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方法文章

人包皮来源的施万细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的分离、培养与鉴定

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DOI：

10.3791/63776

⸱

2022年3月23日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

本文内容

摘要

研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的体外相互作用。本方案描述了从人包皮中分离、培养和鉴定这些原代细胞的方法。

摘要

本方案描述了利用快速酶解法从人皮肤中高效分离、培养和鉴定高产量、高活性的人原代细胞的方法。原代角质形成细胞、成纤维细胞和施万细胞均取自新生儿包皮组织，该组织可在标准医疗程序后获得。切除的皮肤经消毒后，使用手术刀去除皮下脂肪和肌肉组织。本方法包括通过酶解和机械分离将表皮与真皮层分开，随后分别对各皮肤层进行额外的酶消化处理，以获得单细胞悬液。最终，将单细胞按照标准细胞培养流程接种于相应的细胞培养基中，以维持其数周内的生长与活性。综上，该简易方案可从单份皮肤样本中同时分离、培养和鉴定上述三种细胞类型，用于 体外 皮肤-神经模型的评估。此外，这些细胞还可用于共培养，以评估它们之间的相互作用及其对彼此的响应 体外 以机器人方式在培养物中制造划痕，模拟创伤以研究伤口愈合。

引言

从活体组织中分离并在体外培养的原代细胞 体外 条件与生理状态高度相似1，使其成为研究生理和病理生理过程的理想模型。皮肤包含多种细胞类型，如角质形成细胞、成纤维细胞、皮脂细胞、黑色素细胞和施万细胞（SCs），这些细胞可被分离并进行培养 体外 实验。目前尚未有报道从一块皮肤组织中同时分离和培养角质形成细胞、成纤维细胞和干细胞的方法。本实验方案的目标有两个：1）建立一种可靠且可重复的真皮干细胞分离与培养方法；2）采用一种高效且稳健的方法，从一份人包皮组织中同时分离角质形成细胞、成纤维细胞和干细胞。

目前已有成熟的方案用于分离皮肤角质形成细胞2,3,4 和成纤维细胞5,6这些研究描述了从皮肤中分离角质形成细胞、成纤维细胞或两者的方法，但尚无方案涉及如何从人皮肤建立原代施万细胞（SCs）的培养。近期研究表明，神经源性施万细胞可调节角质形成细胞和成纤维细胞的细胞活动，并调控皮肤正常的生理功能7因此，SCs 对皮肤稳态至关重要，并在很大程度上参与调控影响邻近皮肤细胞类型行为的生理过程。8因此，一种能够分离出每种细胞类型的方案是最理想的 体外 涉及细胞间通讯或细胞类型间相互作用的实验。

本方案描述了从一块皮肤组织中建立原代细胞的单个细胞培养物的方法。当可获取的组织量有限时，该方案尤为适用。此外，从同一供体中分离所有三种细胞类型，可在不同细胞类型之间进行可靠的比较或共培养实验，同时减少遗传背景对目标实验的干扰。

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方案

获取和使用去标识化的人包皮组织用于科研目的，已由宾夕法尼亚州立医学院机构审查委员会（IRB #17574）审核，并被认定为"不属于人类研究"。

注意：按照以下方案，可从一份包皮组织中获得 2.4 × 106 个角质形成细胞、4.4 × 106 个成纤维细胞和 1.1 × 106 个干细胞。通常情况下，这些原代细胞可根据实验条件使用 3 代。

