一种用于人胰腺组织中N-糖肽和磷酸化肽同步分析的旋转尖端富集策略

摘要

质谱技术能够对翻译后修饰（PTMs）实现深度覆盖，但由于这些修饰与未修饰分析物相比化学计量比较低，通常需要从复杂的生物基质中进行富集。在自下而上的蛋白质组学流程中，大多数针对肽段上翻译后修饰的富集方法——即先将蛋白质进行酶解，再分析所产生的肽段——仅能富集单一类型的修饰。然而，正是多种翻译后修饰的整体共同作用才导致了生物学功能的产生，仅富集单一类型修饰可能会遗漏修饰之间的相互作用。在人类蛋白质中最常见的两种翻译后修饰——蛋白质糖基化与磷酸化之间，已观察到存在修饰间的相互作用，而这两种修饰也是质谱分析流程中研究最为广泛的。本文所述的同步富集策略可用于从人源死后胰腺组织（一种复杂的生物基质）中同时富集这两种修饰。采用双功能Ti(IV)固定化金属亲和色谱法，通过便捷的离心小柱方法，可在多个组分中同时分离糖基化和磷酸化的不同形式，从而实现对潜在翻译后修饰相互作用的下游分析。该针对糖肽和磷酸肽的富集流程可应用于多种样本类型，以实现对多种翻译后修饰的深度谱型分析，并为后续研究鉴定潜在的靶分子。

引言

蛋白质翻译后修饰（PTMs）在调控蛋白质结构及其功能和下游生物学过程方面起着重要作用。由于多种PTMs带来的组合多样性，人类蛋白质组的复杂性呈指数级增加。蛋白质与其基因组预测的经典序列不同的各种变体被称为蛋白质异构体（proteoforms），而许多蛋白质异构体来源于PTMs¹。近年来，研究健康与疾病状态下蛋白质异构体的多样性已成为备受关注的研究领域^2,3。

通过基于质谱（MS）的蛋白质组学方法的发展，对蛋白质异构体特别是翻译后修饰（PTMs）进行深入研究已变得更加便捷。利用质谱技术，分析物被离子化、碎裂，并根据其质荷比进行鉴定 m/z 的片段。由于与非修饰形式的蛋白质相比，翻译后修饰（PTMs）的相对丰度较低，因此通常需要采用富集方法。尽管对完整蛋白质及其翻译后修饰进行分析（称为自上而下分析）已变得越来越常规，但通过酶解蛋白质并对其组分肽段进行分析的自下而上分析法仍是目前应用最广泛的翻译后修饰研究途径。在众多翻译后修饰中，研究最为广泛且最常见的两种 体内是糖基化和磷酸化⁴这两种翻译后修饰在细胞信号传导和识别中起着关键作用，因此在疾病研究中是需要重点表征的重要修饰。

不同翻译后修饰（PTM）的化学性质通常为在分析前对蛋白质和肽水平上的这些修饰进行富集提供了途径。由于每个单糖上富含羟基，糖基化是一种亲水性PTM。该特性可用于亲水相互作用色谱法（HILIC）中富集糖肽，从而将亲水性更强的糖肽与疏水性的未修饰肽分离⁵。磷酸化会添加磷酸基团，该基团在非酸性pH条件下带负电荷。由于这种电荷特性，可利用多种金属阳离子（包括钛）吸引并结合磷酸化肽，而未磷酸化的肽则被洗脱除去，此即固定化金属离子亲和色谱法（IMAC）的原理。有关糖基化和磷酸化及其他富集策略的进一步讨论，可参见近期的综述文章^6,7。

