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方法文章

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

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DOI：

10.3791/63724

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2022年5月5日

 ,  ,  ,  , 
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。

摘要

肠道黏膜是一种复杂的物理和生化屏障，具有多种重要功能。它能够介导营养物质和外源性物质的转运、吸收与代谢，同时促进与微生物群的共生关系，并限制微生物的侵入。多种细胞类型与其物理和生化环境之间的功能相互作用，对于建立和维持肠道组织稳态至关重要。模拟这些复杂的相互作用以及整合的肠道生理功能 体外 是一个极具挑战性的目标，有望彻底改变新治疗靶点和药物候选物的发现与开发方式。

类器官与器官芯片技术近期已被结合，用于构建与人类相关的肠芯片，适用于在体外研究肠道生理学和病理生理学的功能特征。in vitro。来源于小肠（十二指肠）和大肠活检组织的类器官被接种至器官芯片的上层腔室，并成功扩展 为单层细胞，同时保留各肠段特有的细胞、分子及功能特性。来源于人肠道组织特异性微血管内皮细胞被引入器官芯片的下层腔室，以重建上皮-内皮界面。这一新型平台可实现肠腔对营养物质、药物和微生物的暴露，从而支持对肠道转运、通透性以及宿主-微生物相互作用的研究。

本文提供了一种建立代表人十二指肠（十二指肠芯片）和结肠（结肠芯片）的肠芯片系统的详细方案，并在持续灌注和类似蠕动的机械形变条件下进行后续培养的方法。我们展示了利用典型诱导剂和底物在十二指肠芯片中评估药物代谢及CYP3A4诱导作用的实验方法。最后，提供了一套逐步操作流程 对于 体外 在结肠芯片中模拟干扰素γ（IFNγ）介导的屏障功能障碍（肠漏综合征），包括评估细胞旁通透性改变、细胞因子分泌变化以及芯片内细胞转录组分析的方法。

引言

人类肠道是一个复杂且具有多种功能的器官，具备自我再生能力。它分为小肠和大肠。小肠的主要功能是进一步消化来自胃的食物，吸收所有营养物质，并将残余物输送至大肠，由大肠回收水分和电解质。小肠又进一步分为多个解剖结构上不同的区域：十二指肠、空肠和回肠，每个区域均适应执行特定功能。例如，十二指肠有助于 分解食糜（胃内容物），从而促进空肠对蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质的充分吸收。小肠的这一近端部分也是肠道药物吸收和代谢的主要部位，其药物代谢酶（如 CYP3A4）的表达水平高于回肠和结肠1。除了消化和吸收营养物质的主要功能外，肠道还对潜在有害的管腔内容物（如致病微生物、微生物代谢产物、食物抗原和毒素）构成有效的屏障2,3。值得注意的是，人类结肠中栖居着大量微生物，其数量远超人体自身细胞总数，这些微生物在营养、代谢和免疫方面为宿主提供诸多益处。因此，维持由肠上皮细胞形成的黏膜屏障完整性至关重要，它通过物理隔离肠道微生物群与宿主细胞，防止不必要的免疫细胞活化，从而保障两者之间的共生关系2。此外，程序性肠细胞死亡作为一种自我保护机制，可防止感染细胞持续存在或增殖，从而阻止潜在病原体扩散3；与此同时，肠上皮每四到七天持续进行自我更新，以弥补细胞丢失，确保屏障完整性和组织稳态。上述肠道功能的损害，包括营养吸收障碍、屏障完整性受损，或肠细胞死亡与自我更新之间的失衡，可能导致多种胃肠道疾病的发生，包括 营养不良和炎症性肠病（IBD）2,3。

此前，动物模型和转化的癌症来源肠道细胞系已被用于研究人类肠道组织的生理和病理生理功能。然而，由于动物与人类之间存在显著的物种差异，动物研究结果向人类的可转化性日益受到关注，这凸显了对与人类相关的替代方法的需求。4常用的 体外 肠上皮细胞系包括 T84、Caco-2 和 HT29 细胞。尽管这些细胞系可模拟肠道屏障功能和膜转运的某些方面，但其药物代谢酶的表达水平存在改变。5、表面受体和转运蛋白4此外，它们缺乏肠道节段特异性，且无法重现肠道上皮的复杂性，每种模型仅包含肠道五种上皮细胞类型中的一种6.

最近，利用小肠和结肠新鲜活检组织建立的人类肠道类器官培养体系7,8 或诱导性多能干细胞（iPSC）9 被引入作为替代性实验模型 有望在未来补充、减少甚至替代动物实验。尽管iPSCs可通过非侵入性方式获取，但从iPSCs建立类器官需要采用复杂且耗时的实验流程（包含多个实验步骤），并产生类似于人类胎儿组织的培养物。相比之下，活检来源的类器官具有高度可扩展性，因其可利用肠道组织固有的自我更新能力，并可实现无限次传代与扩增 体外重要的是，活检来源的类器官能够维持其原始组织的疾病特征和肠道区域特异性，并模拟肠道上皮的细胞多样性。类器官可作为患者特异性的替身模型 体外 以揭示各种胃肠道疾病的生物学机制和发病过程，并改善其治疗管理。尽管肠道类器官已实现较高的生理功能水平，但由于缺乏关键的间质成分——包括血管、结缔组织、外周神经和免疫细胞——以及机械刺激，仍无法完全模拟天然器官的复杂性。已知流体流动、剪切应力、拉伸和压力等机械参数会影响组织的形态发生和稳态维持 体内 并且先前已被证明可促进细胞的成熟 体外10,11,12,13类器官系统另一个重要的缺点是其腔内环境难以接近，从而导致上皮细胞的顶膜侧无法触及。这为研究与离子和药物转运蛋白的极性表达、宿主-微生物组相互作用以及药物毒性检测相关的多种机制带来了挑战。最后，由于类器官培养具有一定的随机性，其在大小、形态和功能方面存在显著的变异性。 体外 自组织过程与细胞命运选择。因此，为了充分发挥肠道类器官在疾病建模、药物筛选和再生医学中的潜力，有必要探索新的策略，以减少类器官发育过程中的变异性，改善对腔内区域的可及性，并引入缺失的细胞间相互作用。

