从人包皮中分离、培养和表征原代施旺细胞、角质形成细胞和成纤维细胞

Summary

研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的 体外 相互作用。该协议描述了从人包皮中分离，培养和表征这些原代细胞。

Abstract

该协议描述了分离方法，培养条件以及使用皮肤的快速酶解离具有高产量和活力的人类原代细胞的表征。原代角质形成细胞、成纤维细胞和施万细胞都是从人类新生儿包皮中采集的，可按照标准护理程序获得。去除的皮肤被消毒，皮下脂肪和肌肉被用手术刀去除。该方法包括表皮和真皮层的酶促和机械分离，然后进行额外的酶消化，以从这些皮肤层中的每一层获得单细胞悬浮液。最后，按照标准的细胞培养方案在适当的细胞培养基中培养单细胞，以在几周内保持生长和活力。总之，这种简单的方案允许从一块皮肤中分离，培养和表征所有三种细胞类型，以进行皮肤 - 神经模型的 体外 评估。此外，这些细胞可以在共培养物中一起使用，以测量它们对彼此的影响以及它们对 体外 创伤的反应，其形式是在与伤口愈合相关的培养物中机器人进行的划痕。

Introduction

衍生自活组织并在 体外 条件下培养的原代细胞与生理状态¹非常相似，使其成为研究生理和病理生理过程的理想模型。皮肤含有多种细胞类型，包括角质形成细胞，成纤维细胞，皮脂细胞，黑素细胞和施万细胞（SC），可以分离和培养用于 体外 实验。尚未描述从单块皮肤中分离和培养角质形成细胞、成纤维细胞和 SC 的方法。该协议的目标是双重的:1）建立一种可靠且可重复的真皮SC分离和培养的方法，以及2）使用一种有效，稳健的方法从单个人包皮中分离角质形成细胞，成纤维细胞和SC。

目前，已有分离皮肤角质形成细胞^2，3，⁴和成纤维细胞^5，6的既定方案。这些研究描述了从皮肤中分离角质形成细胞，成纤维细胞或两者，但没有方案解决如何从人类皮肤建立原代SC的培养物。最近的研究表明，神经元SCs调节角质形成细胞和成纤维细胞过程并调节正常的皮肤生理功能⁷。因此，SC对皮肤稳态至关重要，并且对影响相邻皮肤细胞类型行为的调节生理学有重大贡献⁸。因此，允许分离每种细胞类型的方案非常适合涉及细胞 - 细胞间通信或细胞类型之间串扰的体外实验。

该协议描述了从单个皮肤建立原代细胞的单个细胞培养物。当可用组织量有限时，该方案特别有用。此外，从单个供体中分离所有三种细胞类型可以在细胞类型或共培养实验之间进行强有力的比较，同时减轻所需实验期间遗传学的影响。

Protocol

出于研究目的的去识别化人类包皮组织的获取和使用进行了审查，并获得了宾夕法尼亚州立大学医学院机构审查委员会（IRB #17574）确定的"非人类研究"。

注意:通过遵循以下方案，从单个包皮中获得2.4 x 10⁶ 角质形成细胞，4.4 x 10⁶ 成纤维细胞和1.1 x 10⁶ SC。通常，这些原代细胞可用于3次传代，具体取决于实验条件。