起始肽段材料通常需要较大量的投入（0.5 mg 或更多），这是由于肽段上翻译后修饰（PTMs）的化学计量比较低。在某些难以获得足够样本量的情况下，例如肿瘤组织核心活检或脑脊液分析，采用简便高效的实验流程以获取最大化的生物分子信息显得尤为重要。我们实验室及其他研究团队近期开发的策略表明，可利用相同的翻译后修饰富集流程，实现糖基化与磷酸化的同步平行分析。^8,9,10,11,12尽管这两种PTM的化学性质可能不同，但由于采用了创新的分离技术和材料，这些PTM仍可分步进行分析。例如，静电排斥-亲水相互作用色谱（ERLIC）结合了分析物与流动相之间的亲水相互作用以及分析物与固定相材料之间的电荷-电荷相互作用，实现多维分离。^13,14,15,16在酸性 pH 条件下，磷酸化肽段与固定相之间的吸引力可增强其保留能力，从而实现与非修饰肽段的有效分离。采用将 Ti(IV) 固载于亲水性微球上的材料，可用于基于 HILIC 和 IMAC 的洗脱方式，分离磷酸肽以及中性、酸性和甘露糖-6-磷酸化糖肽。^17,18该策略被称为双功能Ti(IV)-IMAC。采用这些策略在单一工作流程中富集多种PTM，可更便捷地分析潜在的PTM串扰相互作用。此外，与并行进行的传统富集方法相比，该方法所需的总样品量和时间更少（即, HILIC 和 IMAC 分别在不同的样品等分试样上进行。

为了展示用于同时分析蛋白质糖基化和磷酸化的双功能 Ti(IV)-IMAC 策略，我们已将其应用于死后人类胰腺组织的分析。胰腺既产生消化酶，也产生包括胰岛素和胰高血糖素在内的调节激素。在胰腺疾病中，胰腺功能会受到损害。在糖尿病中，血糖调节受到影响，导致血液中葡萄糖水平升高。在胰腺炎中，器官的自体消化会引起炎症³。翻译后修饰谱（PTM）的变化，包括糖基化和磷酸化，可能会随之发生，这在其他疾病中也常常如此。

本文描述了一种基于双功能Ti(IV)-IMAC策略的旋转尖端式同步富集方法，用于富集源自胰腺组织蛋白提取物的N-糖肽和磷酸化肽。该方案包括蛋白质提取与消化、富集、质谱数据采集及数据处理，流程如图所示。 图1本研究的代表性数据可获取 通过 ProteomeXchange 联盟，标识符 PXD033065

图1：人胰腺组织中N-糖肽与磷酸化肽同时分析的工作流程。 组织首先经冷冻粉碎处理成细粉，随后使用去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）进行蛋白质提取。提取的蛋白质再经酶解消化。所得肽段在使用双功能Ti(IV)-IMAC富集前进行分装。原始数据通过纳米级反相液相色谱-质谱联用技术（nRPLC-MS）采集，并利用数据库搜索软件进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

本方案旨在使翻译后修饰（PTM）分析更易于开展，并能够在同一工作流程中广泛分析多种翻译后修饰。该方案可应用于其他复杂的生物基质，包括细胞和生物流体。

方案

已获得死者近亲同意将胰腺组织用于科研，并已取得威斯康星大学麦迪逊分校健康科学机构审查委员会的授权。根据《美国联邦法规》45 CFR 46.102(f) 的规定，该研究不涉及人类受试者，因此无需接受机构审查委员会的监管。

警告：操作本方案中使用的试剂时应小心，这些试剂包括酸类（甲酸、乙酸、三氟乙酸）、碱类（氢氧化铵）和冷冻剂（液氮）。请阅读所用试剂的安全数据表，以了解相关的危害和必要的预防措施。以百分比表示的浓度均为体积/总体积（v/v），并用水稀释。