器官芯片技术已引入多种方法，将机械力和流体流动整合到肠道细胞培养中 体外然而，由于大多数初期概念验证研究使用的是癌症来源的细胞系，其细胞多样性不足，这些系统的相关性受到了质疑。最近，我们协同结合了肠道类器官与器官芯片技术，将两种方法的优势整合于一体 体外 系统14,15,16. 所获得的肠芯片可重现 多细胞的 肠道上皮结构、上皮-内皮组织界面的存在，以及流体流动和拉伸的机械力，从而实现器官水平功能的模拟 体外此外，使用源自原代组织的类器官（可取自人肠道的不同区域）作为起始材料，进一步提高了该模型的多功能性，因为通过类似的接种和培养流程，可建立代表人十二指肠、空肠、回肠和结肠的芯片模型。重要的是，肠芯片可实现对以下方面的实时评估：肠道屏障完整性；刷状缘及药物代谢酶活性；黏蛋白的生成；细胞因子的分泌；以及肠细胞与致病性和共生微生物的相互作用，这已在先前发表的研究中得到证实。值得注意的是，当利用不同个体组织来源的类器官构建肠芯片时，这些模型能够再现不同供体在对各种药物和处理产生功能反应时所预期的个体间差异。综上所述， 将类器官与器官芯片技术融合，为更先进、个性化的研究开辟了新途径， 体内-相关 可提高生理相关性和准确性的模型 体外 研究结果及其向人类的推演。本文提供了一项详细的实验方案 建立肠芯片及其在研究十二指肠和结肠两个肠段生理功能中的应用。首先，评估药物代谢酶活性的方法 CYP3A4 在十二指肠芯片中描述了其由利福平和维生素D3等典型化合物诱导的情况。其次，该方案概述了在结肠芯片中建立“肠漏”模型所需的步骤，通过使用在炎症性肠病（IBD）发病机制中起关键作用的标志性细胞因子来破坏上皮屏障。简而言之，来源于人活检组织的类器官被扩增培养 体外，经酶消化处理后，引入芯片的上层通道中。在持续灌注含生长因子培养基的条件下 它们会发育成具有三维结构和易于接触的顶端细胞表面的融合上皮单层。底部 "血管的" 芯片腔室中接种从小肠或大肠分离的微血管内皮细胞。上皮层与内皮层之间由一层多孔可拉伸膜隔开，该膜可促进两种组织之间的旁分泌相互作用，并在受到周期性形变时模拟人体肠道的蠕动样运动。共培养体系通过管腔和血管侧灌注适当的细胞培养基，维持动态流动条件。最后，我们描述了多种类型的检测方法及终点分析 可直接在芯片上或从采集的细胞培养流出物中进行。

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方案

注意：所有细胞培养操作均应采用适当的无菌技术进行。

本研究中使用的人肠道类器官来自约翰斯·霍普金斯大学，所有方法均按照批准的指南和规定进行。所有实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准（IRB #NA 00038329）。

1. 细胞培养试剂的准备

  1. 按照制造商说明配制人源类器官生长培养基（材料表），并添加 100 µg/mL 的普乐霉素（primocin）。
  2. 按照制造商说明配制人源微血管内皮细胞生长培养基（材料表），并添加 1:20 体积比的胎牛血清（FBS）以及 50 μg/ml 的普乐霉素（primocin），而非 100 μg/ml。
  3. 将 Y-27632（Rho 激酶抑制剂）溶于无菌的含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 DPBS 中，配制成 10 mM 的储存液。分装至无菌微量离心管中，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
  4. 将 CHIR99021（GSK-3 抑制剂）溶于无菌二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 5 mM 的储存液。分装至无菌微量离心管中，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
  5. 通过将 1:1 体积比的类器官解离溶液（材料表）与 DPBS 溶液（材料表）混合，并加入 10 µM 的 Y-27632 储存液，配制人源类器官消化液。该试剂必须每次使用前新鲜配制。

2. 人肠微血管内皮细胞（HIMECs）的培养

  1. 在将 HIMEC 接种到芯片前 7 天启动 HIMEC 培养（材料表）。仅可使用传代 1-6 代的 HIMEC 进行芯片接种。
  2. 向 T150 培养瓶中加入 5 mL 附着因子溶液（材料表），在 37 °C 下孵育 1 分钟后弃去溶液。
  3. 向培养瓶中加入 19 mL 室温预热的内皮细胞生长培养基（见步骤 1.2）。
  4. 在 37°C 水浴中解冻一支冻存的 HIMEC（200 万个细胞/支）。
  5. 将冻存管中的内容物转移至培养瓶中，轻轻摇晃培养瓶使细胞均匀分布。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中过夜，以使内皮细胞贴壁。
  6. 次日更换为 20 mL 室温预热的内皮细胞生长培养基，之后每 3 天更换一次培养基。用于芯片实验的细胞在收获当天应达到约 90% 的融合度。

