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方法文章

35 kDa 透明质酸对...的影响 体外 使用类肠体衍生的单层细胞建立早产小肠损伤与修复模型

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DOI：

10.3791/63758

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2022年7月28日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种在源自非人灵长类动物回肠类器官的二维（2D）单层细胞上建立并实施划痕伤口实验的方法。

摘要

体外划痕伤口实验常用于研究多种组织类型中上皮愈合的机制与特征。本文描述了一种从来源于回肠末端隐窝的三维（3D）非人灵长类肠类器官生成二维（2D）单层细胞的实验方案。这些由肠类器官衍生的单层细胞随后被用于体外划痕伤口实验，以检测35 kDa透明质酸（HA35）——一种模拟人乳中透明质酸的物质——促进上皮伤口边缘细胞迁移和增殖的能力。当单层细胞生长至完全融合后，通过人工方式制造划痕，并用HA35（50 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL）或对照（PBS）处理。使用配备活细胞成像功能的透射光显微镜对细胞向划痕区域迁移和增殖的过程进行成像。利用ImageJ软件中的“伤口愈合面积插件”（Wound Healing Size Plugin）将伤口闭合程度量化为伤口愈合百分比。 在24小时的时间内测量划痕区域、细胞迁移速率以及伤口闭合百分比。结果显示，HA35在体外可加速小肠肠类器官单层细胞的伤口愈合，其机制可能涉及伤口边缘的细胞增殖以及细胞向伤口区域的迁移。该方法有望作为研究早产儿小肠肠再生过程的模型。

引言

坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿最常见的胃肠道急症之一1。该病以严重的肠道炎症为特征，可迅速恶化为肠坏死、败血症，甚至死亡。尽管其病因尚不明确，但现有证据表明，NEC 是多因素共同作用的结果，涉及喂养方式、肠道菌群定植异常以及肠上皮发育不成熟之间的复杂相互作用2,3。早产儿存在肠黏膜通透性增高、肠道菌群定植异常以及肠上皮细胞再生能力低下4,5，这些因素增加了其发生肠道屏障功能障碍、细菌易位以及NEC的风险。因此，寻找能够促进肠上皮成熟、加速肠上皮再生或修复的策略或干预措施，对于预防这一致命性疾病至关重要。

研究表明，人乳（HM）对早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）具有保护作用6,7,8,9,10,11人类和动物研究均表明，以牛源成分为基础的配方奶粉会增加肠道通透性，并对肠上皮细胞具有直接毒性2,12尽管其机制尚未完全阐明，但有证据表明，母乳的保护作用是通过乳铁蛋白、分泌型免疫球蛋白A（IgA）以及母乳寡糖等生物活性成分介导的。13HM 还富含透明质酸（HA），这是一种独特的非硫酸化糖胺聚糖，由重复的 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰-D-葡萄糖胺二糖单元组成。14,15重要的是，我们已证明口服35 kDa透明质酸（HA35）——一种高分子量透明质酸的模拟物——, 减轻肠道损伤的严重程度，防止细菌移位，并降低小鼠类坏死性小肠结肠炎肠道损伤模型的死亡率16,17.

HA35 对肠道修复与再生的影响 体外 将进一步研究。目前，最广泛使用的 体外 肠道损伤与修复检测是一种在结直肠癌（CRC）细胞单层中进行的划痕损伤实验。该模型对于早产儿肠道的生理相关性有限，因为CRC细胞的损伤修复主要依赖于癌细胞的高度增殖特性，而非由干细胞驱动的修复过程18为克服这一局限性，本文介绍了一种二维肠类器官划痕损伤模型的建立方法，包括从早产非人灵长类动物（NHP）分离并维持原代干细胞来源的小肠肠类器官的操作步骤。鉴于早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）多发生于远端小肠，采用原代上皮细胞类器官构建肠道损伤与修复模型，可提供更具生理可转化性的研究体系 体外 与使用传统结肠直肠单层细胞模型的现有模型相比18,19.

