过荧光酪酰胺信号放大（TSA）进行检测8,9尽管TSA已用于检测两个或三个基因，但RNA探针的DIG标记及抗DIG碱性磷酸酶偶联抗体仍为高灵敏度、稳定且广泛应用的方法 原位 杂交。因此，商业化抗体与DIG标记的 原位 探针有助于研究蛋白质的定位以及单个基因的表达。

整体胚胎标本由于光学分辨率较低，无法揭示基因之间的空间关系，尽管斑马鱼胚胎体积小且透明10因此，为了在细胞内水平分析基因的表达模式，切片是必要的。冷冻切片技术在斑马鱼研究中被广泛应用，因其操作简便且能有效保存抗原。因此， 原位 杂交结合斑马鱼冷冻切片的免疫组织化学技术为分析两个基因的表达模式提供了一种强有力的方法。该组合方法 原位 杂交与免疫组织化学已应用于斑马鱼11然而，蛋白酶K处理虽可增强探针的渗透性，却会损害抗原的完整性。为克服这一局限性，本方案采用加热法进行抗原修复。该方案不仅适用于不同发育阶段的胚胎以及不同厚度的组织切片（如14 µm的头部切片和20 µm的脊髓切片），还通过检测在两个器官（包括头部和脊髓）中表达的基因验证了其有效性。

本文将介绍如何结合 原位 斑马鱼胚胎冷冻切片中的杂交与抗体染色。本实验方案的通用性通过使用多种 原位 杂交-免疫组织化学组合，包括 原位 用于两种不同神经元的杂交探针。该方法适用于检测不同区域、不同年龄胚胎中的mRNA和蛋白质，以及两种基因的表达模式。

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方案

所有动物实验方案均经南通大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准（编号：S20191210-402）。

1. 斑马鱼胚胎的收集

  1. 在收集卵子的前一晚，将一对斑马鱼放入繁殖缸中，其中一条为转基因斑马鱼，另一条为AB野生型斑马鱼（Tg (foxP2:egfp-caax) × AB野生型 或 Tg (hb9:egfp) × AB野生型）（参见材料表）。使用斜向塑料隔板将雄鱼和雌鱼分隔开，防止其发生身体接触。次日，将繁殖缸上部放入装有新鲜水的洁净下部容器中，并移除繁殖缸内的隔板。让斑马鱼交配10–20分钟，待卵子沉入繁殖缸底部后收集卵子。
  2. 将胚胎置于含亚甲蓝的E3胚胎培养基中培养（每1 L E3胚胎培养基中加入1 mL 0.05%亚甲蓝）（参见材料表），培养温度为28.5 °C。
  3. 在受精后24小时（hpf）用苯硫脲（PTU，参见材料表）处理胚胎，以抑制色素形成。
    ​注意：实验中使用任意性别的动物。

2. 原位 杂交

注意：步骤 2.1-2.11 中使用的水为焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（参见材料表）。

