将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。
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摘要
摘要
肠道黏膜是一种复杂的物理和生化屏障，具有多种重要功能。它能够介导营养物质和外源性物质的转运、吸收与代谢，同时促进与微生物群的共生关系，并限制微生物的侵入。多种细胞类型与其物理和生化环境之间的功能相互作用，对于建立和维持肠道组织稳态至关重要。模拟这些复杂的相互作用以及整合的肠道生理功能 体外 是一个极具挑战性的目标，有望彻底改变新治疗靶点和药物候选物的发现与开发方式。
类器官与器官芯片技术近期已被结合，用于构建与人类相关的肠芯片，适用于在体外研究肠道生理学和病理生理学的功能特征。in vitro。来源于小肠（十二指肠）和大肠活检组织的类器官被接种至器官芯片的上层腔室，并成功扩展 为单层细胞，同时保留各肠段特有的细胞、分子及功能特性。来源于人肠道组织特异性微血管内皮细胞被引入器官芯片的下层腔室，以重建上皮-内皮界面。这一新型平台可实现肠腔对营养物质、药物和微生物的暴露，从而支持对肠道转运、通透性以及宿主-微生物相互作用的研究。
本文提供了一种建立代表人十二指肠（十二指肠芯片）和结肠（结肠芯片）的肠芯片系统的详细方案，并在持续灌注和类似蠕动的机械形变条件下进行后续培养的方法。我们展示了利用典型诱导剂和底物在十二指肠芯片中评估药物代谢及CYP3A4诱导作用的实验方法。最后，提供了一套逐步操作流程 对于 体外 在结肠芯片中模拟干扰素γ（IFNγ）介导的屏障功能障碍（肠漏综合征），包括评估细胞旁通透性改变、细胞因子分泌变化以及芯片内细胞转录组分析的方法。
引言
人类肠道是一个复杂且具有多种功能的器官，具备自我再生能力。它分为小肠和大肠。小肠的主要功能是进一步消化来自胃的食物，吸收所有营养物质，并将残余物输送至大肠，由大肠回收水分和电解质。小肠又进一步分为多个解剖结构上不同的区域：十二指肠、空肠和回肠，每个区域均适应执行特定功能。例如，十二指肠有助于 分解食糜（胃内容物），从而促进空肠对蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质的充分吸收。小肠的这一近端部分也是肠道药物吸收和代谢的主要部位，其药物代谢酶（如 CYP3A4）的表达水平高于回肠和结肠1。除了消化和吸收营养物质的主要功能外，肠道还对潜在有害的管腔内容物（如致病微生物、微生物代谢产物、食物抗原和毒素）构成有效的屏障2,3。值得注意的是，人类结肠中栖居着大量微生物，其数量远超人体自身细胞总数，这些微生物在营养、代谢和免疫方面为宿主提供诸多益处。因此，维持由肠上皮细胞形成的黏膜屏障完整性至关重要，它通过物理隔离肠道微生物群与宿主细胞，防止不必要的免疫细胞活化，从而保障两者之间的共生关系2。此外，程序性肠细胞死亡作为一种自我保护机制，可防止感染细胞持续存在或增殖，从而阻止潜在病原体扩散3；与此同时，肠上皮每四到七天持续进行自我更新，以弥补细胞丢失，确保屏障完整性和组织....
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方案
注意：所有细胞培养操作均应采用适当的无菌技术进行。
本研究中使用的人肠道类器官来自约翰斯·霍普金斯大学，所有方法均按照批准的指南和规定进行。所有实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准（IRB #NA 00038329）。
1. 细胞培养试剂的准备
- 按照制造商说明配制人源类器官生长培养基（材料表），并添加 100 µg/mL 的普乐霉素（primocin）。
- 按照制造商说明配制人源微血管内皮细胞生长培养基（材料表），并添加 1:20 体积比的胎牛血清（FBS）以及 50 μg/ml 的普乐霉素（primocin），而非 100 μg/ml。
- 将 Y-27632（Rho 激酶抑制剂）溶于无菌的含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 DPBS 中，配制成 10 mM 的储存液。分装至无菌微量离心管中，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
- 将 CHIR99021（GSK-3 抑制剂）溶于无菌二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 5 mM 的储存液。分装至无菌微量离心管中，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
- 通过将 1:1 体积比的类器官解离溶液（材料表）与 DPB....