1. 组织冷冻粉碎、裂解和蛋白质提取

1. 用液氮填充杜瓦瓶。将组织粉碎机中将与胰腺组织接触的部件（即研磨室、粉碎头和回收勺）预先冷却，置于聚苯乙烯容器中。
2. 将冷冻的组织块转移至预冷的样品 holder 中，并向组织中加入一勺液氮。
3. 将粉碎头放入研磨室，用锤子敲击5到10次以粉碎样品。从研磨室中取出粉碎头，并刮下附着在其上的组织粉末和碎片。
4. 若组织开始融化，向研磨室中加入一勺液氮。重复粉碎过程，直至样品成为无大块组织的细粉。将样品分装至预冷的离心管中，每管约100 mg。
5. 配制裂解缓冲液，含4%十二烷基硫酸钠（SDS）、150 mM NaCl和25 mM Tris（pH = 7.4）。将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片分别溶于500 µL水中，配制成20x储存液。按需将两种抑制剂的20x储存液加入裂解缓冲液中，使终浓度为1x。
6. 每100 mg组织加入600 µL裂解缓冲液，置于加热金属块中95 °C孵育10分钟，同时以800 rpm振荡。从加热块中取出样品，冷却至室温。
7. 以60 W能量（20 kHz）超声处理样品，采用15秒脉冲、30秒间歇，总时长45秒。在4 °C下以3,000 x g离心15分钟，收集沉淀。
8. 将上清液加入5倍体积的沉淀溶剂中（即300 µL裂解缓冲液加入1.5 mL沉淀溶剂），沉淀溶剂组成为50%丙酮、49.9%乙醇和0.1%乙酸。于-20 °C过夜冷藏。
9. 再次在4 °C下以3,000 x g离心15分钟，弃去上清液。用刮刀将沉淀打散，并用等量的沉淀溶剂洗涤。重复离心和洗涤步骤两次。
10. 在4 °C下以16,000 x g离心15分钟，收集沉淀。将沉淀在通风橱中风干15分钟，随后于-80 °C保存，直至后续使用。

2. 蛋白质消化与脱盐

1. 将蛋白质沉淀重悬于 300 µL 新配制的消化缓冲液中，缓冲液含 50 mM 三乙基碳酸氢铵（TEAB）和 8 M 尿素。
2. 根据试剂盒说明书，使用蛋白质定量检测法估算溶液中的蛋白质浓度。
3. 向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为 5 mM，混匀后室温还原 1 小时。然后加入碘乙酰胺（IAA），使其终浓度为 15 mM，混匀后避光室温烷基化 30 分钟。按之前加入 DTT 的相同体积再次加入 DTT 以淬灭烷基化反应，并混匀。
4. 按 1:100 的酶:蛋白质比例加入 LysC/胰蛋白酶，在 37 °C 孵育 4 小时。随后加入 50 mM TEAB 将尿素浓度从 8 M 稀释至 < 1 M。再按 1:100 的酶:蛋白质比例加入胰蛋白酶，在 37 °C 过夜孵育。
5. 加入三氟乙酸（TFA）至终体积比为 0.3%，以终止消化反应。每 1 mg 起始蛋白质，使用 1 mL 乙腈（ACN）和 3 次每次 1 mL 的 0.1% TFA 对脱盐柱（1 cc，10 mg）进行活化处理。
6. 将消化后的混合物上样至脱盐柱。用 1 mL 的 0.1% TFA 洗涤 3 次。若洗脱速度较慢，可施加正压，但避免流速 > 每秒一滴。
7. 用 1 mL 含 60% 乙腈和 0.1% 甲酸（FA）的溶液洗脱肽段。使用离心式真空浓缩仪在约 35 °C 下干燥洗脱液，直至溶剂完全蒸发。
8. 将肽段重悬于 300 µL 水中，根据试剂盒说明书使用肽段定量检测法测定浓度。将肽段分装为每份 500 µg，彻底干燥。

3. ERLIC N-糖肽富集

注意：离心机的确切转速和时间可能因样品而异，必须进行优化。通常情况下，300 × g 离心 2 分钟适用于材料的预处理和洗涤，100 × g 离心 5 分钟适用于洗脱。

