本实验方案描述了在实验室中饲养卷蛾科害虫的方法。利用两种卷蛾科害虫，建立了区分昆虫性别的步骤以及用于高通量测序的核酸提取方法。
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本文内容
摘要
摘要
卷蛾科（鳞翅目），通常被称为卷叶蛾或潜叶蛾，包含许多对农业和林业造成严重经济损失的害虫。为了深入了解这些害虫的生物学特性，迫切需要建立基础研究技术。本文以两种茶树卷叶蛾——茶卷蛾（Homona magnanima）和茶小卷蛾（Adoxophyes honmai）（鳞翅目：卷蛾科）为研究对象，建立了大规模饲养、形态观察及分子生物学研究的方法体系。通过切片人工饲料进行大规模饲养，并根据其生物学特性连续近交繁殖超过100代。卷蛾类昆虫具有多种性二型特征，因此在发育阶段难以准确鉴定性别，这限制了后续实验的开展。本研究指出，可通过直接观察睾丸或采用乳酸-醋酸地衣红染色法显示雌性特异的W染色体，从而确定卷蛾幼虫的性别。此外，利用该性别鉴定方法，本研究成功实现了从性别明确的胚胎中提取核酸，并应用于高通量测序。这些技术要点同样适用于其他害虫昆虫，将有助于推动更深入的形态学与遗传学研究。
引言
鳞翅目昆虫占所有已描述现存物种的10%以上1，其中某些类群的物种对植物造成严重危害，并导致重大的农业损失2,3。尽管已利用家蚕 Bombyx mori 等模式昆虫开展了分子与遗传学研究4,5，但害虫类昆虫的研究仍相对不足，部分原因在于其饲养与操作存在困难6,7。因此，开展基础性研究并建立相应技术手段，对于理解这些非模式害虫的生物学特性至关重要。
卷蛾科（Tortricidae）（鳞翅目），通常被称为卷叶蛾或叶卷蛾，包含许多农业和林业害虫8。在昆虫分类中，东方茶卷蛾Homona magnanima Diakonoff 和夏季果树卷蛾Adoxophyes honmai Yasuda 是东亚地区危害茶树的严重多食性害虫7。这两种昆虫产下扁平、椭圆形、鳞片状的卵块（或称卵团），卵块由薄而柔软且易碎的卵组成，并被母体分泌物覆盖。尽管胚胎发育阶段....
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方案
1. 昆虫采集与大规模饲养
- 按照已发表的参考文献8,12从田间采集卷蛾科昆虫。
注意： H. magnanima 和 A. honmai 幼虫从受损的茶叶上采集（图1A）；成虫则使用4 W便携式紫外灯（波长365 nm，参见材料表，图1B）诱集。 - 将采集的幼虫（图1C、D）单独饲养于1/2盎司的杯子中，每杯放置一块人工饲料，饲养2-3周直至羽化为成虫（图1E、F）。通过形态特征确认蛹和成虫的性别（图1G、I）。
- 将雌雄成虫放入一个塑料盒（30 cm × 20 cm × 5 cm）中交配，并在石蜡纸上产下卵块（图1J-L）。在一个120 mL....
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结果
寄主品系的建立与维持
野外采集的幼虫存活率受采集地点、季节和饲养条件的影响而有所不同（例如，根据Arai等人的研究12，中国台湾桃园地区的存活率可达90%）。通常情况下，约有30%至50%的个体配对后可成功繁殖下一代。对于H. magnanima和A. honmai，已通过近交方式维持母系品系超过100代。
形态学观察与性别鉴定
使用氢氧化钾（3 或 5 M KOH）或次氯酸钠（1.2% Cl2 或 NaClO）处理可将卵从其连结的卵块中分离（图2A）。较低浓度的试剂无法实现分离。所有固定、通透和染色步骤均能使细胞核被DAPI溶液清晰显示。仅用KOH或NaClO处理（已分离）但未进行固定和通透步骤的卵无法被这些染料染色7。未经处理的H. magnanima卵块未被染色。乳.......
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讨论
卷蛾科包含多种农业和林业害虫；本研究介绍了长期饲养卷蛾、观察其胚胎发育及昆虫性别，并利用成熟胚胎进行分子分析的方法。
害虫昆虫研究的障碍之一是建立人工饲养方法。特别是近交有时会对物种的适合度产生负面影响。这种由近交导致的适合度下降，称为近交衰退，在包括昆虫在内的多种动植物中均有广泛报道15,16,17,18。如前所述，H. magnanima 和 A. honmai 均已在实验室连续维持超过100代（超过10年），且未表现出明显的适合度代价。尽管这尚不足以全面评估其他卷蛾科昆虫是否也普遍具有较高的近交耐受性，但这两个物种可能已通过适应单调的环境条件（即茶园）以及应对多种内共生微生物（例如 Wolbachia11,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者希望感谢日本促进科学振兴会（JSPS）青年科学家研究奖学金项目的支持［资助编号 19J13123 和 21J00895］。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/2盎司杯 | FP CHUPA | CP070009 | 昆虫饲养；https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2盎司杯盖 | FP CHUPA | CP070011 | 昆虫饲养；https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7%乙酸 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | 固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | 未显示 | 核酸定量；https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1511 | 核酸定量；https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| 苯扎氯铵溶液 | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | 消毒；https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| 棉 | AOUME | 8-1611-02 | 昆虫饲养；https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI溶液 | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | 染色；https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| 磷酸氢二钠 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS定量试剂盒 | Invitrogen | Q33231 | 核酸定量；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II柱 | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA提取；http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| 乙醇 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | 固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| 乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸四钠盐四水合物（4NA） | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | 细胞裂解缓冲液（EDTA）；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| 玻璃纸 | HEIKO | 2100010 | 昆虫饲养；https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| 热块WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | 孵育；https://www.attoeng.site/ |
| 正庚烷 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | 固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | 未显示 | 人工饲料；https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA提取；https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| 异丙醇 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | 核酸提取；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| 乳酸 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | 染色；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| 甲醇 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | 固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500涡旋振荡器 | Biosan | BS-010210-TAK | 涡旋混合器；https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | 未显示 | 核酸定量；https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | 昆虫饲养；https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒（用于Illumina） | New England BioLabs | E7770S | 文库制备；https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| 地衣红 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | 染色；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| 多聚甲醛 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | 固定；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| 聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| 便携式紫外黑光灯（4W，365nm波长） | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | 未显示 | 昆虫采集；http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| 氯化钾 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| 磷酸二氢钾 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen, MA, USA | P36965 | 抗荧光淬灭；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| 蛋白酶K溶液 | Merck | 71049-4CN | DNA提取；https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| 蛋白质沉淀溶液 | Qiagen | 158912 | DNA提取；https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | 核酸定量；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| 利福平 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | 消毒；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS定量试剂盒 | Invitrogen | Q32855 | 核酸定量；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase溶液 | Nippon Gene | 313-01461 | RNA提取；https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | 未显示 | 人工饲料；https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| 氯化钠 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| 十二烷基硫酸钠 | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | 细胞裂解缓冲液（SDS）；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| 次氯酸钠水溶液 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | 卵分离；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| 盐酸四环素 | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | 消毒；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | 细胞裂解缓冲液；https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| 超纯蒸馏水 | Invitrogen | 10977023 | RNA提取；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
参考文献
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society<....
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