本文介绍了一种使用市售组织试剂盒从一个或少数几个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）个体中快速、简便地分离基因组DNA的方法。所获得的基因组DNA可用于PCR反应的模板。
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本文内容
摘要
摘要
从单个或少量样本中提取基因组DNA 秀丽隐杆线虫 具有多种下游应用，包括用于品系基因分型的 PCR、克隆和测序。传统的基于蛋白酶 K 的基因组 DNA 提取方法 秀丽隐杆线虫 需要数小时。可有效裂解的商业提取试剂盒 秀丽隐杆线虫 角质层并提取基因组DNA的方法有限。一种简便、快速（约15分钟）且成本效益高的提取方法 秀丽隐杆线虫 适用于课堂教学与科研应用的基因组DNA提取方法在此报道。该DNA提取方法经优化，可采用单个或少量晚期幼虫（L4）或成虫期线虫作为起始材料，以获得可靠的PCR模板。结果表明，所提取DNA的质量适用于通过PCR扩增不同大小的基因目标片段，即使将单个成虫基因组DNA稀释至五十分之一，仍可对单个或少量个体进行基因分型。所报道的实验方案可稳定、快速地从单个或少量样本中制备DNA模板 秀丽隐杆线虫 用于基于 PCR 的应用。
引言
此处提供了两种相关的细胞裂解方案 秀丽隐杆线虫 以使DNA适用于基于PCR的应用。PCR是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、克隆和测序所需的DNA片段扩增等多种实验目的。这种小型（1 mm）自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 是一种常用的生物研究动物体系。从单个或少数几个动物中获取合适的基因组DNA，即可通过PCR扩增目标序列。晚期L4幼虫和成虫仅含有约1,000个体细胞（包括一些多核、多倍体细胞）、生殖细胞，以及（若该个体为怀卵的雌雄同体）子代个体。 在子宫内1然而，这些动物由一层角质层保护，必须破坏该角质层才能提取基因组DNA2制备线虫基因组DNA模板用于PCR的标准方法包含多个步骤，耗时数小时。首先将线虫置于含有蛋白酶K的裂解缓冲液中冷冻（−70 °C或更低温度），冷冻时间至少15–45分钟（某些实验方案建议更长时间）。3,4,5,6此步骤可使动物体裂开。
冷冻后，将动物在60–65 °C孵育1小时，以使蛋白酶K发挥作用....
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方案
1. 秀丽隐杆线虫（C. elegans）的培养与维护
注意：N2（野生型）和 blmp-1(tm548) C. elegans 品系在 20 °C 条件下，于标准线虫生长培养基（NGM）平板上培养。
- 在2 L的烧瓶中，将23.005 g NGM粉末溶解于973 mL水中制备NGM平板。用铝箔（或可高压灭菌且允许排气的瓶盖）覆盖烧瓶口，并用高压灭菌胶带固定封口。进行高压灭菌，采用至少30分钟的灭菌程序，以彻底溶解粉末并灭菌溶液内容物。
- 将培养基在水浴中冷却至 60 °C。
- 向冷却的培养基中加入 25 mL 无菌的 1 M 磷酸盐（KH2PO4) 缓冲液，pH 6.0；1 mL 1 M 氯化钙溶液；和 1 mL 1 M 硫酸镁溶液。
- 在磁力搅拌器上搅拌培养基，以获得均匀的混合物，并防止冷却和凝固不均（约5分钟）。确保搅拌子的转速足够快以形成漩涡，但又不能过快以免引入气泡（约250–300 rpm）。
- 将约 25 mL 培养基倒入每个 10 cm 培养皿中（总共约 40 个）。在室温下干燥过夜（通常为 16–25 °C）。
- 培养一个菌落 大肠杆菌 在37 °C下，将OP50接种于30-50 mL LB肉汤中过夜培养。 ....