1. 原代细胞的分离和培养条件

1. 表皮和真皮分离程序
   1. 按照医生根据批准的医院监管协议进行的标准护理程序获取新生儿包皮。医生确定出生后包皮环切术的时间和去除的皮肤量。
   2. 将切除的包皮放入含有8-10 mL冰冷Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）基础培养基的微量离心管中，并立即将包皮运送到细胞培养实验室进行细胞分离。用 20-25 mL 含有 1x 抗生素/抗真菌剂的 1x Dulbecco 磷酸盐水 （DPBS） 冲洗皮肤两次。
      注意:为了获得最大的细胞活力，切除的包皮应置于4°C直至处理，并且应在24小时内收获细胞。
   3. 在DPBS /抗生素中冲洗后，将包皮浸泡在25-30mL冰冷的DMEM基础培养基中，在10cm组织培养皿中浸泡10-15分钟。使用无菌技术在组织培养罩中执行所有处理步骤。
   4. 使用手术刀小心地将包皮切开，露出真皮和皮下脂肪组织。
   5. 根据需要使用镊子、手术刀刀片和剪刀切除皮下脂肪组织。丢弃脂肪组织。将清洁的包皮切成三到五块较小的块。
   6. 将皮片转移到含有16-20 mL分散酶I / DMEM培养基（DMEM基础培养基中为4 mg / mL）的无菌锥形管中。
   7. 在用dispase-I孵育的前30分钟内，通过倒置间歇性地混合锥形管中的皮肤碎片。然后将锥形管在4°C下放置16-18小时，注意将皮片浸入分散酶I /培养基中。
      注意:分散酶-I溶液应在加入之前使用冷的DMEM基础培养基制备，用0.22μm过滤器过滤，并保持在4°C。
   8. 用dispase-I消化过夜后，取出皮块并将其放在干燥，无菌的培养皿上。展开每块皮肤，使外表皮层接触到培养皿。
   9. 使用两组镊子，小心地将表皮与真皮分开。从组织边缘开始，将表皮从真皮上剥离。
      注意:如果表皮层难以与真皮分离，则分散酶I消化是不够的。故障排除选项:1）将皮片返回到分散酶I / DMEM溶液中，并在4°C下再孵育2-3小时;2）将皮片置于新鲜的分散酶I / DMEM中，并在4°C下孵育2-3小时。
   10. 使用分离的表皮和真皮分离角质形成细胞（表皮）和成纤维细胞以及施万细胞（真皮）。
       注意:对于特定的细胞类型分离和培养条件，请按照以下步骤操作。
2. 从表皮中分离角质形成细胞
   1. 向10cm培养皿中加入5mLHEPES缓冲盐水（HBS），并加入分离的表皮片段。在室温（RT）下孵育10分钟。
   2. HBS孵育后，将HBS溶液收集在50mL锥形管中。在50mL锥形管中加入5mL胰蛋白酶中和缓冲液（TNB）（材料表）并放在一边。
   3. 向表皮碎片中加入3mL胰蛋白酶溶液。在37°C下孵育10分钟。
   4. 使用镊子轻轻搅拌表皮碎片，直到胰蛋白酶溶液变得浑浊。
   5. 在步骤1.2.2中将胰蛋白酶溶液/角质形成细胞加入含HBS和TNB的管中。
   6. 对于在初始胰蛋白酶消化中未溶解的任何剩余表皮片段，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。在37°C下孵育10分钟，重复步骤1.2.4和1.2.5。
   7. 将 2 mL 胎牛血清 （FBS） 加入含有 HBS 和 TNB 溶液管的胰蛋白酶/EDTA 溶液中。
   8. 在4°C下以870× g 离心含有HBS / TNB / 胰蛋白酶和角质形成细胞的收集管5分钟。
   9. 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于3mL角质形成细胞完全生长培养基中（材料表）。
   10. 用无菌的100μM过滤器将细胞悬浮液过滤到无菌的50mL锥形管中以除去碎屑。
   11. 量化细胞数量和细胞活力。
       注意:在这里，使用专门的细胞采样和染色设备（材料表）按照制造商的说明量化细胞数量和活力。