1. 原代细胞的分离与培养条件

  1. 表皮与真皮分离步骤
    1. 由医生在经批准的医院监管规程下，按照标准护理程序获取新生儿包皮组织。医生决定出生后包皮环切的时机以及切除皮肤的范围。
    2. 将切除的包皮组织放入含有 8–10 mL 冰冷的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）基础培养基的微量离心管中，并立即运送至细胞培养实验室进行细胞分离。用含 1× 抗生素/抗真菌剂的 1× 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗皮肤组织两次，每次 20–25 mL。
      注意：为获得最大细胞活性，切除的包皮组织应在处理前置于 4 °C 保存，且细胞应在 24 小时内完成收获。
    3. 在 DPBS/抗生素中冲洗后，将包皮组织置于 10 cm 组织培养皿中，加入 25–30 mL 冰冷的 DMEM 基础培养基，浸泡 10–15 分钟。所有操作步骤均应在组织培养超净台中采用无菌技术进行。
    4. 使用手术刀小心地将包皮切开，暴露真皮层及皮下脂肪组织。
    5. 根据需要使用镊子、手术刀片和剪刀去除皮下脂肪组织，弃去脂肪组织。将清洗后的包皮切成三至五小块。
    6. 将皮肤组织块转移至含有 16–20 mL dispase-I/DMEM 培养基（4 mg/mL 溶于 DMEM 基础培养基）的无菌锥形管中。
    7. 在 dispase-I 孵育的前 30 分钟内，间歇性地倒置锥形管以混匀组织块。随后将锥形管置于 4 °C 孵育 16–18 小时，注意确保组织块完全浸没于 dispase-I/培养基中。
      注意：dispase-I 溶液应在使用前用冷 DMEM 基础培养基新鲜配制，经 0.22 µm 滤器过滤，并保持在 4 °C。
    8. 经 dispase-I 过夜消化后，取出皮肤组织块并放置于干燥、无菌的培养皿上。将每块皮肤展开，使外侧表皮层接触培养皿表面。
    9. 使用两把镊子小心地将表皮层与真皮层分离。从组织边缘开始，将表皮层从真皮层上剥离。
      注意：若表皮层难以与真皮层分离，说明 dispase-I 消化不充分。可采取以下故障排除措施：1）将组织块重新放回 dispase-I/DMEM 溶液中，在 4 °C 继续孵育 2–3 小时；2）将组织块转移至新鲜的 dispase-I/DMEM 溶液中，在 4 °C 再孵育 2–3 小时。
    10. 利用分离后的表皮和真皮组织分别分离角质形成细胞（表皮）以及成纤维细胞和施万细胞（真皮）。
      注意：请按照以下步骤进行特定细胞类型的分离与培养条件操作。
  2. 从表皮中分离角质形成细胞
    1. 向 10 cm 培养皿中加入 5 mL HEPES 缓冲盐水（HBS），并将分离的表皮碎片加入其中。室温（RT）孵育 10 分钟。
    2. HBS 孵育后，收集 HBS 溶液至 50 mL 锥形管中。另取 50 mL 锥形管加入 5 mL 胰蛋白酶中和缓冲液（TNB）（材料表），并暂置备用。
    3. 向表皮碎片中加入 3 mL 胰蛋白酶溶液。37 °C 孵育 10 分钟。
    4. 用镊子轻轻搅动表皮碎片，直至胰蛋白酶溶液变浑浊。
    5. 将胰蛋白酶溶液/角质形成细胞加入步骤 1.2.2 中含有 HBS 和 TNB 的试管中。
    6. 对于在初始胰蛋白酶消化中未完全溶解的残留表皮碎片，加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。37 °C 孵育 10 分钟，并重复步骤 1.2.4 和 1.2.5。
    7. 向含有 HBS 和 TNB 溶液的胰蛋白酶/EDTA 溶液管中加入 2 mL 胎牛血清（FBS）。
    8. 将含有 HBS/TNB/胰蛋白酶和角质形成细胞的收集管在 4 °C 下以 870 × g 离心 5 分钟。
    9. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL 角质形成细胞完全生长培养基中（材料表）。
    10. 用无菌 100 µm 滤器将细胞悬液过滤至无菌 50 mL 锥形管中，以去除碎片。
    11. 定量细胞数量和细胞活力。
      注意：此处使用一种专用的细胞取样与染色设备（材料表），按照制造商说明书对细胞数量和活力进行定量。
    12. 根据实验需要接种培养板。推荐接种密度约为 45,000 个细胞/cm2。