1. 称取约 3 mg 棉花，装入一个空的 200 µL 移液器吸头中（旋转柱；参见材料表）。
2. 将强阴离子交换富集材料转移至离心管中，按每 10 mg 材料加入 200 µL 0.1% TFA。若需富集 500 µg 肽段，则使用 15 mg 材料。通过振荡 15 分钟活化材料。
3. 使用管适配器，将旋转柱置于 2 mL 离心管上方，并向柱中加入相当于 15 mg 材料的悬浮液。在台式离心机中离心去除液体。
4. 用 200 µL 乙腈（ACN）离心洗涤材料 3 次以进行平衡。随后依次使用 100 mM 醋酸铵（NH₄Ac）、1% TFA 和 80% ACN/0.1% TFA（上样缓冲液）重复进行三轮平衡。
5. 将 500 µg 肽段样品重悬于约 200 µL 上样缓冲液中，并使其流经旋转柱。将流出液重新上样 2 次，以确保结合完全。
6. 用 200 µL 80% ACN/0.1% TFA 离心洗涤材料 5 次，再用 200 µL 80% ACN/0.1% 甲酸（FA）洗涤 2 次。
7. 依次用以下每种溶液各 200 µL 离心洗脱肽段：50% ACN/0.1% FA（E1）；0.1% FA（E2）；0.1% TFA（E3）；300 mM KH₂PO₄、10% ACN（E4）。
8. 用 200 µL 80% ACN/5% NH₄OH 离心洗涤材料 2 次，然后用 200 µL 10% NH₄OH 洗脱残留肽段（E5）。
9. 使用离心真空浓缩仪在约 35 °C 下将所有洗脱液完全干燥。
10. 按照生产商说明书，使用脱盐柱对碱性洗脱液（E5）进行脱盐处理。
11. 使用离心真空浓缩仪在约 35 °C 下将脱盐柱洗脱液完全干燥。

4. Ti(IV)-IMAC 磷酸化肽富集

注意：离心机的确切转速和时间可能因样本而异，需进行优化。通常情况下，300 × g 离心 2 分钟适用于材料的预处理和洗涤，100 × g 离心 5 分钟适用于洗脱。

1. 称取约 3 mg 脱脂棉，装入空的 200 µL 吸头（离心小柱）中。
2. 将 Ti-IMAC 磷酸化肽富集材料转移至离心管中，每 10 mg 材料加入 200 µL 的 0.1% TFA。若需富集 500 µg 肽段，则使用 10 mg 材料。
3. 使用管适配器将离心小柱置于 2 mL 离心管上，向小柱中加入相当于 10 mg 材料的悬浮液。在台式离心机中离心去除液体。
4. 用 200 µL 的 40% ACN/3% TFA 对材料进行预平衡，离心条件同上。将肽段样品重悬于 200 µL 的 40% ACN/3% TFA 中，并过柱；将流出液重复上样两次，以确保结合更完全。
5. 用 200 µL 的 50% ACN、6% TFA 和 200 mM NaCl 溶液离心洗涤材料，随后用 200 µL 的 30% ACN 和 0.1% TFA 溶液洗涤两次。
6. 用 200 µL 的 10% NH₄OH 洗脱肽段。在真空下将洗脱液完全干燥。按照生产商说明书使用脱盐小柱进行脱盐处理。再次在真空下将脱盐小柱的洗脱液完全干燥。

5. 双功能 Ti(IV) 同步富集

注意：离心机的确切转速和时间可能因样本而异，需进行优化。通常情况下，300 × g 离心 2 分钟适用于材料的预处理和洗涤，100 × g 离心 5 分钟适用于洗脱。

1. 称取约 3 mg 棉花，装入空的离心小柱中。
2. 将约 1 g Ti(IV)-IMAC 材料转移至离心管中。加入 0.1% TFA 至已知浓度的材料中，例如 20 mg/200 µL（材料可在此悬浮液中于 4 °C 保存）。
3. 为从 500 µg 肽段中进行富集，向离心小柱中加入足量的浆液以转移 20 mg 材料。用 200 µL 0.1% TFA 离心洗涤离心小柱。
4. 将样品重悬于 200 µL 上样/洗涤溶剂（80% ACN 和 3% TFA）中，并通过离心小柱。将流出液重复上样 2 次。
5. 用 200 µL 上样/洗涤溶剂离心洗涤离心小柱 6 次。再用 200 µL 80% ACN/0.1% FA 溶液洗涤离心小柱。
6. 用以下每种溶液各 200 µL 洗脱肽段：60% ACN/0.1% FA（E1）和 40% ACN/0.1% FA（E2）。分别分析每次洗脱液。
7. 用以下每种溶液各 200 µL 洗脱肽段：20% ACN/0.1% FA 和 0.1% FA。合并两次洗脱液并作为单一样品分析（E3）。
8. 用以下每种溶液各 200 µL 洗脱肽段：40% ACN/3% TFA；50% ACN/6% TFA，200 mM NaCl；以及 30% ACN/0.1% TFA。合并这些洗脱液，使用填充小柱脱盐后作为单一样品分析（E4）。
9. 使用 200 µL 90% ACN/2.5% NH₄OH 将材料在碱性 pH 条件下活化 3 次。弃去这些洗涤液。
10. 用以下每种溶液各 200 µL 洗脱肽段：60% ACN/10% NH₄OH（E5）和 40% ACN/10% NH₄OH（E6）。使用填充小柱脱盐后，分别分析这些洗脱液。
11. 用以下每种溶液各 200 µL 洗脱肽段：20% ACN/10% NH₄OH；10% ACN/10% NH₄OH；以及 10% NH₄OH。合并这些洗脱液，使用填充小柱脱盐后作为单一样品分析（E7）。
12. 将所有洗脱液在真空下完全干燥。

