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方法文章

小规模提取 Caenorhabditis elegans 基因组 DNA

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DOI：

10.3791/63716

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2022年6月7日

 ,  , 
1Department of Biology, Texas Woman’s University

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用市售组织试剂盒从一个或少数几个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）个体中快速、简便地分离基因组DNA的方法。所获得的基因组DNA可用于PCR反应的模板。

摘要

从单个或少量样本中提取基因组DNA 秀丽隐杆线虫 具有多种下游应用，包括用于品系基因分型的 PCR、克隆和测序。传统的基于蛋白酶 K 的基因组 DNA 提取方法 秀丽隐杆线虫 需要数小时。可有效裂解的商业提取试剂盒 秀丽隐杆线虫 角质层并提取基因组DNA的方法有限。一种简便、快速（约15分钟）且成本效益高的提取方法 秀丽隐杆线虫 适用于课堂教学与科研应用的基因组DNA提取方法在此报道。该DNA提取方法经优化，可采用单个或少量晚期幼虫（L4）或成虫期线虫作为起始材料，以获得可靠的PCR模板。结果表明，所提取DNA的质量适用于通过PCR扩增不同大小的基因目标片段，即使将单个成虫基因组DNA稀释至五十分之一，仍可对单个或少量个体进行基因分型。所报道的实验方案可稳定、快速地从单个或少量样本中制备DNA模板 秀丽隐杆线虫 用于基于 PCR 的应用。

引言

此处提供了两种相关的细胞裂解方案 秀丽隐杆线虫 以使DNA适用于基于PCR的应用。PCR是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、克隆和测序所需的DNA片段扩增等多种实验目的。这种小型（1 mm）自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 是一种常用的生物研究动物体系。从单个或少数几个动物中获取合适的基因组DNA，即可通过PCR扩增目标序列。晚期L4幼虫和成虫仅含有约1,000个体细胞（包括一些多核、多倍体细胞）、生殖细胞，以及（若该个体为怀卵的雌雄同体）子代个体。 在子宫内1然而，这些动物由一层角质层保护，必须破坏该角质层才能提取基因组DNA2制备线虫基因组DNA模板用于PCR的标准方法包含多个步骤，耗时数小时。首先将线虫置于含有蛋白酶K的裂解缓冲液中冷冻（−70 °C或更低温度），冷冻时间至少15–45分钟（某些实验方案建议更长时间）。3,4,5,6此步骤可使动物体裂开。

冷冻后，将动物在60–65 °C孵育1小时，以使蛋白酶K发挥作用，随后在95 °C灭活酶15–30分钟。蛋白酶K可破坏降解DNA的核酸酶。在PCR之前灭活蛋白酶K至关重要，可防止其降解DNA聚合酶。本文所述的两种基于试剂盒的方案是快速、可靠且经济高效的基因组DNA提取方法，适用于日常科研和教学实验中从单个动物或少量线虫中提取基因组DNA。所用试剂盒最初由制造商优化用于从动物组织、唾液和毛发7中提取DNA。该方法采用专有的组织处理溶液和提取溶液裂解细胞，使基因组DNA得以释放。随后使用专有的中和溶液中和可能抑制PCR的组分（如盐类、离子和结合Mg2+的分子）。

在进行基因分型时，可对单个动物进行检测。为确定品系是否为纯合子，检测同一动物的六个或更多后代可高度确信该品系是否为纯合子（从杂合子亲本中随机获得六个纯合突变后代的概率为0.02% [(1/4)6 × 100% = 0.02%]）。该方法具有两个优势：1）操作简便，步骤少于蛋白酶K法；2）将模板制备时间缩短至15分钟。本研究结果表明，所建立的方案可高效地从单个或少量线虫中提取基因组DNA，并可稳定用于不需要高纯度DNA的下游应用，包括PCR。

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方案

1. 秀丽隐杆线虫（C. elegans）的培养与维护

注意：N2（野生型）和 blmp-1(tm548) C. elegans 品系在 20 °C 条件下，于标准线虫生长培养基（NGM）平板上培养。

  1. 在2 L的烧瓶中，将23.005 g NGM粉末溶解于973 mL水中制备NGM平板。用铝箔（或可高压灭菌且允许排气的瓶盖）覆盖烧瓶口，并用高压灭菌胶带固定封口。进行高压灭菌，采用至少30分钟的灭菌程序，以彻底溶解粉末并灭菌溶液内容物。
  2. 将培养基在水浴中冷却至 60 °C。
  3. 向冷却的培养基中加入 25 mL 无菌的 1 M 磷酸盐（KH2PO4) 缓冲液，pH 6.0；1 mL 1 M 氯化钙溶液；和 1 mL 1 M 硫酸镁溶液。
  4. 在磁力搅拌器上搅拌培养基，以获得均匀的混合物，并防止冷却和凝固不均（约5分钟）。确保搅拌子的转速足够快以形成漩涡，但又不能过快以免引入气泡（约250–300 rpm）。
  5. 将约 25 mL 培养基倒入每个 10 cm 培养皿中（总共约 40 个）。在室温下干燥过夜（通常为 16–25 °C）。
  6. 培养一个菌落 大肠杆菌 在37 °C下，将OP50接种于30-50 mL LB肉汤中过夜培养。
  7. 每孔接种 500 µL E. coli OP50 培养物，并在室温下晾干后使用（通常为 16–25 °C）8将培养板置于4 °C保存，最长可保存3周。
  8. 转移 秀丽隐杆线虫 使用金属丝接种针或其他方法将线虫转移至已铺好的培养皿中，并在该品系所需温度下（通常为16–25 °C）培养至L4期或成虫阶段；若接种时为饥饿状态的dauer幼虫，则需1–2天；若接种时为胚胎，则需3–4天。8.

