研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的体外相互作用。本方案描述了从人包皮中分离、培养和鉴定这些原代细胞的方法。
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摘要
摘要
本方案描述了利用快速酶解法从人皮肤中高效分离、培养和鉴定高产量、高活性的人原代细胞的方法。原代角质形成细胞、成纤维细胞和施万细胞均取自新生儿包皮组织，该组织可在标准医疗程序后获得。切除的皮肤经消毒后，使用手术刀去除皮下脂肪和肌肉组织。本方法包括通过酶解和机械分离将表皮与真皮层分开，随后分别对各皮肤层进行额外的酶消化处理，以获得单细胞悬液。最终，将单细胞按照标准细胞培养流程接种于相应的细胞培养基中，以维持其数周内的生长与活性。综上，该简易方案可从单份皮肤样本中同时分离、培养和鉴定上述三种细胞类型，用于 体外 皮肤-神经模型的评估。此外，这些细胞还可用于共培养，以评估它们之间的相互作用及其对彼此的响应 体外 以机器人方式在培养物中制造划痕，模拟创伤以研究伤口愈合。
引言
从活体组织中分离并在体外培养的原代细胞 体外 条件与生理状态高度相似1，使其成为研究生理和病理生理过程的理想模型。皮肤包含多种细胞类型，如角质形成细胞、成纤维细胞、皮脂细胞、黑色素细胞和施万细胞（SCs），这些细胞可被分离并进行培养 体外 实验。目前尚未有报道从一块皮肤组织中同时分离和培养角质形成细胞、成纤维细胞和干细胞的方法。本实验方案的目标有两个：1）建立一种可靠且可重复的真皮干细胞分离与培养方法；2）采用一种高效且稳健的方法，从一份人包皮组织中同时分离角质形成细胞、成纤维细胞和干细胞。
目前已有成熟的方案用于分离皮肤角质形成细胞2,3,4 和成纤维细胞5,6这些研究描述了从皮肤中分离角质形成细胞、成纤维细胞或两者的方法，但尚无方案涉及如何从人皮肤建立原代施万细胞（SCs）的培养。近期研究表明，神经源性施万细胞可调节角质形成细胞和成纤维细胞的细胞活动，并调控皮肤正常的生理功能7因此，SCs 对皮肤稳态至关重要，并在很大程度上参与调控影响邻近皮....
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方案
获取和使用去标识化的人包皮组织用于科研目的，已由宾夕法尼亚州立医学院机构审查委员会（IRB #17574）审核，并被认定为"不属于人类研究"。
注意：按照以下方案，可从一份包皮组织中获得 2.4 × 106 个角质形成细胞、4.4 × 106 个成纤维细胞和 1.1 × 106 个干细胞。通常情况下，这些原代细胞可根据实验条件使用 3 代。
1. 原代细胞的分离与培养条件
- 表皮与真皮分离步骤
- 由医生在经批准的医院监管规程下，按照标准护理程序获取新生儿包皮组织。医生决定出生后包皮环切的时机以及切除皮肤的范围。
- 将切除的包皮组织放入含有 8–10 mL 冰冷的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）基础培养基的微量离心管中，并立即运送至细胞培养实验室进行细胞分离。用含 1× 抗生素/抗真菌剂的 1× 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗皮肤组织两次，每次 20–25 mL。
注意：为获得最大细胞活性，切除的包皮组织应在处理前置于 4 °C 保存，且细胞应在 24 小时内完成收获。 - 在 DPBS/抗生素中冲洗后，将包皮组织置于 10 cm 组织培养皿中，加入 25–30 mL 冰冷的 DMEM 基础培养基，浸泡 10–....
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结果
采用正常的新生儿包皮组织分离原代表皮角质形成细胞以及真皮干细胞（SCs）和成纤维细胞。分离得到的原代细胞在含有生长因子的相应细胞培养基中进行培养。将干细胞和成纤维细胞接种至培养瓶后，大多数细胞在2小时内即贴附于瓶底。对于角质形成细胞，大多数细胞在24小时内完成贴附。分离的原代表皮角质形成细胞在培养第7天达到约85%的融合度，并呈现典型的细胞形态（鹅卵石样形状）（图1A）。干细胞在第5天达到95%的融合度，细胞形态呈双极或三极状（图1B）。成纤维细胞培养物在第4天达到95%的融合度，大多数细胞呈现纺锤形形态（图1C）。通过免疫荧光染色证实了这些培养细胞中细胞类型特异性蛋白的表达。角质形成细胞对K10（分化标志物）和K14（增殖标志物）蛋白呈阳性反应（图2A）；类似地，干细胞对S100和p75-NTR呈阳性反应（图2C）。成纤维细胞表达波形蛋白（.......