    13. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 2 天，使角质形成细胞贴附于培养皿表面。
    14. 2 天后，吸除未贴壁细胞。每隔一天更换一次细胞培养基，直至角质形成细胞达到传代或下游实验所需的汇合度（50%–80% 汇合度）。
  3. 从真皮中分离施万细胞（SCs）和成纤维细胞
    1. 使用 5 mL 1× DPBS 将 T25 培养瓶预先包被多聚-L-赖氨酸（PLL，0.01 µg/µL）。将包被后的培养瓶置于 37 °C 孵育 3 小时。用 1× DPBS（5 mL）洗涤 PLL 包被基质两次。
      注意：T25 培养瓶可提前准备。
    2. 用 5 mL DMEM 基础培养基冲洗分离的真皮组织块。
    3. 用剪刀或手术刀将真皮组织切成小块。
    4. 加入 5 mL 胶原酶（2 mg/mL 溶于 DMEM 基础培养基）在 37 °C 消化 2.5 小时。每隔 30 分钟用移液枪头轻轻吹打组织块，直至真皮组织完全解离。
    5. 用 70 µm 细胞滤网过滤细胞悬液。必要时使用 1 mL 注射器施加机械力以完全过滤悬液。
    6. 用 5 mL 完全 DMEM 培养基（DMEM 基础培养基 + 5% FBS + 1× 抗生素）稀释过滤后的细胞悬液，以终止胶原酶的酶活性。
    7. 将细胞悬液在室温下以 870 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
    8. 由此细胞沉淀可获得成纤维细胞和施万细胞。将细胞沉淀重悬于 2 mL 完全 DMEM 培养基中，分装为每管 1 mL 细胞悬液，然后在室温下以 870 × g 离心 5 分钟。
    9. 施万细胞培养请遵循步骤 1.3.10–1.3.17，成纤维细胞培养请遵循步骤 1.3.18–1.3.22。
    10. 从步骤 1.3.8 中吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL 新鲜完全 DMEM 培养基中。
    11. 定量细胞数量和细胞活力。
      注意：此处使用一种专用的细胞取样与染色设备（材料表），按照制造商说明书对细胞数量和活力进行定量。
    12. 将重悬细胞以 4.0 × 103 个细胞/mL 的密度接种至预包被的 T25 培养瓶中，每瓶 5 mL。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育（约 12–16 小时）。
    13. 16 小时后，使用显微镜（材料表）在 10 倍放大下确认细胞贴壁情况。
    14. 去除未贴壁细胞，并用 5 mL 1× DPBS 洗涤培养瓶 3 次。
    15. 向培养瓶中加入 5 mL 含 10 µM 阿糖胞苷（抗有丝分裂剂，可杀死成纤维细胞）的完全 DMEM 培养基。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。
    16. 吸除含阿糖胞苷的培养基，用 5 mL 1× DPBS 洗涤培养瓶 3 次。
    17. 向培养瓶中补充 5 mL 施万细胞完全培养基（材料表），并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。每隔一天更换一次施万细胞完全培养基，直至施万细胞达到 80% 汇合度。
    18. 从解离的真皮层（步骤 1.3.8）中吸除上清液，将细胞沉淀用 5 mL 成纤维细胞完全培养基（成纤维细胞基础培养基 + 5% FBS + 1× 抗生素）重悬。
    19. 定量细胞数量和细胞活力。
      ​注意：此处使用一种专用的细胞取样与染色设备（材料表），按照制造商说明书对细胞数量和活力进行定量。
    20. 将成纤维细胞以 4.0 × 103 个细胞/mL 的密度接种于 T25 培养瓶（无需预包被）中，每瓶使用 5 mL 成纤维细胞完全培养基。在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育（约 12–16 小时）。
    21. 16–24 小时后，使用显微镜（材料表）在 10 倍放大下确认细胞贴壁情况。吸除未贴壁细胞，并用 5 mL 1× DPBS 洗涤培养瓶两次。
    22. 加入 5 mL 新鲜成纤维细胞完全培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。每隔一天更换一次培养基，直至成纤维细胞达到传代或下游检测所需的汇合度（50%–80% 汇合度）。