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方案

本研究中的所有动物实验程序均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理与使用委员会批准。在获得机构批准后，通过另一项研究实施安乐死，获取了早产非人灵长类动物（NHP，妊娠90%，橄榄狒狒，Papio anubis）的胎儿小肠便利样本（方案编号 #101523-16-039-I）20。

1. 早产非人灵长类三维肠道类器官的建立

  1. 培养基制备
    注意：按照标准无菌操作技术，可在隐窝分离前最多1周预先制备培养基。如需要，可在原代细胞中使用青霉素/链霉素（终浓度1%）替代广谱抗生素。
    1. 通过将50 mL类器官生长培养基人基础培养基与50 mL类器官补充剂（材料表）混合，制备人源类器官生长培养基 + Y-27632（HOGMY）。加入200 µL广谱抗生素（终浓度100 µg/mL）（材料表）及Y-27632（终浓度10 µM）。在室温下放置于实验台使其回温至室温。
    2. 通过将50 mL类器官生长培养基人基础培养基与50 mL类器官补充剂混合，制备人源类器官生长培养基（HOGM）。加入200 µL广谱抗生素（100 µg/mL）。在室温下放置于实验台使其回温至室温。
      注意：传代后前2–3天之后更换培养基时将使用HOGM。
    3. 将100 mL不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冷却至冰上，使其保持冰冻状态。
    4. 通过将不含钙和镁的1×PBS与0.1%牛血清白蛋白（BSA）混合，制备50 mL洗涤缓冲液。将其冷却至冰上，保持冰冻状态。
    5. 通过向500 mL DMEM/F12（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物Ham F12 + 15 mM HEPES缓冲液）中加入1 mL广谱抗生素（100 µg/mL），制备DMEM-F12洗涤缓冲液。保持其冰冻状态。
  2. 隐窝分离与接种
    注意：基于细胞外基质（ECM）的水凝胶在整个操作过程中必须始终保持在冰上。本操作假设有足够组织用于接种六个基于ECM的水凝胶半球状结构。若收获的隐窝密度不同，应相应调整半球数量。
    1. 在2–8 °C条件下，将150 µL生长因子减少型（GFR）基底膜提取物（BME）（无酚红）在冰上过夜解冻。
    2. 使用前，将一块24孔平底组织培养级聚苯乙烯板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育至少30分钟。
    3. 在非人灵长类动物（NHP）安乐死后采集组织，用1,000 µL移液枪头在一次性培养皿中以冰冻1×PBS冲洗回肠段以去除碎片。
      注意：必须迅速采集新鲜组织并保持冰冻状态，以获得健康的肠类器官。
    4. 沿整个肠道纵向切开回肠，并用冰冻PBS洗涤3次。在含有15 mL冰冻PBS的50 mL锥形管上方，用无菌剪刀将组织剪成小片段（长约约2 mm），从最靠近管口的回肠段开始操作。
    5. 使用10 mL移液管通过上下吹打5–10次使隐窝解离。让组织片段沉降至管底，吸除上清液并替换为新鲜冰冻PBS。重复此过程至少7–10次，直至上清液澄清且无碎片。
    6. 上清液澄清后，吸除上清液，将隐窝重悬于25 mL细胞解离试剂中。将管子置于摇床上，室温下20 rpm振荡15分钟。
    7. 从摇床上取下管子，静置约30秒至1分钟使细胞沉降，吸除上清液。加入10 mL冰冻洗涤缓冲液。使用p1000移液器上下吹打，进一步解离为单个隐窝。
    8. 将组织通过70 µm细胞滤器过滤至新的50 mL锥形管中。用10 mL冰冻洗涤缓冲液冲洗原50 mL锥形管，并通过70 µm滤器过滤，以确保所有隐窝均已从原管中转移。重复此洗涤步骤，共进行4次冲洗。
    9. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，吸除上清液。加入600 µL HOGMY，用200 µL移液器上下吹打使沉淀充分解离。将管子置于冰上，直至溶液完全冰冻。
      注意：若溶液未充分冰冻，接种时半球结构将无法维持正常形态。在移取基于ECM的水凝胶半球时应避免引入气泡，因为气泡会阻碍其与培养板底部的正常贴附。
    10. 加入600 µL冰冻的基于ECM的水凝胶以重悬细胞沉淀，并用200 µL移液器充分混匀。
    11. 从培养箱中取出24孔板，置于37 °C预热板上。用移液器将50 µL冰冻HOGMY/基于ECM的水凝胶混合液加入24孔培养板24个孔的中央（每半球50 µL）。
    12. 接种后，将半球在37 °C预热板上静置1分钟，使其贴附至培养板底部。小心翻转培养板，确认板底无冷凝水积聚，然后将倒置的培养板放入37 °C、5% CO2培养箱中。
    13. 15分钟后，将培养板正放，向每孔加入750 µL室温HOGMY。
      注意：应缓慢将培养基沿孔壁加入，避免破坏新形成的3D基于ECM的水凝胶半球。
    14. 所有孔加完培养基后，将培养板放入培养箱，并每3天用750 µL HOGM更换一次培养基。每7–10天传代一次肠类器官。
  3. 肠类器官传代
    注意：以下方案适用于含NHP肠类器官、按1:2比例分传的一块24孔培养板。
    1. 从每孔中移除肠类器官培养基，注意不要破坏含有肠类器官的ECM半球，使用1,000 µL移液器向每孔加入500 µL冰冻细胞解离试剂，在室温下孵育1分钟。
    2. 通过上下吹打8–12次手动破坏ECM结构。将12个孔的内容物转移至一个15 mL锥形管中。
    3. 待24孔培养板中所有液体收集完毕后，向每孔加入250 µL细胞解离试剂，以确保所有NHP肠类器官均被清除，并将最后一次冲洗液加入已有的15 mL锥形管中。
    4. 在室温（20 °C）下置于摇床上40 rpm振荡15分钟。也可在室温下手动振荡试管15分钟。
    5. 15分钟后，在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。从15 mL管中吸除上清液，仅保留沉淀。
    6. 向一个15 mL锥形管中加入8 mL冰冻DMEM + 广谱抗生素，确保沉淀充分解离。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
    7. 加入600 µL HOGMY，用1,000 µL移液器上下吹打使沉淀解离。将管子置于冰上，直至溶液完全冰冻。待溶液冰冻后，加入600 µL冰冻ECM以重悬细胞沉淀，并用1,000 µL移液器充分混匀。对剩余12个孔重复步骤1.3.2.–1.3.7.。
      1. 后续步骤请参考步骤1.2.11.–1.2.16.。