3. 芯片的微加工与制备

  1. 从商业供应商处获取芯片（材料表）。拆开芯片包装，并将其放置于置于方形培养皿中的芯片支架内（材料表）。在每个芯片载体的正面标记实验条件（图1A）。
    ​注意：本方案所采用的是一种特定的市售芯片及配套仪器，但市场上多家供应商也提供多种微流控装置，这些装置可能具备其他优势，但无法实现拉伸功能。此外，器官芯片也可按照 Huh 等人21所述方法在实验室内部自行微加工制备。

4. 膜的活化与细胞外基质包被

  1. 活化溶液的制备
    1. 将ER-1和ER-2试剂（材料表）恢复至室温，平衡后使用。ER-1对光敏感，必须在避光条件下操作。
    2. 用10 mL ER-2试剂溶解ER-1，使其终浓度为0.5 mg/mL，并确认ER-1完全溶解。
  2. 表面活化
    1. 轻轻将50 µL ER-1溶液推过芯片的两个通道（图1A）。
    2. 使用移液器从芯片表面去除多余的ER-1溶液。
    3. 检查芯片，确保所有芯片均已接触到ER-1溶液。若存在气泡，加入更多ER-1溶液直至气泡完全排除。
    4. 将芯片置于紫外灯室（材料表）内孵育15分钟。确认紫外灯设置为“Consistent”模式。
    5. 将ER-1活化的芯片移回生物安全柜（BSC）中。从两个通道中吸除ER-1溶液，并用200 µL ER-2清洗残留 的ER-1溶液。
    6. 向通道中推入200 µL无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DBPS）（材料表），并将DBPS保留在通道中，直至下一步操作。
  3. 细胞外基质（ECM）及膜涂层的制备
    1. ECM组分储备液的制备
      1. 使用无菌细胞培养级水（材料表）溶解IV型胶原蛋白（材料表）和纤连蛋白（材料表），使其终浓度为1 mg/mL。分装后于-20°C保存，直至使用。
    2. 用于膜涂层的ECM工作液的制备
      1. 每涂覆12个芯片，为顶部和底部通道各准备1.5 mL ECM工作液。ECM工作液应在使用前现配。
      2. 对于顶部通道，在无菌冷DBPS中分别以200 µg/mL和100 µg/mL的浓度混合IV型胶原蛋白和溶解的基底膜基质（BMM）（材料表）。对于底部通道，在无菌冷DPBS中分别以200 µg/mL和30 µg/mL的浓度混合IV型胶原蛋白和纤连蛋白。
    3. 芯片的ECM包被
      1. 吸除芯片两个通道中的DBPS，并分别替换为对应通道的适当ECM工作液（图1A）。
      2. 检查每个芯片，确保其已接触到包被溶液。若存在气泡，推入更多包被液直至所有气泡完全排除。
      3. 向芯片支架中加入无菌DPBS，并将含有芯片的培养皿置于37 °C培养箱中过夜孵育，使ECM蛋白与活化的PDMS膜形成离子键。如需要，可在包被后2小时至1天内随时接种细胞。或者，包被后的芯片可在4°C保存过夜，随后在37°C孵育过夜，再进行细胞接种。

5. 在芯片底部通道中接种肠微血管内皮细胞（HIMECs）

注意：小肠和结肠 HIMEC 分别接种于十二指肠和结肠芯片的下通道中。

  1. 准备芯片
    1. 将包被有细胞外基质（ECM）的芯片转移至生物安全柜（BSC）中。轻柔地从芯片的两个通道中吸除ECM包被液，随后分别用200 µL类器官生长培养基和内皮细胞生长培养基清洗两个通道。
    2. 将清洗后的芯片置于37°C培养箱中，待后续进行内皮细胞接种。
  2. 收获内皮细胞
    1. 将HIMEC培养瓶转移至生物安全柜（BSC）中，并用无菌DPBS清洗。
    2. 向培养瓶中加入3 mL解离液，放入37°C培养箱中孵育2 min，以实现 细胞完全解离。
    3. 将细胞收集至15 mL圆锥形离心管中，并加入内皮细胞生长培养基至总体积达10 mL。取15–20 µL细胞悬液用于细胞计数。在150 × g 条件下离心5 min。
    4. 小心吸除上清液，并用内皮细胞生长培养基重悬HIMECs，调整细胞密度至8–10 × 106 cells/mL。
  3. 将内皮细胞接种至芯片的下层通道
    1. 将含有芯片的培养皿转移至生物安全柜（BSC）中，使用1,000 µL移液器轻柔地从下层通道中完全移除培养基。
    2. 向芯片的下层通道中加入10–15 µL HIMEC细胞悬液。接种后立即观察芯片，确保接种密度适宜（覆盖率达80%–90%）且细胞在通道内分布均匀（图1D）。若接种密度过高、过低或分布不均，使用200 µL内皮细胞生长培养基清洗通道2次，并重复接种步骤。
    3. 每批六个芯片接种完成后，立即倒置培养皿，使内皮细胞能够附着于PDMS膜的底侧。将培养皿置于37°C培养箱中孵育30 min至1 h，或直至下层通道中的HIMECs完全附着于膜上（图1D）。
  4. 清洗芯片
    1. 通过下层通道的入口轻柔地推入200 µL内皮细胞生长培养基，以去除未附着的细胞并补充培养基中的营养成分。
    2. 使用200 µL添加了5 µM CHIR99021和10 µM Y-27632的类器官生长培养基清洗上层通道中未附着的细胞。
    3. 将芯片置于37°C培养箱中，待后续进行上皮细胞接种。