  1. 在1.5 mL微量离心管中，用0.5–1 mL新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA，参见材料表）于4 °C固定约10个胚胎，过夜12–14小时。
    注意：原位杂交实验步骤在先前发表的文献基础上略有修改12。PFA必须新鲜配制，并在4 °C保存不超过一周，或在-20 °C保存一个月。后续所有原位杂交步骤均使用1.5 mL微量离心管进行。
  2. 使用镊子仅去除48 hpf以上胚胎的皮肤。
    注意：去除皮肤有助于RNA探针更好地渗透至48 hpf以上胚胎的躯干部位。 
  3. 在室温下，依次用含0.1% Tween-20的1×磷酸盐缓冲液（PBST，参见材料表）配制的25%、50%和75%甲醇各洗涤5分钟，逐步对胚胎进行脱水。然后在室温下用100%甲醇洗涤5分钟。将胚胎在100%甲醇中于-20 °C孵育至少过夜12–14小时。
    注意：脱水后的胚胎可在-20 °C的100%甲醇中保存长达6个月。
  4. 在室温下，依次用PBST配制的75%、50%和25%甲醇各洗涤5分钟，逐步对胚胎进行复水。再用PBST在室温下洗涤胚胎三次，每次5分钟。
  5. 在室温下，用含10 µg/mL蛋白酶K（参见材料表）的PBST消化胚胎（参见表1）。
  6. 用PBST洗涤胚胎5分钟，重复该洗涤步骤三次。
  7. 在室温下，用4% PFA重新固定洗涤后的胚胎15分钟。
    注意：此步骤可终止消化反应，因为PFA会使蛋白酶K失活。确保样品轻柔混匀，使所有胚胎均接触PFA；可将离心管平放以使胚胎在溶液中均匀分布。此PFA无需新鲜配制（可在4 °C冷藏保存最多两周）。
  8. 用PBST洗涤胚胎三次，每次孵育5分钟。
  9. 将胚胎在预杂交液（preHYB，参见材料表）中于65 °C孵育5分钟，进行预杂交。随后将preHYB更换为杂交液（HYB，参见材料表），并在HYB中继续预杂交至少4小时。
    注意：进行预杂交前，需先将溶液预热至65 °C。甲酰胺（参见材料表）用于维持组织的形态和结构，同时防止非同源片段在低温下发生非特异性结合。
  10. 在将探针（Insm1a或5-HT2C）加入胚胎前，先将其在HYB中95 °C加热5分钟。使用终浓度为1 µg/mL HYB的探针。尽可能吸除preHYB，避免胚胎暴露于空气中，然后将预热的含探针HYB溶液加入含有胚胎的离心管中。
    注意：标记的RNA探针可用于与胚胎中的靶mRNA序列杂交，从而检测目的基因的表达情况及mRNA的定位。
  11. 在50–70 °C下让探针杂交过夜（12–14小时）。
    注意：不同探针的杂交温度可能不同。
  12. 次日，用移液器吸出探针溶液，并将其储存于-20 °C的离心管中，以便多次重复使用。
  13. 按以下步骤洗涤胚胎：
    1. 在65 °C下用100% HYB洗涤胚胎15分钟。
    2. 在65 °C下，依次用含0.1% Tween-20的2×柠檬酸钠缓冲液（SSCT，参见材料表）配制的75%、50%和25% HYB各洗涤15分钟。
    3. 在65 °C下用2× SSCT洗涤胚胎15分钟。
    4. 在65 °C下用0.2× SSCT洗涤胚胎15分钟。
  14. 在室温下，用含0.02% Tween-20的马来酸缓冲液（MABT，参见材料表）洗涤胚胎两次，每次10分钟。
  15. 用2%封闭液-1（参见材料表）在室温下封闭已杂交并洗涤的胚胎，至少2小时。
  16. 将封闭液-1更换为抗地高辛碱性磷酸酶抗体（1:4,000稀释，参见材料表），溶于新鲜的2%封闭液-1中，于4 °C振荡孵育过夜12–14小时。
  17. 在室温下用MABT洗涤胚胎四次，每次30分钟。
    注意：在第三次洗涤时从冰箱中取出BM紫色显色底物（参见材料表），并在后续洗涤过程中偶尔轻轻摇动。
  18. 在室温下用NTMT缓冲液（0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，1% Tween-20，参见材料表）洗涤胚胎两次，每次10分钟。
  19. 用移液器尽可能吸除胚胎中的NTMT。更换为BM紫色碱性磷酸酶底物，于室温避光条件下染色。每30分钟观察一次颜色变化，以控制染色程度。
    注意：具体染色时间因探针而异，需根据实际情况调整。在37 °C孵育可加速反应；在4 °C孵育可延长反应时间，可过夜进行。
  20. 当染色达到理想程度后，用NTMT短暂冲洗两次以终止反应。完成原位杂交后，用PBST冲洗胚胎三次，每次20分钟。