2. 类器官单层的建立及划痕损伤实验

  1. 培养基与处理试剂的配制
    1. 将5 mL不含钙和镁的PBS冷却至冰浴温度。
    2. 通过向 DMEM-F12 中加入 1 mL 广谱抗生素来制备 DMEM-F12 洗涤缓冲液100 µg/mL) 加至 500 mL DMEM/F12（Dulbecco 改良 Eagle 培养基 / Ham 营养混合物 F12 + 15 mM HEPES 缓冲液）中。保持冰浴。
    3. 按照步骤1.1.1所述配制100 mL HOGMY，并在实验台面上将其升温至室温。
    4. 将25 mL的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）置于 37 °C 水浴锅
    5. 准备 50 µg/mL, 100 µg/mL，以及 200 µg/mL 使用无钙、无镁的无菌 PBS 作为溶剂，配制用于细胞处理的 HA35 浓度。HA35 的最终稀释将使用 HOMGY 作为溶剂。
      注意：HA35 的制备可能需要进行多次稀释，因为 HA35 常在浓度高于 5 mg/mL 时从溶液中析出。
  2. 类肠器官单层形成
    注意：以下步骤提供的体积足以制备一块24孔板的肠类器官单层。请根据所需单层数量调整体积。
    1. 解冻 96 µL 在冰上用不含酚红的基于细胞外基质的水凝胶 BME 过夜孵育，温度为 2-8 °C将基于ECM的水凝胶用冰冷的不含钙和镁的PBS按1:50的比例稀释。用该稀释液包被24孔组织培养板的每个孔 200 µL 冰冻稀释的ECM基水凝胶。
    2. 将包被有基于ECM的水凝胶的培养板在室温下孵育至少1小时 37 °C 和5% CO2吸弃含有拟用于单层培养的3D肠类器官的24孔培养板中的培养基，并更换为 500 µL 每孔细胞解离试剂
    3. 使用移液器上下吹打8至12次，手动破坏基于ECM的水凝胶穹顶结构，并将12个孔中的内容物转移至15 mL锥形管中。
    4. 洗涤12个空孔 250 µL 加入细胞解离试剂，确保所有类肠体均已被去除，并将内容物转移至15 mL锥形管中。使用第二个15 mL锥形管，对剩余的12个孔重复步骤2.2.5和步骤2.2.6。
    5. 将锥形管在 300 x g 5 分钟 4 °C 弃去上清液。向15 mL圆底管中加入10 mL预冷的DMEM-F12洗涤缓冲液，通过反复倒置试管重悬类肠体沉淀。在300 x g 5 分钟 4 °C.
    6. 去除上清液，将细胞沉淀重悬于 12 mL 的 37 °C 胰蛋白酶-EDTA。将试管置于 37 °C 37℃水浴10分钟，或直至细胞呈现溶解状态。向每支试管中加入3 mL DMEM-F12洗涤缓冲液以稀释胰蛋白酶-EDTA，通过反复倒置混匀，然后置于冰上。
    7. 通过一个滤器过滤解离后的肠类器官 37 µM 细胞滤网，将滤过物收集至洁净的15 mL离心管中。以300 x g 5 分钟 4 °C.
    8. 在细胞离心过程中，从培养箱中取出经ECM基质水凝胶包被的培养板，吸除多余的ECM基质水凝胶溶液，注意勿刮伤包被表面，且不可让培养板完全干燥。
    9. 从锥形管中移除上清液，并用 6 mL HOMGY 重悬细胞沉淀。添加 500 µL 将总共12 mL HOMGY细胞悬液分别加入已包被基于ECM的水凝胶的24孔板的每个孔中，接种密度约为3 x 105 每孔细胞数。盖上培养板盖，轻轻摇晃以确保孔内细胞分布均匀。