6. 在芯片上通道中接种类器官片段

注意：从不同肠段活检组织中分离的类器官可在肠芯片中进行培养7。请参照 Fujii 等人所述方法，分离人肠隐窝并建立类器官培养体系22。本文中分别使用十二指肠和结肠类器官构建十二指肠芯片和结肠芯片。鉴于类器官形成与生长存在较高的批间差异和供体间差异，建议在24孔板体系中对类器官悬液的细胞密度进行预实验评估，以确定最佳接种密度（8×10⁶ 个细胞/mL）。

  1. 静态类器官培养中每孔细胞数量的初步评估
    注意：以下步骤仅用于确定芯片接种所需的类器官悬浮培养孔数，所获得的单细胞不应用于芯片接种。
    1. 小心吸取类器官培养板中三个孔的上清液。加入 500 µL 冰浴BMM解离溶液材料清单向每个孔中加入）并使用塑料刮刀将溶解的BMM从塑料表面刮下。
    2. 将类器官悬液用预冷的无菌低蛋白结合锥形管收集 1,000 µL 移液。冰上孵育60分钟，每15分钟轻轻振荡试管混匀。300 x g离心 g 5 分钟 4°C.
    3. 吸弃上清液，加入 2 mL 胰蛋白酶。于 37°C 孵育30分钟，使类器官消化至单细胞水平，然后加入10 mL完全类器官生长培养基以终止酶反应。在300 x g 5 分钟 4°C.
    4. 将细胞沉淀重悬于1 mL完全类器官生长培养基中，按照标准方法使用血细胞计数板对细胞总数进行计数。
  2. 类器官片段的制备及其在芯片中的接种
    注意：以下步骤可用于接种 芯片上通道中的十二指肠或结肠类器官。建立具有上皮单层的 体内 相关的三维细胞结构依赖于流动的存在15,23 类器官片段的成功接种。
    1. 小心吸去静态类器官培养中已确定足以达到最终接种密度为 8×10⁶ 个细胞/mL 的孔数的培养基。加入 500 µL 每孔加入冰冻的BMM解离溶液。
    2. 使用塑料刮刀将溶解的BMM从孔板表面刮下 1,000 µL 移液。将悬液收集至15 mL低蛋白结合锥形管中。
    3. 将悬液置于冰上孵育60分钟，每15分钟轻轻振荡混匀一次。随后以300 x g离心 g 5 分钟 4°C离心后应可见结构清晰的类器官沉淀。若在细胞沉淀上方观察到透明凝胶层（溶解的BMM残留物）（图1B），请按以下步骤进行。
      1. 将上清液与细胞沉淀混合，向管中加入等体积的BMM解离液。轻轻混匀，冰上放置10分钟，随后以300 x g离心 g 5 分钟 4°C.
      2. 如有需要，重复步骤 6.2.3.1，直至无溶解的 BMM 残留物存在。
    4. 弃去上清液，用类器官消化液重悬类器官沉淀（参见步骤1.5）。加入足量的类器官消化液以确保沉淀完全浸没，2 mL消化液适用于约2,400–12,000个中等大小的类器官图1D，接种后）。于 37°C 1-3 分钟
    5. 向试管中加入 Advanced DMEM/F-12 以终止酶反应，加入体积为消化液体积的四倍。在 300 x g 5 分钟 4°C.
    6. 吸弃上清液，并将类器官碎片沉淀重悬于补充有完全类器官生长培养基的培养液中 5 µM CHIR99021 和 10 µM Y-27632，使细胞浓度达到8百万个细胞/mL。准备 360 µL 将悬浮液分装至无菌的1.5 mL低蛋白结合试管中，以防止细胞因贴附管壁而导致密度降低。
    7. 移除包被芯片上通道中的培养基。添加 30 µL 每个芯片上通道中细胞悬液的孵育。将芯片在培养箱中孵育过夜 37°C 孵育器中孵育，使类器官碎片黏附于ECM包被的膜上（图1D).

