本方案描述了一种在源自非人灵长类动物回肠类器官的二维（2D）单层细胞上建立并实施划痕伤口实验的方法。
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方法文章
35 kDa 透明质酸对...的影响 体外 使用类肠体衍生的单层细胞建立早产小肠损伤与修复模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
体外划痕伤口实验常用于研究多种组织类型中上皮愈合的机制与特征。本文描述了一种从来源于回肠末端隐窝的三维（3D）非人灵长类肠类器官生成二维（2D）单层细胞的实验方案。这些由肠类器官衍生的单层细胞随后被用于体外划痕伤口实验，以检测35 kDa透明质酸（HA35）——一种模拟人乳中透明质酸的物质——促进上皮伤口边缘细胞迁移和增殖的能力。当单层细胞生长至完全融合后，通过人工方式制造划痕，并用HA35（50 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL）或对照（PBS）处理。使用配备活细胞成像功能的透射光显微镜对细胞向划痕区域迁移和增殖的过程进行成像。利用ImageJ软件中的“伤口愈合面积插件”（Wound Healing Size Plugin）将伤口闭合程度量化为伤口愈合百分比。 在24小时的时间内测量划痕区域、细胞迁移速率以及伤口闭合百分比。结果显示，HA35在体外可加速小肠肠类器官单层细胞的伤口愈合，其机制可能涉及伤口边缘的细胞增殖以及细胞向伤口区域的迁移。该方法有望作为研究早产儿小肠肠再生过程的模型。
引言
坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿最常见的胃肠道急症之一1。该病以严重的肠道炎症为特征，可迅速恶化为肠坏死、败血症，甚至死亡。尽管其病因尚不明确，但现有证据表明，NEC 是多因素共同作用的结果，涉及喂养方式、肠道菌群定植异常以及肠上皮发育不成熟之间的复杂相互作用2,3。早产儿存在肠黏膜通透性增高、肠道菌群定植异常以及肠上皮细胞再生能力低下4,5，这些因素增加了其发生肠道屏障功能障碍、细菌易位以及NEC的风险。因此，寻找能够促进肠上皮成熟、加速肠上皮再生或修复的策略或干预措施，对于预防这一致命性疾病至关重要。
研究表明，人乳（HM）对早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）具有保护作用6,7,8,9,10,11人类和....
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方案
本研究中的所有动物实验程序均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理与使用委员会批准。在获得机构批准后，通过另一项研究实施安乐死，获取了早产非人灵长类动物（NHP，妊娠90%，橄榄狒狒，Papio anubis）的胎儿小肠便利样本（方案编号 #101523-16-039-I）20。
1. 早产非人灵长类三维肠道类器官的建立
- 培养基制备
注意：按照标准无菌操作技术，可在隐窝分离前最多1周预先制备培养基。如需要，可在原代细胞中使用青霉素/链霉素（终浓度1%）替代广谱抗生素。- 通过将50 mL类器官生长培养基人基础培养基与50 mL类器官补充剂（材料表）混合，制备人源类器官生长培养基 + Y-27632（HOGMY）。加入200 µL广谱抗生素（终浓度100 µg/mL）（材料表）及Y-27632（终浓度10 µM）。在室温下放置于实验台使其回温至室温。
- 通过将50 mL类器官生长培养基人基础培养基与50 mL类器官补充剂混合，制备人源类器官生长培养基（HOGM）。加入200 µL广谱抗生素（100 µg/mL）。在室温下放置于实验台使其回温至室温。
注意：传代后前2–3天之后更换培养基时将使用HOGM。
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结果
透明质酸（HA）对多种组织和器官的组织修复及伤口愈合作用已有充分文献记载；然而，分子量为35 kDa的HA对胎儿或新生儿小肠愈合与再生的具体作用目前尚不清楚。为了检验HA35在胎儿或新生儿小肠模型中促进伤口愈合的能力，我们从小肠猕猴回肠组织中生成了三维肠道类器官，并进一步将该组织解离为单细胞，以构建二维类器官来源的单层细胞（图1A，B）。单层细胞培养至融合状态后，使用P200移液器吸头进行人工划痕（图1B，C）。随后，将单层细胞用HA35（50 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL）或对照（PBS）处理。利用配备活细胞成像功能的透射光显微镜，每4小时对细胞迁移和增殖进入划痕区域的情况进行成像，持续24小时22。采用ImageJ软件结合“伤口愈合面积插件”21量化伤口闭合速率（即细胞迁移速度），以百分比形式表示伤口愈合程度（
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讨论
早产儿的胃肠道因反复暴露于与生态失衡、促炎性细菌代谢产物和毒素以及间歇性缺氧相关的环境损伤因素而持续承受再生压力23,24。不幸的是，早产儿的肠上皮无法迅速建立功能性完整性23，导致屏障功能障碍、肠道通透性增加，严重时可引发广泛的肠道炎症及坏死性小肠结肠炎（NEC）的发生。
糖胺聚糖（GAGs）是一类在人乳中广泛存在的多糖，可能是具有生物活性的保护性因子，可抵御坏死性小肠结肠炎（NEC）的发生15,16透明质酸（HA）是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖重复二糖单元组成的线性聚合物。25,26 由透明质酸合酶合成。透明质酸（HA）的促炎或抗炎特性取决于其分子大小及所处的组织微环境
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。HC 获得美国国立卫生研究院资助项目 P20GM134973 的支持。KB 获得儿童医院基金会（CHF）和长老会健康基金会（PHF）资助项目的支持。由癌症功能基因组学核心提供的活细胞成像服务部分获得美国国立普通医学科学研究所资助项目 P20GM103639 和美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助项目 P30CA225520 的支持，上述资助授予俄克拉荷马大学健康科学中心斯蒂芬森癌症中心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21 mm 培养皿，Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL 圆底离心管 | VWR | 89039-666 | |
| 24 孔，组织培养处理，平底板 | Corning | 3524 | |
| 37 µm 可逆细胞滤网 | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL 圆底离心管 | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm 无菌细胞滤网 | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9681 | |
| 含 15 mM HEPES 缓冲液的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 Ham F-12（DMEM-F12） | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| 温和细胞解离试剂 | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 活细胞分析仪 | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte 划痕伤口分析软件模块 | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult 类器官生长培养基（人源） | STEMCELL Technologies | 06010 | 此即 HOGMY，但不含 Y-27632 或抗生素。也可作为 HOGM 的基础成分，此时仅缺少抗生素。 |
| 经凝胶过滤层析纯化的来自大肠杆菌 O111:B4 的脂多糖 | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| 生长因子减少型 Matrigel 基底膜基质（GFR），无酚红 | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板 | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水），1X，不含钙、镁，pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 这是一种广谱抗生素 |
| 透明质酸钠，研究级，HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 自动细胞计数仪 | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 1X，0.25% 胰蛋白酶 | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
参考文献
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H.
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