2. 单条线虫DNA提取

注意：该方法适用于从单条线虫中提取 DNA（1 条线虫，总体积为 1.8 µL）。若需同时裂解多条线虫，可配制预混液。

  1. 将热循环仪程序设置为一个循环：55 °C 反应 10 分钟，随后 95 °C 反应 3 分钟（裂解程序）。
  2. 在冰上，将试剂盒中的提取液 0.8 µL 分装至 0.2 mL PCR 管内壁。向提取液液滴中加入 0.2 µL 试剂盒中的组织处理液，通过移液混匀。
  3. 在体视显微镜下鉴定 L4 期或成虫阶段的线虫9。鉴定 L4 雌雄同体时，寻找位于虫体中部、呈浅色半圆形的特征性阴门结构；鉴定成虫雌雄同体时，选择培养皿中体型最大的个体，其子宫内可能可见椭圆形的胚胎。
  4. 使用铂金丝挑取所选线虫，转移至上述溶液中10。
  5. 室温下短暂离心（2–3 秒，≤6,000 rpm/2,000 × g），使管内液体沉降至管底。
  6. 将 PCR 管放入热循环仪中，运行第 2.1 步设定的裂解程序。
  7. 程序结束后，短暂离心管子，然后置于冰上。向混合液中加入 0.8 µL 试剂盒中的中和液，通过移液混匀。
  8. 室温下短暂离心（2–3 秒，≤6,000 rpm/2,000 × g）。
  9. 裂解产物可直接用于 PCR 反应，或保存于 4 °C 或 −20 °C 以备后续使用。
    ​注意：提取的 DNA 在 4 °C 或 −20 °C 条件下至少可稳定保存 6 个月7。

3. 少数个体的DNA提取

注意：该方法适用于从少量线虫中提取DNA。如果需要同时裂解多个品系，可预先配制混合液。

  1. 将热循环仪程序设置为一个循环：55 °C 反应 10 分钟，随后 95 °C 反应 3 分钟（裂解程序）。
  2. 在冰上，将试剂盒中的提取液 2.0 µL 分装至 0.2 mL PCR 管内壁。向提取液液滴中加入 0.5 µL 试剂盒中的组织处理液，通过移液混匀。
  3. 在解剖显微镜下鉴定 L4 期或成虫期线虫9。L4 雌雄同体线虫具有特征性的阴门结构，在虫体中部呈现为浅色半圆形。成虫雌雄同体是培养皿中体型最大的个体，其子宫内可能可见椭圆形的胚胎。
  4. 使用铂金丝挑取少量线虫转移至溶液中：9 只线虫可产生相当于每 0.5 µL 裂解液含 1 只线虫基因组 DNA 的产量，16 只线虫可产生约每 0.25 µL 裂解液含 1 只线虫当量的基因组 DNA（即 3.5 条线虫/µL）10。
    注意：将超过 16 只线虫转移至该体积溶液中较为困难。
  5. 室温短暂离心管子（2–3 秒，≤6,000 rpm/2,000 × g）。
  6. 将管子放入热循环仪中，运行第 3.1 步设定的裂解程序。
  7. 程序完成后，短暂离心管子并置于冰上。向混合物中加入 2 µL 试剂盒中的中和液，通过移液混匀。
  8. 室温短暂离心管子（2–3 秒，≤6,000 rpm/2,000 × g）。
  9. 可直接将裂解产物用于 PCR，或储存于 4 °C 或 −20 °C 以备后续使用。
    ​注意：提取的 DNA 在 4 °C 或 −20 °C 下至少可稳定保存 6 个月7。

4. PCR 反应

注意：本文描述了该线虫裂解技术的一种下游应用，即利用快速聚合酶检测缺失突变。两种线虫裂解方案在制备基因组模板DNA用于PCR反应时，即使稀释至1/50仍能成功扩增，其有效性已得到验证th 每次反应所用的线虫数量也进行了展示。