7. 肠芯片的动态培养——启动及维持流体流动与类似蠕动运动

  1. 培养基的制备与脱气
    1. 为保持芯片内层流的恒定，先将培养基温度平衡至室温，然后使用真空泵和PVDF滤膜锥形管进行真空驱动过滤10分钟（培养基脱气）。
  2. 便携式模块的预处理
    注：便携式模块是作为芯片与培养模块之间接口的储液装置，可实现培养基的重复取样与给药。
    1. 在生物安全柜中打开便携式模块，并将其放置于培养模块托盘上，该托盘是用于对齐便携式模块的专用容器。
    2. 加入3 mL预先平衡的完全类器官生长培养基，补充有 5 µM CHIR99021 和 10 µM 将 Y-27632 加入上部入口储液槽，下部入口储液槽中加入 3 mL 预平衡的内皮细胞生长培养基（图1C）。加入 300 µL 相应出口储液槽中相同培养基的
    3. 将托盘带到 37°C 培养箱，并将它们插入培养模块（图1C）。使用培养模块屏幕上的控制功能运行 "扩增循环" （持续1分钟）。当状态栏显示时 "准备就绪"，引物循环完成。重复引物循环 循环以确保形成足够液滴，从而成功连接芯片。
    4. 确保所有便携式模块均已预灌注，并有可见的培养基液滴。
  3. 流的引入
    注意：通常在接种类器官片段24小时后启动灌注，以允许 肠上皮细胞牢固地附着于膜上。
    1. 清洗已接种芯片的两个通道 200 µL 相应培养基以去除气泡或细胞碎片。清洗后在端口处保留少量培养基液滴。将芯片载体滑入便携式模块中（图1C).
    2. 将便携式模块放置于托盘上，然后放入培养模块中。使用培养模块屏幕上的控制装置，设定相应的器官芯片培养条件（流速和拉伸）。
      注意：对于标准的十二指肠和结肠芯片培养条件，将流速设置为 30 µL/h15 和 60 µL/h16 分别为顶部和底部通道的流速。然而，各通道的流速可独立控制，调节范围为 0-1,000 µL/h可以使用注射泵或蠕动泵替代本文介绍的培养模块，向微流控芯片引入层流。然而，当需要同时灌注多个芯片时，使用管路和连接器在芯片与泵之间建立可靠的流体连接可能在技术上具有挑战性。
    3. 开始 "调节周期" （持续2小时）通过便携式模块和芯片对培养基施加压力，以防止气泡成核。调节循环完成后，程序化条件将恢复。
  4. 更换培养基
    1. 为两个通道配制新鲜培养基，并通过向入口储液槽中添加 2 mL 新鲜培养基，每 48 h 更换一次图1C).
    2. 暂停培养模块，将培养板移至生物安全柜中。吸除所有储液槽中的培养基，并补充新鲜培养基。将培养板放回原位，重新启动灌流。
  5. 拉伸的引入
    注意：在施加循环应变前，需让细胞生长至100%汇合度。通常在接种后3天或流体培养开始后48小时引入拉伸刺激。十二指肠采用2%循环应变，频率为0.2 Hz或0.15 Hz。11 和结肠24 在肠道芯片培养的最初24小时内分别施加相应条件，随后在肠道芯片培养的剩余时间内进一步增加至10% 以密切模拟肠上皮细胞所经历的周期性应变 体内 (图1D)25该培养模块可支持施加2%–12%的循环应变，频率最高可达0.4 Hz。
    1. 为在持续的流体培养中引入拉伸刺激，请先暂停培养模块。通过屏幕上的控制选项，将拉伸参数设置为 2% 拉伸幅度、0.2 或 0.15 Hz 频率，然后重新启动培养模块。
    2. 24小时后，重复步骤7.5.1，施加10%拉伸，频率为0.2或0.15 Hz。

8. 使用原型CYP诱导剂在十二指肠芯片中诱导CYP450

注意：细胞色素 P450（CYP450）诱导试验可用于评估受试化合物是否增加特定 CYP450 酶的 mRNA 水平和/或催化活性。本文描述了工业标准及监管机构推荐的 CYP3A4 诱导评估方案 体外 CYP诱导剂，利福平（RIF）和1,2-二羟基维生素D3（VD3）。本方法可用于鉴定不同受试化合物在人肠组织中诱导CYP450不同同工酶亚型的潜力。针对每一种待评估的酶亚型，需选择相应的特异性引物组和探针底物。

  1. 暴露于CYP诱导剂
    1. 使用无菌DMSO配制20 mM利福平（RIF）、100 mM维生素D3（VD3）和200 mM睾酮（Testosterone）的储备液（材料表）。
      注意：睾酮属于三级管制物质。操作时须遵守相关管理规定。
    2. 将上述储备液用完整的类器官生长培养基和内皮细胞生长培养基稀释，配制含CYP诱导剂的给药培养基，使终浓度为20 µM RIF和100 nmol/L VD3。通过在相应培养基中稀释DMSO配制溶剂对照组，使DMSO终浓度为0.1%。
    3. 暂停培养模块，将托盘转移至生物安全柜（BSC）。将所有进样口 储液槽中的培养基更换为2 mL含诱导剂或溶剂对照的给药培养基。将便携式模块放回培养模块中，恢复流速至30 µL/h。
    4. 24小时后，更换为新的诱导溶液，并重复步骤8.1.2–8.1.3。诱导溶液需每日新鲜配制，并在实验过程中每24小时补充一次，实验通常持续48–72小时。
  2. 与典型底物（睾酮）孵育
    1. 在收获当天，用Advanced DMEM/F12培养基配制含睾酮探针底物及相应诱导剂的溶液，使其终浓度为200 µM。配制时勿添加血清，以免干扰LCMS分析。
    2. 将托盘转移至生物安全柜（BSC），吸除所有储液槽中的给药培养基。分别用预热的Advanced DMEM/F12培养基和内皮细胞生长培养基清洗并替换顶部和底部进样口储液槽中的液体。
    3. 吸除清洗液，向储液槽中加入1 mL步骤8.2.1中配制的探针底物溶液。以1,000 µL/h的高流速灌注芯片5分钟，吸除顶部和底部的出口储液槽液体。将芯片放回培养模块，在300 µL/h恒定流速下孵育1小时。
  3. 数据分析
    1. 用于LCMS分析的样品采集
      1. 在预标记的1.5 mL离心管中分装含0.1%甲酸的乙腈终止液200 µL，置于冰上备用。LCMS终止液的组成可根据待分析底物的不同而调整。
      2. 处理1小时后，停止灌注并将托盘转移回生物安全柜（BSC）。从顶部出口储液槽中收集100 µL流出液，加入对应含有终止液的离心管中（图2A）。立即将离心管置于干冰上。样品在分析前应储存于-80°C。
      3. 采用HPLC或LC-MS/MS技术提取并分析样品，监测代谢产物6β-羟基睾酮（6β-OH-T）的生成。CYP酶活性可表示为pmol/min/mg蛋白，其中pmol指反应过程中生成的代谢物（6β-OH-T）的量。每个芯片的总蛋白含量（蛋白；mg）通过步骤8.3.2中所述的Bradford法测定。
        figure-protocol-1
        诱导倍数活性计算公式为：CYP活性（诱导组）/ CYP活性（溶剂对照组）。
      4. 若需采集用于mRNA分析的样品，请参见步骤8.3.3。
    2. 细胞裂解用于蛋白表达分析
      注：芯片上细胞的蛋白提取使用蛋白裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）（材料表）进行。提取的蛋白通过Bradford法定量后用于后续分析。
      1. 将芯片从便携式模块上拆下并置于培养皿中。用200 µL无菌DPBS清洗两个通道。
      2. 用200 µL带滤芯的移液枪头封闭底部通道出口。通过底部通道灌注50 µL解离液，并在室温下孵育2分钟。
      3. 检查内皮细胞是否完全脱落。上下吹打1–2次，吸除解离液。重复清洗一次。
      4. 用200 µL带滤芯的移液枪头封闭顶部通道出口。通过顶部通道灌注75 µL蛋白裂解缓冲液。保持移液枪头插入以封闭顶部通道入口，在室温下孵育5分钟。上下吹打5–10次，将细胞裂解液收集至预标记的1.5 mL离心管中。
      5. 重复步骤8.3.2.4，直至观察到细胞完全脱落。将所有裂解液收集至同一1.5 mL离心管中，储存于-80°C直至分析。
      6. 根据标准方法提取蛋白组分，并使用Bradford法（材料表）测定总蛋白含量。
    3. 细胞裂解用于基因表达分析
      ​注：芯片上细胞的RNA提取可使用含0.1% 2-巯基乙醇的RNA裂解缓冲液（材料表）。若需获得高产量、高质量的RNA用于NGS或微阵列分析，可选用酚类RNA裂解缓冲液。
      1. 按照步骤8.3.2.1至8.3.2.2准备肠道芯片用于裂解。
      2. 使用200 µL带滤芯的移液枪头封闭顶部通道出口。通过顶部通道灌注150 µL RNA裂解缓冲液。保持移液枪头插入以封闭顶部通道入口，在室温下孵育2分钟。若使用酚类RNA裂解缓冲液，则使用350 µL试剂。
      3. 上下吹打5–10次，将细胞裂解液收集至预标记的1.5 mL离心管中。再用150 µL RNA裂解缓冲液重复一次，合并收集。将细胞裂解液储存于-80°C直至分析。若后续进行RNA测序分析，应在裂解后1个月内完成分析。
      4. 使用RNA纯化试剂盒从细胞裂解液中提取总RNA。
      5. 使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，并使用实时PCR仪及相应的引物和缓冲液进行实时定量PCR。采用2-ΔΔCt法对结果进行定量分析。