   12. 根据实验需要的种子培养板。推荐的接种密度约为45，000个细胞^{/平方厘米}。
   13. 将培养板置于37°C的培养箱中，在5%CO₂ 中放置2天，以使角质形成细胞粘附在培养皿上。
   14. 2天后，吸出任何未粘附的细胞。每隔一天刷新细胞培养基，直到角质形成细胞达到传代或下游实验所需的汇合处（50%-80%汇合）。
3. 从真皮中分离施万细胞（SCs）和成纤维细胞
   1. 使用5 mL 1x DPBS用聚-L-赖氨酸（PLL，0.01μg/ μL）预涂覆T25烧瓶。将预涂有盖的烧瓶在37°C下放置3小时。使用 1x DPBS （5 mL） 洗涤 PLL 涂层基质两次。
      注意:T25烧瓶可以提前准备。
   2. 用5 mL DMEM基础培养基冲洗分离的真皮碎片。
   3. 用剪刀或手术刀将真皮切成小块。
   4. 在37°C下用5mL胶原酶（DMEM基础培养基中2mg / mL）消化切碎的真皮2.5小时。每30分钟用移液器尖端轻轻研磨切碎的真皮，直到真皮完全解离。
   5. 用70μM细胞过滤器过滤细胞悬浮液。有必要使用1 mL注射器施加机械力以完全过滤悬浮液。
   6. 用5mL完全DMEM培养基（DMEM基础培养基+ 5%FBS + 1x抗生素）稀释过滤的细胞悬浮液，以阻止胶原酶的酶活性。
   7. 在室温下以870× g 离心细胞悬浮液5分钟以沉淀细胞。
   8. 从该细胞沉淀中，将获得成纤维细胞和SC。将细胞沉淀重悬于2mL DMEM完全培养基中以分裂细胞（1mL细胞悬浮液/管），并在室温下以870× g 离心5分钟。
   9. 对于SCs培养，请按照步骤1.3.10-1.3.17进行，对于成纤维细胞培养，请按照步骤1.3.18-1.3.22进行。
   10. 从步骤1.3.8开始，吸出上清液。将细胞沉淀重悬于5mL新鲜DMEM完整培养基中。
   11. 量化细胞数量和活力。
       注意:在这里，使用专门的细胞采样和染色设备（材料表）按照制造商的说明量化细胞数量和活力。
   12. 用5mL重悬细胞以4.0×10³ 细胞/ mL的密度接种预涂的T25烧瓶。在5%CO₂ 存在下在37°C下孵育烧瓶过夜（〜12-16小时孵育）。
   13. 16小时后，通过显微镜（材料表）以10倍放大倍率确认细胞粘附。
   14. 除去非贴壁细胞，并用5 mL 1x DPBS洗涤烧瓶3x。
   15. 在DMEM完全培养基中加入5mL的10μM胞嘧啶阿拉伯糖苷（抗有丝分裂剂，杀死成纤维细胞）。在5%CO₂存在下在37°C下孵育烧瓶24小时。
   16. 从烧瓶中吸出含有胞嘧啶阿拉伯糖苷的培养基。用 5 mL 1x DPBS 冲洗烧瓶 3 次。
   17. 用5mLS完整培养基（材料表）重新填充培养瓶，并在5%CO₂存在下在37°C下孵育48小时。每隔一天刷新SC完整的培养基，直到SC达到80%汇合。
   18. 从解离的真皮层（步骤1.3.8）中抽出上清液，并用5mL成纤维细胞完全培养基（成纤维细胞基础培养基+ 5%FBS + 1x抗生素）重悬细胞沉淀。
   19. 量化细胞数量和细胞活力。
       注意:在这里，使用专门的细胞采样和染色设备（材料表）按照制造商的说明量化细胞数量和活力。
   20. 使用5mL成纤维细胞完整培养基在T25培养瓶（未预包被）中以4.0 x 10³ 细胞/ mL的细胞密度接种成纤维细胞。在37°C下在5%CO₂ 存在下孵育过夜（〜12-16小时孵育）。
   21. 16-24小时后，通过显微镜（材料表）在10倍放大镜下确认细胞粘附。从烧瓶中抽出非贴壁细胞，并用5 mL 1x DPBS洗涤烧瓶两次。
   22. 加入5mL新鲜成纤维细胞完全培养基，并在5%CO₂ 存在下在37°C下孵育48小时。每隔一天刷新培养基，直到成纤维细胞达到传代或下游测定所需的汇合处（50%-80%汇合）。