    10. 将培养板在指定条件下孵育 37 °C 和5% CO₂2, 每2天更换一次HOMGY培养基，直至单层细胞达到 >90% 汇合度。
  3. 单层细胞处理与划痕伤口实验
    1. 一旦单层细胞达到 >90% 汇合度时，吸除培养基以去除未贴壁的细胞。用以下处理细胞： 500 µL HA35 的50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL）或 PBS，溶于 HOMGY 中，处理 24 小时。
    2. 24小时后，移除培养基，注意不要破坏单层细胞的表面。使用 200 µL 移液枪吸头，在每个孔的单层细胞表面直径方向上划出一条直线划痕，注意避免单层细胞干燥。
    3. 用预冷的 PBS 轻柔洗涤划痕单层细胞 1 次 500 µL 1× PBS。加入 500 µL HA35 的50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL）或溶于HOMGY的PBS，并将培养板转移至活细胞分析仪（材料清单）内 37 °C 和5% CO2 培养箱
    4. 在……之下 时间安排 活细胞分析软件中的图标材料清单），点击 启动添加新容器向导 图标并设置扫描频率以按计划进行扫描。创建一个新的 整孔 容器下方 扫描类型，指定扫描设置（即 相 用于 图像通道 和 4x 用于 目标），然后点击 下一步.
    5. 从提供的列表中选择培养板的生产厂家和目录号。在下方 时间安排 图标，选择培养板在活细胞分析仪器中的放置位置处的加号。选择所需的 扫描模式，然后通过选择“+在 板布局 页。选择 延迟分析至后续阶段，然后设置 扫描时间表 每4小时一次，共24小时，并在 血管向导摘要 页。最后，选择 添加到日程.
    6. 24孔板检测完成后，根据 查看图标，双击 船名，并导出图像和视频。选择特定孔及一系列图像，以 JPEG 格式显示并导出。使用 ImageJ 的 Wound Healing Size 插件分析图像，计算伤口愈合百分比。21，按照下文第 2.4 步操作。
  4. 划痕伤口分析
    1. 打开 ImageJ 软件。上传划痕伤口实验图像（.TIFF 或 .JPG 格式）。
    2. 选择 图像 > 类型 > 8位 将图像从 24 位 RGB 转换为 8 位。通过选择安装“伤口愈合面积插件” 插件 > 宏 > 安装 > 伤口愈合面积插件.
    3. 旋转图像使划痕呈垂直状态，并初始化“伤口愈合面积测量工具”插件。
    4. 在对话框中选择插件参数，以最适配划痕伤口的形态。设置伤口愈合尺寸选项的参数值如下： 方差窗口半径 在 20, 阈值 值在 100，以及 饱和像素百分比 在 0.001， 并选择 是 用于 全局设置比例尺. 通过点击完成选择 好的 按钮。确认所选区域是否为伤口区域。上述参数可能需要根据不同实验室进行标准化调整。
    5. 对每个划痕的其余时间点重复步骤 2.4.2–2.4.4。
    6. 按照以下方法计算迁移或增殖细胞在24 h内的划痕区域愈合百分比：
      % 伤口愈合 = 温度变化计算公式，\(\frac{(T_0-T_C)}{T_0} \times 100\)，数学方程。
      其中 T0 = 0 小时时的面积百分比 Tc = 0 小时、4 小时、12 小时或 24 小时时的面积百分比。