9. 在结肠芯片中利用促炎性细胞因子破坏上皮屏障

注意：本实验方案描述了通过细胞因子干扰素γ（IFNγ）破坏肠上皮屏障的方法26,27,28,29。由于肠上皮细胞在基底外侧表达IFNγ受体，因此将细胞因子施加于结肠芯片的下层通道。  在培养第5天，当Papp值已稳定低于0.5 × 10-6 cm/s时，向芯片中引入促炎刺激。该给药方案同样适用于其他促炎性细胞因子及破坏屏障功能的试剂。

  1. IFNγ 刺激
    1. 在无菌细胞培养用水中配制浓度为 100 µg/mL 的 IFNγ 储存液（材料表）。实验期间将储存液保存于 -80°C。每次实验均应使用新鲜配制的 IFNγ 储存液，并避免反复冻融超过三次。
    2. 将储存液用脱气的内皮细胞生长培养基稀释，配制 IFNγ 给药溶液，使其终浓度为 10–100 ng/mL。
    3. 将培养板转移至生物安全柜（BSC），从底部通道入口储液池中移除培养基，并替换为 3 mL 含 IFNγ 的培养基。每天更换一次含 IFNγ 的给药培养基。
    4. 将培养板放入培养模块中，以 1,000 µL/h 的高流速灌注芯片 5 分钟，以启动 IFNγ 处理。随后将流速调回 60 µL/h，继续进行流体培养。
  2. 数据分析
    1. 上皮屏障功能评估。可在 IFNγ 处理后不同时间点，通过收集两个通道进出口储液池中的流出液，测定上皮表观通透性（Papp），即屏障功能。应在测定 Papp 前 4 小时，将荧光示踪剂加入顶部通道类器官生长培养基中。通常使用 3 kDa Dextran Cascade Blue 作为荧光示踪剂，并建议在测定前 24 小时加入培养基。
      1. 暂停培养模块运行，将培养板转移至生物安全柜（BSC）。
      2. 准备一块每孔含有 100 µL DPBS 的 96 孔黑色壁板，并做好标记。使用 200 µL 多通道移液器，从所有储液池中收集 50 µL 流出液，并分别加入对应孔中（图 2B）。
      3. 为制备标准曲线，先将含 100 µg/mL 3 kDa Dextran Cascade Blue 的培养基用 DPBS 按 1:3 比例稀释，随后使用内皮细胞生长培养基在 DPBS 中进行三倍系列稀释。
      4. 使用酶标仪在 375 nm 激发波长和 420 nm 发射波长下读取荧光值。利用测得的光密度（OD）值，按以下公式计算表观通透性（Papp）：
        figure-protocol-2
    2. 芯片上细胞的免疫荧光染色
      1. 每个通道使用 200 µL DPBS 洗涤三次。
      2. 每个通道灌注 200 µL 固定液（DPBS 中含 4% 多聚甲醛），室温孵育 15 分钟。
      3. 重复步骤 9.2.2.1 的洗涤操作。此阶段洗涤后的芯片可在 4°C 保存最多 7 天。
      4. 每个通道使用 200 µL 通透液（DPBS 中含 0.1% Triton-X 100 和 10% 正常驴血清（NDS））进行通透处理，室温孵育 30 分钟。重复步骤 9.2.2.1 的洗涤操作。
      5. 每个通道使用 200 µL 封闭液（DPBS 中含 10% NDS）对芯片上的细胞进行封闭，室温孵育 1 小时。
      6. 将一抗用抗体稀释液（DPBS 中含 5% NDS）稀释如下：抗 Zonula Occludens 1（ZO-1）（1:100，上皮紧密连接标志物）、抗 Occludin（1:100，上皮紧密连接标志物）、抗 Claudin 4（1:100，上皮紧密连接标志物）、抗 E-cadherin（1:100，上皮粘附连接标志物）（材料表）。每个通道灌注 200 µL 一抗溶液，4°C 过夜孵育。重复步骤 9.2.2.1 的洗涤操作。
      7. 将二抗用抗体稀释液（DPBS 中含 5% NDS）按 1:300 稀释。每个通道灌注 200 µL 该溶液，室温孵育 2 小时。重复步骤 9.2.2.1 的洗涤操作。如需要，可将细胞骨架标志物鬼笔环肽（phalloidin）加入二抗溶液中。
      8. 在 DPBS 中配制 50 µg/mL 的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，每个通道灌注 200 µL。室温孵育 15 分钟。重复洗涤步骤。染色后的芯片此时可在 4°C 保存最多 14 天。
    3. 半胱天冬酶 3（Caspase 3）切割的评估
      1. 按照步骤 8.3.2 所述方法分离并定量上皮细胞的总蛋白量。省略步骤 8.3.2.1 的洗涤操作。用 DPBS 将样品稀释至终浓度为 400 µg/mL。
      2. 根据试剂盒说明书，使用 Caspase 3 检测试剂盒定量总 Caspase 3 和切割型 Caspase 3 的水平。
    4. 促炎性细胞因子分泌的评估
      1. 收集结肠芯片两个通道出口处的流出液，按照试剂盒说明书定量分泌的急性期促炎性细胞因子。V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit 进行 5 倍稀释，V-PLEX Human Proinflammatory Panel II 进行 2 倍稀释。

