本实验方案旨在提供收集、固定和保存菌异养植物样品的详细步骤，并应用多种显微技术（如扫描电镜、透射电镜、光学显微镜、共聚焦显微镜和荧光显微镜），以研究菌根真菌在植物组织及经菌根真菌接种萌发的种子中的定殖情况。
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本文内容
摘要
摘要
结构植物学是全面理解植物生态学、生理学、发育和进化不可或缺的视角。在研究菌根异养植物（即从真菌获取碳的植物）时，其结构适应性的显著特征、真菌对组织的定植模式以及地下器官的形态解剖结构，能够揭示这些植物的发育策略及其与作为营养来源的菌丝之间的关系。共生真菌的另一个重要作用与兰科种子的萌发密切相关；所有兰科（Orchidaceae）植物在种子萌发和幼苗阶段均为菌根异养（初期菌根异养），即使其中一些物种在成株阶段具备光合作用能力。由于兰科种子缺乏营养储备，真菌共生体对于提供底物并促进萌发至关重要。通过结构视角分析萌发的不同阶段，也有助于回答有关真菌与种子相互作用的重要科学问题。本文提出了多种成像技术，可用于揭示植物组织中的内生真菌。植物器官的徒手切片和薄切片可经染色后在光学显微镜下观察。可使用与小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin）偶联的荧光染料对真菌进行标记，并与Calcofluor White共孵育，以在共聚焦显微镜下突出显示植物细胞壁。此外，本文还详细描述了针对菌根异养型兰科植物的扫描电镜和透射电镜技术，并探讨了将这些方法应用于相关植物的可能性。文中还详细描述了兰科种子的共生萌发（即在菌根真菌存在条件下的萌发）实验方案，以及如何制备不同萌发阶段所获得的结构，用于光学显微镜、共聚焦显微镜和电子显微镜的分析。
引言
植物学中的结构研究涵盖植物形态学与解剖学，是理解植物整体生物体的基础1,2，并为整合和促进有关植物生态学、生理学、发育及进化方面的知识提供了不可或缺的视角3。目前植物形态学与解剖学的研究方法包括近年来发展出的技术，也包括一百多年前建立的方案、设备与知识体系2。经典方法（如光学显微镜技术）与较新的技术（如共聚焦显微镜、X射线显微断层成像）的持续应用与改进，均基于一个共同的核心：即支撑方法学发展的理论知识。
植物解剖学与形态学的主要工具是图像。尽管存在一种误解，认为此类分析仅仅是简单的观察，从而为主观解释留出空间2解读所获得的图像需要了解该领域所采用的方法（仪器设备、分析类型、实验技术流程）、细胞组分、组织化学以及植物体本身（组织结构与功能、个体发育、形态适应性）。 通过 多种方法可用于关联形态与功能、解析结构的化学组成、验证分类单元的描述、理解植物病原体引起的感染以及其他类似评估。
研究菌根异养（MH）植物时 即通过菌根真菌获取碳的非光合作用植物4,
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方案
1. 样品的采集、固定与保存
注意：完全菌异养植物通常可在阴暗的森林下层植被中找到12,13，主要分布在潮湿且枯落物丰富的区域，而部分菌异养植物则多见于较开阔的森林环境中12,13。菌异养植物通常具有形态和大小各异的发达地下器官。
- 采集菌根真菌（MH）物种时，应探索植株基部周围的土壤，注意不要损伤地下器官，避免将植株从土壤中拔出，以防地上部分与地下部分分离。
- 使用园艺铲小心挖掘地上结构周围区域，同时探查根、茎、根状茎和贮藏器官等地下结构，注意不要损伤这些结构。
- 去除土壤颗粒以保护脆弱结构，并用自来水轻轻冲洗这些器官以清除残留的土壤颗粒，随后固定样品。
- 与凋落物相关的菌根植物需格外注意；应小心采集通过菌丝与腐烂物质相连的器官，避免将这些器官从连接结构上强行拉下，因其极为脆弱。应保留具有此类连接的结构，并同时采集凋落物用于分析。
- 若选择使用成像技术分析新鲜材料，应将样品保存在密封的塑料袋中并保持适当湿度，使水分适量蒸发并润湿植株，但避免样品直接接触过多水分。应立即将样品运送至实验室，并在采集当天完成分析，分析时需....