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结果

透明质酸（HA）对多种组织和器官的组织修复及伤口愈合作用已有充分文献记载；然而，分子量为35 kDa的HA对胎儿或新生儿小肠愈合与再生的具体作用目前尚不清楚。为了检验HA35在胎儿或新生儿小肠模型中促进伤口愈合的能力，我们从小肠猕猴回肠组织中生成了三维肠道类器官，并进一步将该组织解离为单细胞，以构建二维类器官来源的单层细胞（图1A，B）。单层细胞培养至融合状态后，使用P200移液器吸头进行人工划痕（图1B，C）。随后，将单层细胞用HA35（50 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL）或对照（PBS）处理。利用配备活细胞成像功能的透射光显微镜，每4小时对细胞迁移和增殖进入划痕区域的情况进行成像，持续24小时22。采用ImageJ软件结合“伤口愈合面积插件”21量化伤口闭合速率（即细胞迁移速度），以百分比形式表示伤口愈合程度（

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讨论

早产儿的胃肠道因反复暴露于与生态失衡、促炎性细菌代谢产物和毒素以及间歇性缺氧相关的环境损伤因素而持续承受再生压力23,24。不幸的是，早产儿的肠上皮无法迅速建立功能性完整性23，导致屏障功能障碍、肠道通透性增加，严重时可引发广泛的肠道炎症及坏死性小肠结肠炎（NEC）的发生。

糖胺聚糖（GAGs）是一类在人乳中广泛存在的多糖，可能是具有生物活性的保护性因子，可抵御坏死性小肠结肠炎（NEC）的发生15,16透明质酸（HA）是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖重复二糖单元组成的线性聚合物。25,26 由透明质酸合酶合成。透明质酸（HA）的促炎或抗炎特性取决于其分子大小及所处的组织微环境

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。HC 获得美国国立卫生研究院资助项目 P20GM134973 的支持。KB 获得儿童医院基金会（CHF）和长老会健康基金会（PHF）资助项目的支持。由癌症功能基因组学核心提供的活细胞成像服务部分获得美国国立普通医学科学研究所资助项目 P20GM103639 和美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助项目 P30CA225520 的支持，上述资助授予俄克拉荷马大学健康科学中心斯蒂芬森癌症中心。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液管Fisher Scientific13-675-49
100x21 mm 培养皿，Nunclon DeltaThermoFisher Scientific172931
15 mL 圆底离心管VWR89039-666
24 孔，组织培养处理，平底板Corning3524
37 µm 可逆细胞滤网STEMCELL Technologies27215
50 mL 圆底离心管VWR89039-658
70 µm 无菌细胞滤网Fisher ScientificFB22-363-548
牛血清白蛋白（BSA）VWR0332-100G
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒PromegaG9681
含 15 mM HEPES 缓冲液的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 Ham F-12（DMEM-F12）STEMCELL Technologies36254
温和细胞解离试剂STEMCELL Technologies100-0485
ImageJNIHimagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 活细胞分析仪Sartorius4647
Incucyte 划痕伤口分析软件模块Sartorius9600-0012
IntestiCult 类器官生长培养基（人源）STEMCELL Technologies06010此即 HOGMY，但不含 Y-27632 或抗生素。也可作为 HOGM 的基础成分，此时仅缺少抗生素。
经凝胶过滤层析纯化的来自大肠杆菌 O111:B4 的脂多糖Millipore SigmaL3012-10MG
生长因子减少型 Matrigel 基底膜基质（GFR），无酚红Corning356231
Nunc MicroWell 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板ThermoFisher Scientific136101
PBS（磷酸盐缓冲盐水），1X，不含钙、镁，pH 7.4Corning21-040-CM
PrimocinInvivogenant-pm-1这是一种广谱抗生素
透明质酸钠，研究级，HA20KLifecore BiomedicalHA20K-1
TC20 自动细胞计数仪Company: Bio-Rad1450102
胰蛋白酶-EDTA 1X，0.25% 胰蛋白酶Fisher ScientificMT25053CI
Y-27632STEMCELL Technologies72302

参考文献

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35 kDa 透明质酸对...的影响 体外 使用类肠体衍生的单层细胞建立早产小肠损伤与修复模型
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