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结果
图1D 总结了肠芯片培养的时间线，并展示了肠道内皮细胞和类器官在接种到芯片前后的情况。此外，该图还展示了十二指肠芯片与结肠芯片之间明显的形态学差异，其中十二指肠芯片中存在类似绒毛的结构，代表了小肠的组织架构特征。
图3A、B展示了来自三个不同类器官供体的十二指肠芯片中CYP3A4诱导反应的倍数变化。芯片分别暴露于20 µM RIF或100 nM VD3中48小时，用于评估CYP450酶的mRNA水平（A）和/或催化活性倍数（B）。在暴露于RIF和VD3的十二指肠芯片中，观察到睾酮代谢物6β-羟基睾酮（6β-OH-T）水平升高，与CYP3A4 mRNA基因表达上调一致，表明在所有三个供体中均出现了适当的诱导反应。数据表示n = 3个生物学独立芯片的均值±标准误（SEM）。
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讨论
器官芯片技术与肠道类器官的结合为精确模拟人体肠道生理和病理生理过程提供了前景。本文提供了一种简单且可靠的分步操作方案（如图1所示），用于建立包含活检来源的小肠或结肠上皮以及肠道微血管内皮细胞的肠道芯片，这些细胞共培养于微流控装置中。该基于芯片的人体肠道模型整合了生理性的管腔和血管流动以及类似蠕动的运动。此外，我们还描述了评估关键肠道功能的操作流程，例如十二指肠芯片中的药物代谢和结肠芯片中的屏障功能。
为了重现上皮-内皮细胞相互作用（这对维持肠道稳态以及在芯片上准确模拟肠组织至关重要），必须在PDMS膜的两侧建立功能完整且结构完整的细胞单层。成功进行芯片接种的第一步是化学活化PDMS表面，以形成PDMS表面与细胞外基质（ECM）蛋白之间的稳定连接。活化不当可能阻碍细胞附着，导致形成不完整的细胞单层。活化溶液必须新鲜配制，因其对光敏感且易降解。在紫外（UV）活化及后续ECM包被过程中，需确保每条通道内试剂均匀分布。用于包被顶部和底部通道的溶液其具体成分和浓度已分别针对上皮细胞和内皮细胞的需求进行了优化。如果需要改变肠道芯片中的.......
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披露
Gauri Kulkarni、Athanasia Apostolou、Lorna Ewart、Carolina Lucchesi 和 Magdalena Kasendra 现为或曾为 Emulate 公司的员工，可能持有该公司股权。Emulate 公司是生产器官芯片设备的企业，并已就本文所述工作发表相关专利。
致谢
感谢 Mark Donowitz 教授提供肠道活检来源的类器官，感谢 Brett Clair 设计芯片、便携式设备和培养模块的科学示意图。其余所有科学示意图均使用 BioRender 生成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小肠 人肠微血管内皮细胞 | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 × 10⁶ 个细胞/毫升；冷冻保存 |
| 人肠微血管内皮细胞 | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 × 10⁶ 个细胞/毫升；冷冻保存 |
| 活检来源的人类十二指肠类器官 | 约翰斯·霍普金斯大学 | - | 类器官由 Mark Donowitz 教授提供（机构审查委员会编号：NA_00038329）。 |
| 活检来源的人结肠类器官 | 约翰斯·霍普金斯大学 | - | 类器官由 Mark Donowitz 教授提供（机构审查委员会编号：NA_00038329）。 |
| 动物学ë CM-1™ 培养模块 | 模拟 公司 | - | 培养模块 |
| Orb-HM1™ 集线模块 | 模拟 公司 | - | 5% CO2、真空拉伸和电源供应 |
| Chip-S1™ 可拉伸芯片 | 模拟 公司 | - | 器官芯片 |
| 豆荚™ 便携式模块 | 模拟 有限公司 | - | 便携式模块 |
| 紫外光箱 | 模拟 公司 | - | - |
| 芯片支架 | 模拟 有限公司 | - | 每平方培养皿1个 |
| Steriflip®-高压过滤器 | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF滤膜 |
| 方形细胞培养皿（120 x 120 mm） | VWR | 82051-068 | - |
| 手持式 真空 吸液器 | 康宁 | 4930 | - |
| 吸取 移液器 | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL， 聚苯乙烯，单独地 包裹 |
| 吸液头 | - | 无菌（高压灭菌） | |
| 血清学 移液器 | - | 2 mL，5 mL， 10 mL 和 25 mL 低内毒素，无菌 | |
| 移液器 | P20、P200 P1000 和标准多通道 | ||
| 移液器 提示 | P20，P200， 和 P1000 | ||
| 锥形管 （蛋白质 LoBind® 管子 | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL、50 mL 离心管 |
| Eppendorf 管子® 低吸附管 | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL 离心管 |
| 96孔黑色壁板 | - | - | 用于上皮通透性分析 |
| 显微镜（带相机） | - | - | 明场 成像 |
| 水浴（或珠子） | - | - | 设定为37°C |
| 真空装置 | - | - | 最低限度 压力：-70 kPa |
| 细胞刮刀 | Biotium | 220033 | |
| T75 培养瓶 | BD Falcon | 353136 | 细胞培养瓶 |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | - | 芯片包被液 |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | - | 芯片包被液 |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（PBS） （DPBS） | 康宁 | 21-031-CV | 1X |