2. 通过免疫荧光验证表皮角质形成细胞、真皮SC和成纤维细胞蛋白标志物

1. 第1天 - 涂布室载玻片并分离细胞
   1. 预涂4孔室载玻片，其中胶原-I用于角质形成细胞，或PLL用于SC，或仅1x DPBS用于成纤维细胞（每孔0.5 mL）。确保涂覆整个表面。在37°C下孵育室载玻片2小时。在孵育期间，准备细胞。
   2. 培养的细胞达到50%-80%汇合后，用1x DPBS 3x（每个孔1mL）洗涤烧瓶。
   3. 通过在5%CO 2存在下在37°C下孵育2分钟，用5mL的_0.25 %胰蛋白酶- EDTA（TE）溶液分离粘附的细胞，直到细胞开始变圆。用显微镜（材料表）在10倍放大镜下观察细胞分离。
   4. 孵育后，将含有细胞的TE溶液转移到具有5mL胎牛血清（FBS）的锥形管中。
   5. 向培养瓶中加入5mL胰蛋白酶中和缓冲液（TNB），然后将内容物转移到上述离心管（具有TE和FBS的细胞）中。用显微镜（材料表）在10倍放大镜下观察细胞分离。
      注意:TNB或FBS或两者都可用于中和胰蛋白酶活性。
   6. 将含有细胞/ TE / TNB的锥形管以870× g 离心5分钟。将上清液转移到另一个管中，并将细胞沉淀重悬于相应的完整培养基中。测量步骤1.2.11中提到的细胞活力。
   7. 用1x DPBS（每个孔1 mL）3x冲洗预涂布室载玻片（步骤2.1.1）。
   8. 在适当的完全细胞培养基中以适当的密度（30，000个细胞/ 0.5mL /室）在组织培养罩内半干燥载玻片和种子角质形成细胞，SC或成纤维细胞。
   9. 将腔室载玻片在37°C下孵育过夜，以使细胞粘附。
2. 第2天 - 用牛血清白蛋白（BSA）和一抗孵育阻挡腔室载玻片
   1. 从腔室载玻片中吸取细胞培养基，并用1mL 1x DPBS洗涤3次。
   2. 用4%多聚甲醛固定在1x DPBS（每个孔1mL）中粘附细胞，并在组织培养罩内的RT下孵育15分钟。
   3. 从腔室载玻片中吸取4%多聚甲醛，并用1x DPBS（每个孔1mL）洗涤室载玻片3次。
   4. 用1%的TritonX-100在1x DPBS（每个孔1mL）中透化细胞膜，并在室温下孵育15分钟。
   5. 从腔室载玻片中吸取封闭溶液，用1x DPBS（每个孔1mL）洗涤3次30秒，然后从孔中吸取1x DPBS。
   6. 用5%BSA（每个孔0.5mL）封闭腔室载玻片，并在室温下孵育45分钟。
   7. 从腔室载玻片中吸取封闭溶液，用1x DPBS（每个孔1 mL）洗涤3次30秒，然后从孔中吸取1x DPBS。
   8. 用5%BSA稀释一抗（每个孔0.2mL）（一抗稀释:角质形成细胞:小鼠细胞角蛋白14抗体（1:100）和细胞角蛋白10抗体（1:100）;施万细胞:小鼠S100抗体（1:200）和兔神经生长因子受体（p75-NTR）抗体（1:500）;成纤维细胞:兔维门汀抗体（1:200）和小鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（1:200））。
   9. 将一抗加入腔室载玻片上的相应细胞，并在加湿室中在4°C下孵育约15-16小时（过夜）。
   10. 从腔室载玻片中抽吸一抗，用1x DPBS（每个孔1mL）洗涤3次30秒，然后从孔中吸取1x DPBS。
   11. 用0.5%BSA稀释二抗（山羊抗兔IgG二抗Alexa Fluor 488（1:500）和山羊抗小鼠IgG二抗Alexa Fluor 594（1:500））。向每个孔中加入适当的二抗（每个孔0.2 mL）。在室温下孵育45分钟。
   12. 从腔室载玻片中抽吸二抗，用1x DPBS（每个孔1 mL）洗涤3次30秒，然后从孔中吸取1x DBPS。
   13. 使用垫片去除器取下4孔腔室滑道上的垫片。尽量不要在载玻片上留下任何粘合剂，因为这会干扰盖玻片应用。加入一滴装有4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI）的安装介质。或者，用DAPI对孔进行反染色，并使用不含标签的安装介质。
   14. 小心地将盖玻片放在载玻片上，避免气泡，并用胶水密封盖玻片的末端。通过显微镜观察10倍和/或20倍放大倍率下的免疫荧光染色图案（材料表）。

Results

正常新生儿包皮用于原发性表皮角质形成细胞和真皮SC和成纤维细胞的分离。将分离的原代细胞在含有生长因子的相应细胞培养基中培养。在培养瓶中接种SCs和成纤维细胞后，大多数细胞在2小时内粘附在烧瓶底部。在角质形成细胞的情况下，大多数角质形成细胞粘附24小时。分离的表皮原代角质形成细胞在第7天达到85%汇合，并表现出特征性细胞形态（鹅卵石形状）（图1A）。到第5天，SC达到95%的汇合度，并且形状为双极或三极（图1B）。成纤维细胞培养物在第4天达到95%汇合，大多数细胞表现出纺锤形形态（图1C）。细胞类型特异性蛋白表达在这些培养物中通过免疫荧光染色得到证实。角质形成细胞对K10（分化标志物）和K14（增殖标志物）蛋白呈阳性（图2A）;同样，SCs对S100和p75-NTR呈阳性（图2C）。成纤维细胞阳性表达维门汀，但不表达肌成纤维细胞标志物α平滑肌肌...