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结果
采用商用试剂盒或传统裂解法提取单个或少量野生型成虫的基因组DNA，以比较这两种方法的效率。随后以这些裂解产物为模板进行PCR扩增，目标片段分别为约2,100 bp的较大片段（编码blmp-1）或约500 bp的较小片段（编码sma-10的一部分）。两种方法均成功扩增出相应的PCR产物（图1A）。
接下来，验证了试剂盒提取的基因组DNA作为多种DNA聚合酶模板的能力。使用四种具有不同性能（包括扩增速度、保真度和产物长度）的聚合酶，以提取的基因组DNA为模板扩增一个0.5 kb的产物。无论是来自单个成虫裂解液还是九个成虫裂解液的模板，这些聚合酶均成功扩增出预期大小的产物（图1B）。通过测序可确认PCR聚合酶对模板序列的扩增准确性与保真度（补充图S1）。该结果表明，采用试剂盒方案提取的基因组DNA可作为多种聚合酶适用的模板。
使用商品化试剂盒从单.......
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讨论
在进行遗传杂交以创建新的 C. elegans 品系时，确定 C. elegans 的基因型是一项重要步骤。使用单个或少量 C. elegans 进行基因组 DNA 提取，是 C. elegans 基因分型中的关键步骤。本方案描述了利用商业试剂盒从 C. elegans 中提取基因组 DNA 的方法。该方法快速且结果稳定可靠。通过此方法提取的基因组 DNA 可用于后续实验，包括基因分型、测序和克隆。所述的 DNA 提取方法已针对使用单个或少量 L4 期或成虫期线虫作为起始材料进行 C. elegans 遗传杂交的基因分型进行了优化。相当于 1/50 个线虫（图 1C）至 3.5 个线虫（图 1D）所提供的 DNA 可作为通过 PCR 扩增目标 DNA 序列的合适模板。该方案（经稀释后）从单条线虫可获得足够进行最多 45 次反应（每反应 2 µL）的模板，从 16 条线虫则可获得足够进行 100 次反应的模板。即使.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
N2 菌株和 E. coli OP50 细菌来自由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）。blmp-1(tm548) 菌株来自日本国家生物资源计划。作者感谢 WormBase 提供资源。本研究得到了美国国立卫生研究院 R01GM097591 项目对 T.L.G. 的资助、德克萨斯女子大学对 T.L.G. 的内部资助，以及德克萨斯女子大学学生研究中心对 M.F.L. 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高压灭菌指示胶带 | Defend | 43237-2 | |
| 重型铝箔 | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| 氯化钙 | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp 试剂盒（包含组织制备液、提取液和中和液） | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp 加热磁力搅拌器 | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB 培养基，Lennox，胶囊装 | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| 硫酸镁，97% 纯度，无水 | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| 微量离心机 | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" 用于补充图 S1，一种高速、高保真聚合酶（20–30 s/kb） |
| NGM 培养基粉末 | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| 含 HF 缓冲液的 Phusion 高保真 PCR 预混液 | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" 在图 1B 中，一种高速、高保真聚合酶（15–30 s/kb） |
| 引物 | Integrated DNA Technologies | 定制 DNA 寡核苷酸 | |
| PrimeSTAR GXL 聚合酶 | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" 在图 1B 中，适用于 GC 含量高及长度达 30 kb 模板的高保真聚合酶（1 min/kb） |
| Quick-Load Purple 2-log DNA 标准品（0.1–10.0 kb） | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR 预混液 | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" 在图 1B 中，用于图 1A、C、D 的高速聚合酶（10 s/kb），适用于长度达 5 kb 的扩增片段 |
| Sigma ReadyMix Taq PCR 反应预混液 | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" 在图 1B 中，适用于长度达 7 kb 扩增片段的聚合酶（1 min/kb） |
| SimpliAmp 梯度 PCR 仪 | Applied Biosystems | A24812 | |
| 搅拌子 | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| 涡旋混合器 | Fisher Scientific | 2215365 | |
| 线虫挑取针 | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
参考文献
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
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重印与许可