6. 纳流反相液相色谱-质谱联用技术（nRPLC-MS）

注意：质谱数据采集和分析方法多种多样，因此本文仅介绍一种推荐的液相色谱-质谱联用（LC-MS）流程及其相关参数。采用前述样品制备和富集步骤所获得的样品，也可通过其他仪器配置进行分析，包括使用市售的色谱柱，只要数据质量足够即可。

1. 按照文献¹⁹所述方法，使用C18材料填充一根15 cm长的毛细管柱（内径75 µm）。配制流动相A（含0.1%甲酸的水溶液）和流动相B（含0.1%甲酸的乙腈溶液）。
2. 将富集后的肽段样品用15 µL含3%流动相B的溶液重新溶解。直接上样2 µL（约样品总体积的13%）至色谱柱。每个样品进行两次技术重复分析。
3. 以0.3 µL/min的流速，采用90分钟内从3%至30%流动相B的梯度对肽段进行洗脱。随后用75% B冲洗色谱柱8分钟，再用95% B冲洗8分钟，最后以3% B平衡12分钟结束方法程序。
4. 将质谱仪设置为正离子模式，采用数据依赖性采集方式，选择前20个最强信号峰进行分析，参数如下：喷雾电压2 kV；一级质谱（MS¹）在LC/MS模式下扫描范围为400–2,000 m/z，分辨率120,000，自动增益控制（AGC）目标值2E5，最大离子注入时间100 ms，射频透镜30%，四极杆隔离窗口1.6 m/z，选取电荷态为2–8及未定电荷态的离子，动态排除时间为30 s；二级质谱（MS²）在LC/MS模式下采用阶梯式HCD碎裂（22%、30%和38%），固定一级质荷比为120 m/z，分辨率30,000，AGC目标值5E4，最低信号强度阈值为2.5E4。

7. 质谱数据分析

注意：此处展示了一种使用两种不同软件分析同一数据集的数据分析流程。磷酸化和糖基化修饰的搜索可通过单一软件同时进行，而非如本文所述使用两种独立软件；但通常情况下，软件的搜索时间与搜索空间（即所考虑的翻译后修饰种类数量）成正比。因此，为提高效率，本文采用两种不同软件并行搜索糖肽和磷酸化肽。