3. 包埋

  1. 将胚胎浸入含5%蔗糖的1x PBS溶液中（参见材料表），在4 °C下孵育12-14小时。
  2. 更换覆盖胚胎的溶液为含15%蔗糖的1x PBS溶液，在4 °C下继续孵育12-16小时。
  3. 再次更换覆盖胚胎的溶液为含30%蔗糖的1x PBS溶液，在4 °C下孵育1-2天。
    注：在此溶液中孵育直至胚胎沉入管底。
  4. 用最佳切割温度（OCT）包埋介质（参见材料表）填充一个冷冻模具。将处于30%蔗糖溶液中的胚胎转移至含有OCT介质的冷冻模具中，轻轻搅拌以去除胚胎周围的蔗糖。
  5. 将胚胎转移至一个新的用于组织包埋的冷冻模具中，轻柔地加入OCT介质，避免产生气泡。
  6. 将每个胚胎完全浸没，并将其轻压至冷冻模具底部，按所需方向（背腹向或侧向）摆放整齐，保持胚胎呈直线排列。
    注：强烈建议每个冷冻模具中仅放置一个胚胎（参见材料表）。
  7. 将包埋有胚胎的冷冻模具置于干冰乙醇浴中速冻。
  8. 随后于-80 °C条件下保存至少12-14小时。
    ​注：冷冻模具可在-80 °C下保存至少一个月。

4. 冷冻切片

  1. 使用冷冻切片机将冷冻切片温度设置为 -20 °C。
  2. 从冷冻模具中取出标本块并放入冷冻切片机中。在预冷的持片头底部加入OCT包埋剂，然后将标本块置于其上。
  3. 确保标本块与刀片平行。小心修去标本周围多余的OCT包埋剂。
  4. 使用冷冻切片机切出厚度为12–20 µm的切片。迅速将切片转移至载玻片上，每张载玻片放置3–4个切片。让样品升至室温，随后将切片置于密封的载玻片盒中，在-80 °C下保存以备后续使用。

5. 免疫染色

注意：对切片进行 GFP 染色。

  1. 用 PBS 清洗载玻片上的切片，持续 5 分钟。
  2. 将柠檬酸盐缓冲液在微波炉中加热至沸腾。
  3. 将载玻片放入缓冲液中，继续加热使溶液保持接近沸腾状态约 20 分钟。
    注意：此步骤有助于抗原修复。即使在高温下，组织仍保持完整，这可通过防止组织折叠、损伤或脱落来提高染色质量。
  4. 在进行下一步之前，让样品缓慢冷却至室温。倾去多余的溶液，用一小片纸巾小心擦干每个切片周围的区域，并使用防水笔（见材料表）在切片周围画一圈，形成疏水屏障。注意不要使组织切片干燥。
  5. 用 PBS 清洗载玻片两次，每次孵育 10 分钟。
  6. 在封闭液-2（见材料表）中于室温下封闭 2 小时。
  7. 每张载玻片上加入一抗溶液（小鼠单克隆 α-GFP 抗体，1:250，见材料表），并在 4 °C 湿盒中孵育过夜。
  8. 用 PBS 清洗载玻片三次，每次孵育 10 分钟。
  9. 倾去多余的 PBS，加入适当的二抗（1:400，见材料表），在室温下用 PBS 孵育 1 小时。
  10. 用 PBS 清洗载玻片三次，每次孵育 10 分钟。
  11. 倾去多余的 PBS，将封片剂滴加到载玻片上，盖上盖玻片进行封片。

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结果

本方案可用于同时检测一种mRNA和一种蛋白质的表达模式。图1展示了实验流程。5-HT2C受体是神经递质5-羟色胺（5-羟基色胺，5-HT）结合的5-HT受体的一个亚型。它在中枢神经系统（CNS）中广泛分布，能够显著调节多种脑功能，包括食欲、情绪、焦虑和生殖行为13。中枢神经系统中5-HT2C的表达通过转基因品系Tg (foxp2:egfp-caax)进行检测，该品系中foxP2神经元由绿色荧光蛋白（GFP）标记。GFP在野生型斑马鱼中不表达，仅在转基因品系中表达。通过同时检测RNA（5-HT2C，htr2c探针，图2A）和蛋白质（GFP，抗GFP抗体，图2B）的表达，可用于蛋白质与mRNA的共定位分析。