Discussion

该协议描述了一种从包皮的单个片段中分离三个不同细胞群的方法，即角质形成细胞，成纤维细胞和施旺细胞。有一些分离方案可用于分离角质形成细胞和成纤维细胞^{2，3，5，6}，但没有一种描述SC分离。除了皮肤中的关键结构细胞、角质形成细胞和成纤维细胞外，皮肤还受到感觉传入结构和自主神经传出物的高度支配。感觉传入物在轻触，振动，疼痛，瘙痒和冷热感觉的传递中起重要作用。自主神经传出物支配汗腺和毛突肌⁹.每个神经轴突都由SC（周围神经系统的神经胶质细胞）包皮。随着SCs支持轴突再生^10，11，对SCs的研究和临床兴趣显着^增加。皮肤神经是皮肤生理学和疾病病理学的重要调节因子，通过与非神经细胞的通信信号（神经调节剂/神经介质）

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 和微量;M 无菌过滤器（Millex-GP 针头式过滤器单元，聚醚砜）	MilliporeSigma	SLGPR33RS
70 µM 细胞过滤器	CELLTREAT	229483
100 µM 细胞过滤器	CELLTREAT	229485
1 mL 一次性注射器	BD Luer-Lok	BD-309659
5 mL 一次性注射器（注射器无菌，一次性使用）	BD Luer-Lok	BD309646
10 mL 一次性注射器	BD Luer-Lok	BD305462
1% TritonX-100	Sigma	X100-1L	使用时制备
4%多聚甲醛溶液	ThermoFisher Scientific	J19943。K2	即用型，储存温度为 4 °C
5% BSA	Sigma	A7906-100G	使用时制备
70% 乙醇	Pharmco	111000200
抗生素	ScienCell Research	503
Chemometec Vial1-Cassette	Fisher Scientific	NC1420193
胶原酶	Gibco	17018-029
盖玻片	Fisherbrand	12544D 22*50-1.5
分散酶	I Sigma-Aldrich	D46693
DMEM 基础培养基	ScienCell Research	9221
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水，不含 Ca2+ 和 Mg2+ （DPBS）	宁	21-031-CV）
Nunc 15 mL 锥形无菌聚丙烯离心管	ThermoFisher Scientific	339651
Nunc 50 mL 无菌锥形聚丙烯离心管	ThermoFisher Scientific	339653
1.5 mL 微量离心管	Fisherbrand	02-681-5
胎牛血清 （FBS）	ThermoFisher Scientific	10082147
成纤维细胞完全培养基	ScienCell Research	2331
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	稀释度 （1：500）
山羊抗兔 IgG （H+L） 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	稀释度 （1：500）
Hanks' 缓冲盐水溶液（HBSS 缓冲液）	Lonza	CC-5022
人类包皮			用于研究目的的去识别化人类包皮组织（机构审查委员会 - IRB #17574）。
KGM-GOLD 角质形成细胞培养基（KGM gold 和补充剂）	Lonza	00192151 和 00192152
小鼠 α-平滑肌肌动蛋白抗体	ThermoFisher Scientific	14-9760-82	稀释度 （1：200）
小鼠细胞角蛋白 14 抗体	Abcam	ab7800	稀释度 （1：100）
小鼠 S100 抗体	ThermoFisher Scientific	MA5-12969	稀释度 （1：200）
多腔室（4 孔载玻片）	Tab-Tek	154526
NucleoCounter -Via1-Cassette	Chemometec	941-0012
Poly-L-Lysisne （PLL）	ScienCell Research	32503
ProLong Gold 抗淬灭封片剂与 DAPI	Invitrogen	P36935
兔 K10 抗体	Sigma-Aldrich	SAB4501656	稀释（1 分 100 秒）
兔 p75-NTR 抗体	Millipore	AB1554	稀释 （1：500）
兔波形蛋白	ProteinTech	10366-1-AP	稀释 （1：200）
雪旺细胞培养基	ScienCell Research	1701
精密镊子 DUMONT 直镊子，带超细尖端 Dumostar， 5	ROTH	LH75.1	使用
前用 70% 酒精消毒IRIS 剪刀，尖锐/尖锐。长度 4–3/8"（111 毫米）	Codman	54-6500	使用前用 70% 酒精消毒
消毒外科 - 锋利刀片（Duro Edge Economy 单刃刀片）	剃须刀片公司	94-0120	使用前用 70% 酒精消毒
T25 培养瓶	康宁	353109
胰蛋白酶中和缓冲液 （TNS）	Lonza	CC-5002
胰蛋白酶/EDTA	Lonza	CC-5012
倒置显微镜	蔡司	Axio Observer 7- Axiocam 506 单色 –Apotome.2 显微镜	用于对含有染色细胞的腔室载玻片进行免疫荧光
倒置显微镜	ZEISS	Primovert	用于观察/观察细胞附着或分离