1. 使用适当的软件处理原始数据文件（参见材料表）。
   1. 在UniProt人类（或相应物种特异性）数据库中搜索质谱数据。将半胱氨酸的羧甲基化设为固定修饰。酶切位点的最大遗漏裂解数设为2。
2. 在原始数据文件中，使用商业软件（参见材料表）搜索待分析的糖肽²⁰。前体离子质量容差设为10 ppm，碎片离子质量容差设为0.01 Da，最低肽段长度为4个残基。
   1. 使用软件内置的N-糖数据库，并扩展添加典型的甘露糖-6-磷酸（M6P）糖链结构，包括HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2)、HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2)、HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1)和HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1)，进行搜索。
   2. 将N-糖基化设为常见修饰。每条肽段谱图匹配（PSM）的最大总修饰数设为1个常见修饰和2个稀有修饰。
   3. 设置以下可变修饰：甲硫氨酸的氧化（稀有）、天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺（稀有）、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化（常见）。设置以下鉴定筛选条件：评分阈值> 150，|log prob| > 1，以及修饰差异评分（delta mod score）> 10。
   4. 在“蛋白质”和“肽段组”标签页中导出并分析搜索结果。
   5. 手动筛选含有M6P糖链的鉴定结果，检查其MS/MS谱图中是否存在PhosphoHex特征性氧化物离子（243 m/z），剔除不含该诊断离子的假阳性鉴定。
3. 在原始数据文件中，使用开源软件（参见材料表）搜索待分析的磷酸化肽段²¹。一级搜索肽段质量容差设为20 ppm，主搜索肽段质量容差设为4.5 ppm。
   1. 每条肽段允许的最大修饰数设为5。肽段谱图匹配（PSM）和蛋白质水平的错误发现率（FDR）均设为1%，最低肽段长度为7个残基。
   2. 设置以下可变修饰：甲硫氨酸氧化、蛋白质N端乙酰化、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。使用modificationSpecificPeptides文件分析搜索结果。
4. 确定在蛋白质、肽段及修饰位点水平上翻译后修饰（PTM）的鉴定数量。

结果

具有代表性的质谱数据，包括原始文件和搜索结果，已提交至 ProteomeXchange 联盟 通过 PRIDE 合作存储库，数据集标识符 PXD033065²².

在本研究中，对每次富集洗脱样本均进行了重复进样分析。最终分析汇总了来自两个技术重复样本的鉴定结果。由于数据依赖性采集在选择肽段前体进行串联质谱（MS/MS）碎裂时具有一定的半随机性，技术重复之间的鉴定结果重叠率预期约为70%–80%。在应用这些方法时，建议至少设置两个技术重复。对于后续的统计分析，应考虑不同实验条件下设置生物学重复。根据数据报告所需严格程度的不同，可设定相应的鉴定筛选条件，例如，仅报告在至少x个技术重复或生物学重复中被鉴定到的分子。

每次富集后各洗脱组分的总离子色谱图（TIC）示例可参见补充图S1、补充图S2和补充图S3。在对原始质谱文件进行数据库搜索时使用严格的筛选条件，可提高质谱/质谱（MS/MS...

讨论

双功能Ti(IV)金属螯合亲和色谱（IMAC）策略可用于同一样本中N-糖肽和磷酸化肽的同步分析，且仅需一次样品制备流程。基于亲水相互作用液相色谱-弱阴离子交换（ERLIC）的方法也被证明能够实现多种翻译后修饰（PTM）的同步富集。这两种策略此前均已用于实现对翻译后修饰的深度覆盖分析^14,18。通过采用自旋尖端（spin-tips）技术缩短双功能Ti方法的样品孵育时间，我们期望本实验方案能降低资源消耗，从而更易于被广泛采用。