2. 通过免疫荧光验证表皮角质形成细胞、真皮干细胞和成纤维细胞的蛋白标志物

  1. 第1天——包被腔室载玻片并解离细胞
    1. 使用I型胶原包被4孔腔室载玻片用于角质形成细胞，或使用多聚赖氨酸（PLL）包被用于施万细胞（SCs），或仅使用1×DPBS包被成纤维细胞（每孔0.5 mL）。确保包被整个表面。将腔室载玻片在37 °C孵育2小时。在孵育期间，准备细胞。
    2. 当培养的细胞达到50%–80%融合度时，用1×DPBS洗涤培养瓶3次（每次每孔1 mL）。
    3. 加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（TE）溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟，使贴壁细胞解离，直至细胞开始变圆。在10倍放大倍数下通过显微镜（材料表）观察细胞解离情况。
    4. 孵育结束后，将含有细胞的TE溶液转移至含5 mL胎牛血清（FBS）的锥形管中。
    5. 向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶中和缓冲液（TNB），然后将内容物转移至上述离心管中（含TE和FBS的细胞）。在10倍放大倍数下通过显微镜（材料表）观察细胞解离情况。
      注意：可使用TNB、FBS或两者共同中和胰蛋白酶活性。
    6. 将含有细胞/TE/TNB的锥形管在870 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于相应的完全培养基中。按照步骤1.2.11所述方法测定细胞活力。
    7. 用1×DPBS（每孔1 mL）清洗预包被的腔室载玻片（步骤2.1.1）3次。
    8. 在组织培养超净台内将载玻片半干燥，然后在适当的完全细胞培养基中以适当密度接种角质形成细胞、施万细胞或成纤维细胞（30,000个细胞/0.5 mL/孔）。
    9. 将腔室载玻片在37 °C孵育过夜，使细胞贴壁。
  2. 第2天——用牛血清白蛋白（BSA）封闭腔室载玻片并孵育一抗
    1. 吸除腔室载玻片中的细胞培养基，并用1 mL 1×DPBS洗涤3次。
    2. 用含4%多聚甲醛的1×DPBS（每孔1 mL）固定贴壁细胞，在组织培养超净台内室温孵育15分钟。
    3. 吸除腔室载玻片中的4%多聚甲醛，用1×DPBS（每孔1 mL）洗涤3次。
    4. 用含1% Triton X-100的1×DPBS（每孔1 mL）对细胞膜进行通透处理，在室温孵育15分钟。
    5. 吸除封闭液，用1×DPBS（每孔1 mL）洗涤3次，每次30秒，然后吸除孔内1×DPBS。
    6. 用5% BSA（每孔0.5 mL）封闭腔室载玻片，在室温孵育45分钟。
    7. 吸除封闭液，用1×DPBS（每孔1 mL）洗涤3次，每次30秒，然后吸除孔内1×DPBS。
    8. 用5% BSA稀释一抗（每孔0.2 mL）（一抗稀释比例：角质形成细胞：小鼠抗细胞角蛋白14抗体（1:100）和细胞角蛋白10抗体（1:100）；施万细胞：小鼠抗S100抗体（1:200）和兔抗神经生长因子受体（p75-NTR）抗体（1:500）；成纤维细胞：兔抗波形蛋白抗体（1:200）和小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（1:200））。
    9. 将一抗加入腔室载玻片上的相应细胞中，在4 °C湿盒中孵育约15–16小时（过夜）。
    10. 吸除腔室载玻片中的一抗，用1×DPBS（每孔1 mL）洗涤3次，每次30秒，然后吸除孔内1×DPBS。
    11. 用0.5% BSA稀释二抗（山羊抗兔IgG二抗-Alexa Fluor 488（1:500）和山羊抗小鼠IgG二抗-Alexa Fluor 594（1:500）），每孔加入适量二抗（每孔0.2 mL），在室温孵育45分钟。
    12. 吸除腔室载玻片中的二抗，用1×DPBS（每孔1 mL）洗涤3次，每次30秒，然后吸除孔内1×DPBS。
    13. 使用垫片去除工具移除4孔腔室载玻片上的垫片。尽量避免在载玻片上残留粘合剂，以免影响盖玻片的贴附。加入一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂。或者，可用DAPI对孔内样本进行复染，并使用不含荧光标记的封片剂。
    14. 小心地将盖玻片覆盖在载玻片上，避免产生气泡，并用胶水密封盖玻片边缘。在10倍和/或20倍放大倍数下通过显微镜（材料表）观察免疫荧光染色模式。

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结果

采用正常的新生儿包皮组织分离原代表皮角质形成细胞以及真皮干细胞（SCs）和成纤维细胞。分离得到的原代细胞在含有生长因子的相应细胞培养基中进行培养。将干细胞和成纤维细胞接种至培养瓶后，大多数细胞在2小时内即贴附于瓶底。对于角质形成细胞，大多数细胞在24小时内完成贴附。分离的原代表皮角质形成细胞在培养第7天达到约85%的融合度，并呈现典型的细胞形态（鹅卵石样形状）（图1A）。干细胞在第5天达到95%的融合度，细胞形态呈双极或三极状（图1B）。成纤维细胞培养物在第4天达到95%的融合度，大多数细胞呈现纺锤形形态（图1C）。通过免疫荧光染色证实了这些培养细胞中细胞类型特异性蛋白的表达。角质形成细胞对K10（分化标志物）和K14（增殖标志物）蛋白呈阳性反应（图2A）；类似地，干细胞对S100和p75-NTR呈阳性反应（图2C）。成纤维细胞表达波形蛋白（...