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讨论
本方案描述了一种从单一片段包皮组织中分离三种不同细胞群体的方法，即角质形成细胞、成纤维细胞和施万细胞。目前已有若干种用于分离角质形成细胞和成纤维细胞的方案2,3,5,6，但尚无任何方案描述施万细胞的分离。皮肤除了含有主要的结构细胞——角质形成细胞和成纤维细胞外，还富含感觉传入神经结构和自主传出神经纤维。感觉传入神经在传递轻触、振动、疼痛、瘙痒以及冷热感觉方面发挥重要作用。自主传出神经则支配汗腺和立毛肌9。每条神经轴突均被施万细胞（SC）所包裹，施万细胞是周围神经系统中的胶质细胞。随着施万细胞在支持轴突再生方面的潜力被不断揭示，其在科研和临床上的关注度显著上升10,11。皮肤神经还通过向非神经细胞传递信号（神经调节物质/神.......
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披露
其余所有作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 Fadia Kamal 博士和 Reyad Elbarbary 博士允许我们使用实验室仪器并提供技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号：K08 AR060164-01A）和美国国防部（DOD，项目号：W81XWH-16-1-0725）向 J. C. E. 提供的资助，以及宾夕法尼亚州立大学赫尔希医学中心的机构支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µM 无菌滤器（Millex-GP 注射器滤器单元，聚醚砜） | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM 细胞筛 | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM 细胞筛 | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL 一次性注射器 | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL 一次性注射器（无菌，单次使用） | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL 一次性注射器 | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | 使用时配制 |
| 4% 多聚甲醛溶液 | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | 即用型，4 °C 保存 |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | 使用时配制 |
| 70% 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| 抗生素 | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-盒式卡匣 | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| 胶原酶 | Gibco | 17018-029 | |
| 盖玻片 | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM 基础培养基 | ScienCell Research | 9221 | |
| 无钙2+ 和镁2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| 成纤维细胞完全培养基 | ScienCell Research | 2331 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 稀释比例（1:500） |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 稀释比例（1:500） |
| Hanks 平衡盐溶液（HBSS 缓冲液） | Lonza | CC-5022 | |
| 人包皮组织 | 用于科研的去标识化人包皮组织（机构审查委员会 IRB #17574） | ||
| KGM-GOLD 角质形成细胞培养基（KGM gold 及补充剂） | Lonza | 00192151 和 00192152 | |
| 小鼠 α-平滑肌肌动蛋白抗体 | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | 稀释比例（1:200） |
| 小鼠细胞角蛋白14抗体 | Abcam | ab7800 | 稀释比例（1:100） |
| 小鼠 S100 抗体 | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | 稀释比例（1:200） |
| 多孔腔室载玻片（4 孔玻璃载片） | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-盒式卡匣 | Chemometec | 941-0012 | |
| 多聚-L-赖氨酸（PLL） | ScienCell Research | 32503 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36935 | |
| 兔 K10 抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | 稀释比例（1:100） |
| 兔 p75-NTR 抗体 | Millipore | AB1554 | 稀释比例（1:500） |
| 兔波形蛋白抗体 | ProteinTech | 10366-1-AP | 稀释比例（1:200） |
| 施万细胞培养基 | ScienCell Research | 1701 | |
| 精密镊子 DUMONT 直头超细尖 Dumostar，5 号 | ROTH | LH75.1 | 使用前用 70% 乙醇灭菌 |
| IRIS 剪刀，尖头/尖头，长度 4–3/8"（111 mm） | Codman | 54-6500 | 使用前用 70% 乙醇灭菌 |
| 灭菌外科刀片（Duro Edge 经济型单边刀片） | Razor blade company | 94-0120 | 使用前用 70% 乙醇灭菌 |
| T25 培养瓶 | Corning | 353109 | |
| 胰酶中和缓冲液（TNS） | Lonza | CC-5002 | |
| 胰酶/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| 倒置显微镜 | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 显微镜 | 用于含染色细胞的腔室载玻片的免疫荧光观察 |
| 倒置显微镜 | ZEISS | Primovert | 用于观察细胞贴壁或脱落情况 |
参考文献
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J.
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