通过分析物与富集材料表面功能基团之间的协同作用，可实现多种PTM的同时分析。首先在离心小柱中填装棉塞，由于纤维素表面富含羟基，从而增强了糖肽在HILIC模式下的保留²⁴。通过使用水和乙腈（一种与水互溶的溶剂），因形成水相与有机相层，糖肽得以保留并实现分离。双功能Ti(IV)富集材料依赖于固定化的Ti(IV)阳离子来结合磷酸化肽。材料侧链的亲水特性可用于在HILIC模式下保留糖肽，并首先使用酸性洗脱液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰醋酸（ACS认证级）	Fisher Scientific	A38S-500
丙酮（ACS认证级）	Fisher Scientific	A18-1
乙腈，Optima LC/MS级	Fisher Scientific	A955-4
醋酸铵（晶体/ACS认证级）	Fisher Scientific	A637-500
氢氧化铵（ACS Plus认证级）	Fisher Scientific	A669-212
Byonic软件	Protein Metrics	n/a	用于糖蛋白质组学分析的商业软件（https://proteinmetrics.com/byos/）
C18 BEH填料	Waters	186002353	从色谱柱中取出并用于填充纳米毛细管（拉制后集成喷嘴，可直接与仪器进样口连接使用）
CAE-Ti-IMAC，100%	J&K Scientific	2749380-1G	用于双功能Ti(IV)-IMAC；也可用于常规IMAC或常规磷酸化肽富集
Cellcrusher研磨试剂盒	Cellcrusher	n/a	用于在提取前将组织样品研磨成粉末
Eppendorf 5424R 微型离心机	Fisher Scientific	05-401-205	用于温控离心
cOmplete蛋白酶抑制剂混合片剂	Sigma	11697498001
DTT，分子生物学级（DL-二硫苏糖醇）	Promega	V3151	蛋白质还原剂
乙醇，200 proof（100%），USP级	Fisher	22-032-601
Fisherbrand 模拟涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-414
Fisherbrand 低吸附微型离心管（1.5 mL）	Fisher Scientific	02-681-320
Fisherbrand 低吸附微型离心管（2 mL）	Fisher Scientific	02-681-321
Fisherbrand Model 120 超声破碎仪	Fisher Scientific	FB120110	用于通过超声处理裂解样品
甲酸，99.0+%，Optima LC/MS级	Fisher Scientific	A117-50
熔融石英毛细管（内径75 μm，外径360 μm）	Polymicro Technologies LLC	100 m TSP075375	用于自制拉制和填充色谱柱，集成喷嘴
氢氟酸（48 wt. % 水溶液 H2O）	Sigma-Aldrich	339261-100ML	用于打开拉制毛细管柱的喷嘴
碘乙酰胺，BioUltra级	Sigma	I1149-5G	蛋白质烷基化试剂
MaxQuant软件	n/a	n/a	用于磷酸化蛋白质组学分析的免费软件（https://www.maxquant.org/）
带加热和冷却功能的多功能恒温振荡器	Benchmark Scientific	H5000-HC	加热模块
Oasis HLB 1 cc 真空萃取柱，每柱10 mg填料，30 µm，100支/包	Waters	186000383	用于胰蛋白酶消化产物的大规模脱盐（每根柱上样量约可达1 mg）
OMIX C18移液吸头，100 µL吸头，10–100 μL洗脱体积，96支/盒	Agilent	A57003100	用于富集洗脱物脱盐的小规模填充移液吸头
P-2000 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-2000/F	用于拉制用于LC-MS的纳米毛细管柱
PhosSTOP磷酸酶抑制剂片剂	Sigma	4906845001
Pierce BCA蛋白定量检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce 定量比色肽定量检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23275
PolySAX LP（12 μm，孔径300 Å）	PolyLC	BMSX1203	强阴离子交换色谱填料，用于ERLIC或常规糖肽富集
磷酸二氢钾（晶体/ACS认证级）	Fisher Scientific	P285-500
带集成磁力搅拌器的压力注入装置	Next Advance	PC77-MAG	用于在最高2500 psi压力下向纳米毛细管柱填充固定相
Proteome Discoverer软件	Thermo Fisher Scientific	n/a	用于蛋白质组学分析的商业软件（集成数据库搜索软件节点）及数据可视化（https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html）
SpeedVac SC110 真空浓缩仪 SC110-120型	Savant	n/a	用于在加热条件下通过离心真空浓缩干燥样品
SDS溶液，10%十二烷基硫酸钠溶液，分子生物学/电泳级	Fisher Scientific	BP2436200
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111
氯化钠（晶体/ACS认证级）	Fisher Scientific	S271-500
TopTip，空置，10–200 µL，96支/包	Glygen Corporation	TT2EMT.96	带微米级小孔的空移液吸头，可用于填充色谱材料以进行富集，配套提供管适配器
三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB，1 M，pH 8.5（挥发性））	Sigma	90360-100ML
三氟乙酸，试剂级，99%	Fisher Scientific	60-017-61
Tris碱（白色晶体或结晶粉末/分子生物学级）	Fisher Scientific	BP152-500
胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶混合物，质谱级	Promega	V5071
尿素（ACS认证级）	Fisher Scientific	U15-500
水，Optima LC/MS级	Fisher Scientific	W64