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结果

图1D 总结了肠芯片培养的时间线，并展示了肠道内皮细胞和类器官在接种到芯片前后的情况。此外，该图还展示了十二指肠芯片与结肠芯片之间明显的形态学差异，其中十二指肠芯片中存在类似绒毛的结构，代表了小肠的组织架构特征。

图3A、B展示了来自三个不同类器官供体的十二指肠芯片中CYP3A4诱导反应的倍数变化。芯片分别暴露于20 µM RIF或100 nM VD3中48小时，用于评估CYP450酶的mRNA水平（A）和/或催化活性倍数（B）。在暴露于RIF和VD3的十二指肠芯片中，观察到睾酮代谢物6β-羟基睾酮（6β-OH-T）水平升高，与CYP3A4 mRNA基因表达上调一致，表明在所有三个供体中均出现了适当的诱导反应。数据表示n = 3个生物学独立芯片的均值±标准误（SEM）。

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讨论

器官芯片技术与肠道类器官的结合为精确模拟人体肠道生理和病理生理过程提供了前景。本文提供了一种简单且可靠的分步操作方案（如图1所示），用于建立包含活检来源的小肠或结肠上皮以及肠道微血管内皮细胞的肠道芯片，这些细胞共培养于微流控装置中。该基于芯片的人体肠道模型整合了生理性的管腔和血管流动以及类似蠕动的运动。此外，我们还描述了评估关键肠道功能的操作流程，例如十二指肠芯片中的药物代谢和结肠芯片中的屏障功能。

为了重现上皮-内皮细胞相互作用（这对维持肠道稳态以及在芯片上准确模拟肠组织至关重要），必须在PDMS膜的两侧建立功能完整且结构完整的细胞单层。成功进行芯片接种的第一步是化学活化PDMS表面，以形成PDMS表面与细胞外基质（ECM）蛋白之间的稳定连接。活化不当可能阻碍细胞附着，导致形成不完整的细胞单层。活化溶液必须新鲜配制，因其对光敏感且易降解。在紫外（UV）活化及后续ECM包被过程中，需确保每条通道内试剂均匀分布。用于包被顶部和底部通道的溶液其具体成分和浓度已分别针对上皮细胞和内皮细胞的需求进行了优化。如果需要改变肠道芯片中的...

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披露

Gauri Kulkarni、Athanasia Apostolou、Lorna Ewart、Carolina Lucchesi 和 Magdalena Kasendra 现为或曾为 Emulate 公司的员工，可能持有该公司股权。Emulate 公司是生产器官芯片设备的企业，并已就本文所述工作发表相关专利。