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讨论

本方案提出了一种组合方法 原位 杂交与免疫组织化学，是斑马鱼胚胎共定位实验中的重要步骤。该方法可简便高效地同时分析一种mRNA和一种蛋白质。 原位 杂交和抗体染色在斑马鱼胚胎上进行。与之前发表的若干方案相比14,15,16，采用免疫荧光和免疫组织化学方法检测蛋白表达。目前经过适当验证可用于切片的斑马鱼特异性抗体较少17先前的研究仅使用了一种技术：免疫荧光、免疫组织化学或 原位 杂交。结合 原位 结合杂交与免疫组织化学技术来分析RNA和蛋白质，可克服单一技术的局限性。第一步是 原位 杂交，可显著保护mRNA免于降解。通过加热进行抗原修复，以避免蛋白酶K处理对免疫组织化学染色中抗体结合的干扰。该方法是否适用于所有抗原，尚需进一步验证。切片图像显示，5-HT2C受体在细胞中共同表达 foxP2 神经元中，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由中华人民共和国南通市科学技术基金会（MS12019011）、中华人民共和国南通市科学技术基金会（JC2021058）以及江苏省高等教育机构自然科学基金（21KJB180009）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 二抗InvitrogenA21202
抗地高辛碱性磷酸酶 Fab 片段Roche11093274910
抗 GFP 抗体MilliporeMAB3580
封闭试剂Roche11096176001
封闭液-1实验室自制N/A将封闭试剂溶解于 1X MAB 中，终浓度为 10%（wt/vol）。高压灭菌后于 -20 °C 保存备用。
封闭液-2实验室自制N/A含 0.1% Triton X-100、3% BSA 和 10% 山羊血清的 1x PBS 溶液
BM purpleRoche11442074001
牛血清白蛋白（BSA）SigmaB2064
CaCl2SigmaC5670
柠檬酸盐缓冲液LeageneIH0305
柠檬酸SigmaC2404
组织冷冻模具，15 mm x 15 mm x 5 mmHead BiotechnologyH4566
DEPC 处理水Sangon BiotechB501005
数字相机，荧光显微镜NikonNI-SSR 931479
E3 胚胎培养基实验室自制N/A5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4
甲酰胺InvitrogenAM9342
山羊血清SigmaG9023
肝素钠盐J&K Scientific542858
HYB实验室自制N/ApreHYB 加 50 µg/mL 肝素钠盐和 100 µg/mL 核糖核酸二乙氨基乙醇盐
免疫组织化学湿盒MkbioMH10002
KClSigmaP5405
低剖面 Leica 刀片Leica819
MABT (1x)实验室自制N/A0.1 M 马来酸、0.15 M NaCl、0.02% Tween-20，pH 7.5
马来酸SigmaM0375
甲醇J&K Scientific116481
亚甲蓝MacklinM859248
MgSO4SigmaM2643
NaClSigmaS5886
NTMT实验室自制N/A0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、1% Tween-20
OCT 包埋剂Tissue-Tek4583
PAP 笔Enzo Life SciencesADI-950-233
4% 多聚甲醛Abbexaabx082483在 1x PBS 中实验室自制
PBST (1x)实验室自制N/A1x PBS 加 0.1% Tween-20
苯硫脲Merck103-85-5
磷酸盐缓冲液（10x）InvitrogenAM9624
preHYB实验室自制N/A50% 甲酰胺、5x SSC、9.2 mM 柠檬酸（pH 6.0）、0.1% Tween-20
蛋白酶 KRoche1092766
核糖核酸二乙氨基乙醇盐SigmaR3629
无 RNase 的 1.5 mL 离心管AmbionAM12400
SSC (20x)InvitrogenAM9770
SSCT (0.2x)实验室自制N/A0.2x SSC 加 0.1% Tween-20
SSCT (1x)实验室自制N/A1x SSC 加 0.1% Tween-20
蔗糖Invitrogen15503022
Triton X-100SigmaT9284
Tween-20SigmaP1379
斑马鱼南通大学实验动物中心N/A

参考文献

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