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讨论

本方案描述了一种从单一片段包皮组织中分离三种不同细胞群体的方法，即角质形成细胞、成纤维细胞和施万细胞。目前已有若干种用于分离角质形成细胞和成纤维细胞的方案2,3,5,6，但尚无任何方案描述施万细胞的分离。皮肤除了含有主要的结构细胞——角质形成细胞和成纤维细胞外，还富含感觉传入神经结构和自主传出神经纤维。感觉传入神经在传递轻触、振动、疼痛、瘙痒以及冷热感觉方面发挥重要作用。自主传出神经则支配汗腺和立毛肌9。每条神经轴突均被施万细胞（SC）所包裹，施万细胞是周围神经系统中的胶质细胞。随着施万细胞在支持轴突再生方面的潜力被不断揭示，其在科研和临床上的关注度显著上升10,11。皮肤神经还通过向非神经细胞传递信号（神经调节物质/神...

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披露

其余所有作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢 Fadia Kamal 博士和 Reyad Elbarbary 博士允许我们使用实验室仪器并提供技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号：K08 AR060164-01A）和美国国防部（DOD，项目号：W81XWH-16-1-0725）向 J. C. E. 提供的资助，以及宾夕法尼亚州立大学赫尔希医学中心的机构支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µM 无菌滤器（Millex-GP 注射器滤器单元，聚醚砜）MilliporeSigmaSLGPR33RS
70 µM 细胞筛CELLTREAT229483
100 µM 细胞筛CELLTREAT229485
1 mL 一次性注射器BD Luer-LokBD-309659
5 mL 一次性注射器（无菌，单次使用）BD Luer-LokBD309646
10 mL 一次性注射器BD Luer-LokBD305462
1% TritonX-100SigmaX100-1L使用时配制
4% 多聚甲醛溶液ThermoFisher ScientificJ19943.K2即用型，4 °C 保存
5% BSASigmaA7906-100G使用时配制
70% 乙醇Pharmco111000200
抗生素ScienCell Research503
Chemometec Vial1-盒式卡匣Fisher ScientificNC1420193
胶原酶Gibco17018-029
盖玻片Fisherbrand12544D 22*50-1.5
Dispase ISigma-AldrichD46693
DMEM 基础培养基ScienCell Research9221
无钙2+ 和镁2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Corning 21-031-CV)
Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管ThermoFisher Scientific339651
Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管ThermoFisher Scientific339653
1.5 mL 微量离心管Fisherbrand02-681-5
胎牛血清（FBS）ThermoFisher Scientific10082147
成纤维细胞完全培养基ScienCell Research2331
山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594InvitrogenA11032稀释比例（1:500）
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488InvitrogenA11008稀释比例（1:500）
Hanks 平衡盐溶液（HBSS 缓冲液）LonzaCC-5022
人包皮组织用于科研的去标识化人包皮组织（机构审查委员会 IRB #17574）
KGM-GOLD 角质形成细胞培养基（KGM gold 及补充剂）Lonza00192151 和 00192152
小鼠 α-平滑肌肌动蛋白抗体ThermoFisher Scientific14-9760-82稀释比例（1:200）
小鼠细胞角蛋白14抗体Abcamab7800稀释比例（1:100）
小鼠 S100 抗体ThermoFisher ScientificMA5-12969稀释比例（1:200）
多孔腔室载玻片（4 孔玻璃载片）Tab-Tek154526
NucleoCounter -Via1-盒式卡匣Chemometec941-0012
多聚-L-赖氨酸（PLL）ScienCell Research32503
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36935
兔 K10 抗体Sigma-AldrichSAB4501656稀释比例（1:100）
兔 p75-NTR 抗体MilliporeAB1554稀释比例（1:500）
兔波形蛋白抗体ProteinTech10366-1-AP稀释比例（1:200）
施万细胞培养基ScienCell Research1701
精密镊子 DUMONT 直头超细尖 Dumostar，5 号ROTHLH75.1使用前用 70% 乙醇灭菌
IRIS 剪刀，尖头/尖头，长度 4–3/8"（111 mm）Codman54-6500使用前用 70% 乙醇灭菌
灭菌外科刀片（Duro Edge 经济型单边刀片）Razor blade company94-0120使用前用 70% 乙醇灭菌
T25 培养瓶Corning353109
胰酶中和缓冲液（TNS）LonzaCC-5002
胰酶/EDTALonzaCC-5012
倒置显微镜ZEISSAxio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 显微镜用于含染色细胞的腔室载玻片的免疫荧光观察
倒置显微镜ZEISSPrimovert用于观察细胞贴壁或脱落情况

参考文献

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人包皮来源的施万细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的分离、培养与鉴定
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