致谢

感谢 Mark Donowitz 教授提供肠道活检来源的类器官，感谢 Brett Clair 设计芯片、便携式设备和培养模块的科学示意图。其余所有科学示意图均使用 BioRender 生成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小肠 人肠微血管内皮细胞AlphaBioRegenALHE150.5 × 10⁶ 个细胞/毫升；冷冻保存
人肠微血管内皮细胞AlphaBioRegenALHE160.5 × 10⁶ 个细胞/毫升；冷冻保存
活检来源的人类十二指肠类器官约翰斯·霍普金斯大学-类器官由 Mark Donowitz 教授提供（机构审查委员会编号：NA_00038329）。
活检来源的人结肠类器官约翰斯·霍普金斯大学-类器官由 Mark Donowitz 教授提供（机构审查委员会编号：NA_00038329）。
动物学ë CM-1™ 培养模块模拟 公司-培养模块
Orb-HM1™ 集线模块模拟 公司-5% CO2、真空拉伸和电源供应
Chip-S1™ 可拉伸芯片模拟 公司-器官芯片
豆荚™ 便携式模块模拟 有限公司-便携式模块
紫外光箱模拟 公司--
芯片支架模拟 有限公司-每平方培养皿1个
Steriflip®-高压过滤器EMD MilliporeSE1M003M000.45 μm PVDF滤膜
方形细胞培养皿（120 x 120 mm）VWR82051-068-
手持式 真空 吸液器康宁4930 -
吸取 移液器Corning / Falcon3575582 mL， 聚苯乙烯，单独地 包裹
吸液头 -无菌（高压灭菌）
血清学 移液器 -2 mL，5 mL， 10 mL 和 25 mL 低内毒素，无菌
移液器P20、P200 P1000 和标准多通道
移液器 提示 P20，P200， 和 P1000
锥形管 （蛋白质 LoBind® 管子Eppendorf0030122216; 003012224015 mL、50 mL 离心管
Eppendorf 管子® 低吸附管Eppendorf0224310811.5 mL 离心管
96孔黑色壁板--用于上皮通透性分析
显微镜（带相机）--明场 成像
水浴（或珠子）--设定为37°C
真空装置 --最低限度 压力：-70 kPa
细胞刮刀Biotium220033
T75 培养瓶BD Falcon353136细胞培养瓶
Emulate Reagent-1 (ER-1)Emulate Inc.-芯片包被液
Emulate Reagent-2 (ER-2)Emulate Inc.-芯片包被液
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（PBS） （DPBS）康宁21-031-CV1X
细胞培养级水康宁MT25055CV
台盼蓝Sigma93595用于细胞计数
TryplE 表达赛默飞世尔科技 科学的12604013类器官 解离 和内皮细胞 脱离 溶液
高级DMEM/F12赛默飞世尔科技 科学的12634028培养基
IntestiCult™ 类器官生长培养基（人源）干细胞技术06010类器官生长培养基
内皮细胞生长培养基 MV 2PromocellC-22121内皮细胞培养基
胎牛血清（FBS）SigmaF4135血清
Primocin™ InvivoGenANT-PM-1抗菌剂
附着因子™细胞系统4Z0-210培养瓶包被液
基质胶 - 生长因子减量型康宁356231可溶性基底膜基质
IV型胶原蛋白SigmaC5533细胞外基质组分
纤连蛋白康宁356008细胞外基质组分
Y-27632干细胞技术72304类器官培养基添加剂
CHIR99021Reprocell04-0004-10类器官培养基添加剂
细胞回收溶液康宁354253基底膜基质解离溶液
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA957630%，无菌
细胞培养级水康宁MT25055CV无菌水
DMSOSigmaD2650溶剂
3KDa 蓝色级联葡聚糖InvitrogenD713210 mg 粉末
利福平（RIF）Sigma货号 R3501CYP诱导剂
睾酮水合物SigmaT1500CYP 底物
1,25-二羟基维生素 D3（VD3）Sigma货号 D1530CYP 诱导剂
含0.1%（v/v）甲酸的乙腈Sigma159002LCMS终止液
IFNγPeprotech300-02
4% 多聚甲醛（PFA）EMS157-4固定剂
Triton-X 100SigmaT8787
正常驴血清（NDS）Sigma566460
抗Occludin赛默飞世尔科技 科学33-1500紧密连接标志物
抗Claudin 4赛默飞世尔科技 科学的36-4800紧密连接标志物
抗E-钙黏蛋白Abcamab1416上皮黏附连接标记物
抗VE-钙黏蛋白Abcamab33168内皮黏附连接标志物
抗紧密连接蛋白1（ZO-1）Thermo Fischer339194紧密连接标志物
DAPI赛默飞世尔科技 科学的62248核染色
2-巯基乙醇SigmaM6250
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183020RNA裂解、分离与纯化试剂盒
SuperScript™ IV VILO™ 预混液Invitrogen11756050逆转录试剂盒
TaqMan™ 快速高级预混液应用生物系统公司4444557qPCR 试剂
QuantStudio™ 5 实时荧光定量 PCR 系统应用生物系统公司A28573实时荧光定量PCR仪
18S 引物赛默飞世尔科技Hs99999901_s1真核生物18S rRNA
CYP3A4 引物赛默飞世尔科技Hs00604506_m1细胞色素  家族3亚家族A成员4
皮尔斯™ 考马斯亮蓝 Plus（Bradford）检测试剂盒赛默飞世尔科技23236蛋白质定量试剂盒
MSD Tris 裂解缓冲液Meso Scale DiagnosticsR60TX-3蛋白裂解缓冲液
Cleaved/Total Caspase-3 全细胞裂解液试剂盒Meso Scale DiagnosticsK15140DCaspase 3 检测试剂盒
V-PLEX 血管损伤面板 2 人试剂盒Meso Scale DiagnosticsK15198D
V-PLEX 人促炎因子Panel II（4重）Meso Scale DiagnosticsK15053D
Zeiss LSM 880Zeiss-共聚焦显微镜
蔡司 LD Plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27Zeiss-20倍长距离物镜
Zeiss AXIOvert.A1Zeiss-明场显微镜
蔡司 LD A-Plan 10X/0.25 Ph1Zeiss-10倍物镜

参考文献

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761(2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135(2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43(2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106(2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

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