  1. 按照上述第2步和第3步所述方法，使用野生型N2和突变株分别从单条线虫和16条线虫中提取DNA。
  2. 对来自野生型N2线虫的单条线虫DNA进行2倍、10倍、20倍和50倍稀释。
  3. 根据制造商说明书，使用针对目标序列的特异性引物和热启动PCR预混液设置PCR反应（表1和表2）。每个反应中使用1 µL未稀释的DNA或2 µL稀释后的DNA作为模板。
  4. 通过凝胶电泳及成像分析确认PCR产物11。

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结果

采用商用试剂盒或传统裂解法提取单个或少量野生型成虫的基因组DNA，以比较这两种方法的效率。随后以这些裂解产物为模板进行PCR扩增，目标片段分别为约2,100 bp的较大片段（编码blmp-1）或约500 bp的较小片段（编码sma-10的一部分）。两种方法均成功扩增出相应的PCR产物（图1A）。

接下来，验证了试剂盒提取的基因组DNA作为多种DNA聚合酶模板的能力。使用四种具有不同性能（包括扩增速度、保真度和产物长度）的聚合酶，以提取的基因组DNA为模板扩增一个0.5 kb的产物。无论是来自单个成虫裂解液还是九个成虫裂解液的模板，这些聚合酶均成功扩增出预期大小的产物（图1B）。通过测序可确认PCR聚合酶对模板序列的扩增准确性与保真度（补充图S1）。该结果表明，采用试剂盒方案提取的基因组DNA可作为多种聚合酶适用的模板。

使用商品化试剂盒从单...

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讨论

在进行遗传杂交以创建新的 C. elegans 品系时，确定 C. elegans 的基因型是一项重要步骤。使用单个或少量 C. elegans 进行基因组 DNA 提取，是 C. elegans 基因分型中的关键步骤。本方案描述了利用商业试剂盒从 C. elegans 中提取基因组 DNA 的方法。该方法快速且结果稳定可靠。通过此方法提取的基因组 DNA 可用于后续实验，包括基因分型、测序和克隆。所述的 DNA 提取方法已针对使用单个或少量 L4 期或成虫期线虫作为起始材料进行 C. elegans 遗传杂交的基因分型进行了优化。相当于 1/50 个线虫（图 1C）至 3.5 个线虫（图 1D）所提供的 DNA 可作为通过 PCR 扩增目标 DNA 序列的合适模板。该方案（经稀释后）从单条线虫可获得足够进行最多 45 次反应（每反应 2 µL）的模板，从 16 条线虫则可获得足够进行 100 次反应的模板。即使...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

N2 菌株和 E. coli OP50 细菌来自由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）。blmp-1(tm548) 菌株来自日本国家生物资源计划。作者感谢 WormBase 提供资源。本研究得到了美国国立卫生研究院 R01GM097591 项目对 T.L.G. 的资助、德克萨斯女子大学对 T.L.G. 的内部资助，以及德克萨斯女子大学学生研究中心对 M.F.L. 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高压灭菌指示胶带Defend43237-2
重型铝箔Reynolds Wrap2182934
氯化钙Millipore Sigma102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp 试剂盒（包含组织制备液、提取液和中和液）Sigma-Aldrich Co. LLCXNAT2-1KT
Isotemp 加热磁力搅拌器Fisher Scientific11-100-495H
LB 培养基，Lennox，胶囊装MP Biomedicals, LLC3002-131
硫酸镁，97% 纯度，无水Thermo ScientificAC413485000 (CAS 7487-88-9)
微量离心机Labnet International, Inc.PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start 高保真 DNA 聚合酶New England Biolabs, Inc.M0515S"Pol E" 用于补充图 S1，一种高速、高保真聚合酶（20–30 s/kb）
NGM 培养基粉末US Biological Life SciencesN1000
含 HF 缓冲液的 Phusion 高保真 PCR 预混液New England Biolabs, Inc.M0531S"Pol D" 在图 1B 中，一种高速、高保真聚合酶（15–30 s/kb）
引物Integrated DNA Technologies定制 DNA 寡核苷酸
PrimeSTAR GXL 聚合酶Takara Bio Inc.R050B"Pol C" 在图 1B 中，适用于 GC 含量高及长度达 30 kb 模板的高保真聚合酶（1 min/kb）
Quick-Load Purple 2-log DNA 标准品（0.1–10.0 kb）New England Biolabs, Inc.N0550S
SapphireAmp Fast PCR 预混液Takara Bio Inc.RR350A"Pol A" 在图 1B 中，用于图 1A、C、D 的高速聚合酶（10 s/kb），适用于长度达 5 kb 的扩增片段
Sigma ReadyMix Taq PCR 反应预混液Sigma-Aldrich Co. LLCP4600"Pol B" 在图 1B 中，适用于长度达 7 kb 扩增片段的聚合酶（1 min/kb）
SimpliAmp 梯度 PCR 仪Applied BiosystemsA24812
搅拌子Fisher Scientific14-512-126
涡旋混合器Fisher Scientific2215365
线虫挑取针Genesee Scientific Corporation59-AWP

参考文献

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