| 细胞培养级水 | 康宁 | MT25055CV | |
| 台盼蓝 | Sigma | 93595 | 用于细胞计数 |
| TryplE 表达 | 赛默飞世尔科技 科学的 | 12604013 | 类器官 解离 和内皮细胞 脱离 溶液 |
| 高级DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 科学的 | 12634028 | 培养基 |
| IntestiCult™ 类器官生长培养基（人源） | 干细胞技术 | 06010 | 类器官生长培养基 |
| 内皮细胞生长培养基 MV 2 | Promocell | C-22121 | 内皮细胞培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F4135 | 血清 |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | 抗菌剂 |
| 附着因子™ | 细胞系统 | 4Z0-210 | 培养瓶包被液 |
| 基质胶 - 生长因子减量型 | 康宁 | 356231 | 可溶性基底膜基质 |
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533 | 细胞外基质组分 |
| 纤连蛋白 | 康宁 | 356008 | 细胞外基质组分 |
| Y-27632 | 干细胞技术 | 72304 | 类器官培养基添加剂 |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | 类器官培养基添加剂 |
| 细胞回收溶液 | 康宁 | 354253 | 基底膜基质解离溶液 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A9576 | 30%，无菌 |
| 细胞培养级水 | 康宁 | MT25055CV | 无菌水 |
| DMSO | Sigma | D2650 | 溶剂 |
| 3KDa 蓝色级联葡聚糖 | Invitrogen | D7132 | 10 mg 粉末 |
| 利福平（RIF） | Sigma | 货号 R3501 | CYP诱导剂 |
| 睾酮水合物 | Sigma | T1500 | CYP 底物 |
| 1,25-二羟基维生素 D3（VD3） | Sigma | 货号 D1530 | CYP 诱导剂 |
| 含0.1%（v/v）甲酸的乙腈 | Sigma | 159002 | LCMS终止液 |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | EMS | 157-4 | 固定剂 |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| 正常驴血清（NDS） | Sigma | 566460 | |
| 抗Occludin | 赛默飞世尔科技 科学 | 33-1500 | 紧密连接标志物 |
| 抗Claudin 4 | 赛默飞世尔科技 科学的 | 36-4800 | 紧密连接标志物 |
| 抗E-钙黏蛋白 | Abcam | ab1416 | 上皮黏附连接标记物 |
| 抗VE-钙黏蛋白 | Abcam | ab33168 | 内皮黏附连接标志物 |
| 抗紧密连接蛋白1（ZO-1） | Thermo Fischer | 339194 | 紧密连接标志物 |
| DAPI | 赛默飞世尔科技 科学的 | 62248 | 核染色 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA裂解、分离与纯化试剂盒 |
| SuperScript™ IV VILO™ 预混液 | Invitrogen | 11756050 | 逆转录试剂盒 |
| TaqMan™ 快速高级预混液 | 应用生物系统公司 | 4444557 | qPCR 试剂 |
| QuantStudio™ 5 实时荧光定量 PCR 系统 | 应用生物系统公司 | A28573 | 实时荧光定量PCR仪 |
| 18S 引物 | 赛默飞世尔科技 | Hs99999901_s1 | 真核生物18S rRNA |
| CYP3A4 引物 | 赛默飞世尔科技 | Hs00604506_m1 | 细胞色素 家族3亚家族A成员4 |
| 皮尔斯™ 考马斯亮蓝 Plus（Bradford）检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23236 | 蛋白质定量试剂盒 |
| MSD Tris 裂解缓冲液 | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | 蛋白裂解缓冲液 |
| Cleaved/Total Caspase-3 全细胞裂解液试剂盒 | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 检测试剂盒 |
| V-PLEX 血管损伤面板 2 人试剂盒 | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX 人促炎因子Panel II（4重） | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | - | 共聚焦显微镜 |
| 蔡司 LD Plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | - | 20倍长距离物镜 |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | - | 明场显微镜 |
| 蔡司 LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | - | 10倍物镜 |
参考文献
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
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