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结果
在完成植物组织固定的必要步骤后，细胞结构在形态、体积以及细胞组分和组织的空间排列方面，均尽可能接近其活体状态16观察 化学固定后样本中此类性状图4). 图4C-F 在光学显微镜下能够充分代表固定良好的样本。按照所述固定步骤操作，并熟悉样本的结构，有助于分析固定效果。
图4：中国台湾MH兰科植物 Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. 丝状根的表面观察与切片
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讨论
植物解剖学和形态学中的图像分析具有重要意义，有助于实现研究目标，并加深对菌异养植物与其不可或缺的内生真菌之间关系的理解，这一点已在对地下器官6,40、种子共生萌发的结构分析39以及地上和繁殖结构的研究中得到证实41。尽管结构植物学在过去十年中逐渐失去其在植物科学其他领域面前的声望与地位1，但在回答科学问题、揭示与植物发育、生态、生理及进化相关的新颖特征和关键性状方面，仍具有突出作用。这些方法共同构成了植物结构研究的基础，涵盖了菌异养植物分析中的若干重要方面。
提供了采集菌根异养植物（MH植物）的关键信息，因为若不谨慎操作，其发达的地下器官可能受损且无法完整采集。在采集和保存地下结构时，必须考虑这些结构的显著适应性特征6以及它们与土壤中真菌的紧密联系，这些真菌可能与自养植物
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢FAEPEX和FAPESP（2015/26479-6）提供的经费支持。MPP感谢Capes为其硕士阶段研究提供的奖学金（项目编号88887.600591/2021-00）以及CNPq的支持。JLSM感谢CNPq提供的生产力研究资助（303664/2020-7）。作者还感谢LME（电子显微镜实验室——巴西坎皮纳斯州立大学生物研究所）、INFABiC（细胞生物学应用光子学国家科学与技术研究所——巴西坎皮纳斯州立大学）和LaBiVasc（血管生物学实验室——巴西坎皮纳斯州立大学生物研究所DBEF部门）提供的仪器使用权限和技术协助；感谢LAMEB（巴西南部联邦大学）及Eliana de Medeiros Oliveira（巴西南部联邦大学）在冷冻保护方案方面的贡献；感谢LME在透射电子显微镜（TEM）实验方案方面的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 179124 | （用于扫描电镜样品台固定） |
| 琼脂（AA） | Sigma-Aldrich | A1296 | （用于种子萌发试验） |
| Calcofluor White 染色剂 | Sigma-Aldrich | 18909 | 荧光染料（检测纤维素） |
| 柠檬酸缓冲液，0.09 M，pH 4.8 | Sigma-Aldrich | C2488 | （用于甲苯胺蓝O染色） |
| 导电双面碳胶带 | Fisher Scientific | 50-285-81 | （用于扫描电镜） |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | （任意型号） | |
| 铜网 | Sigma-Aldrich | G4776 | （用于透射电镜） |
| 临界点干燥仪 | Balzers | （任意型号） | |
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems | （任意型号） | |
| 体视显微镜 | Leica Biosystems | （= 立体显微镜，任意型号） | |
| Entellan | Sigma-Aldrich | 107960 | 快速封片介质，用于显微镜观察 |
| 纯乙醇（≥99.5%） | Sigma-Aldrich | 459836 | （= 乙醇，用于脱水过程） |
| 甲醛溶液，37% | Sigma-Aldrich | 252549 | （用于NBF溶液配制） |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | 组织学组织固定剂 |
| 透射电镜用明胶胶囊 | Fisher Scientific | 50-248-71 | （用于透射电镜树脂聚合） |
| 明胶溶液，2% 水溶液（H2O） | Sigma-Aldrich | G1393 | （稀释后用于载玻片制备——OCT粘附） |
| 戊二醛溶液，25% | Sigma-Aldrich | G6257 | （用于Karnovsky’s溶液配制） |
| HistoResin | Leica Biosystems | 14702231731 | 乙二醇甲基丙烯酸甲酯（GMA）包埋试剂盒 |
| 碘 | Sigma-Aldrich | 207772 | （用于卢戈氏碘液配制） |
| 硝酸铅(II) | Sigma-Aldrich | 228621 | Pb(NO3)2（用于透射电镜反差染色） |
| 光学显微镜 | Olympus | （任意型号） | |
| LR White 丙烯酸树脂 | Sigma-Aldrich | L9774 | 亲水性丙烯酸树脂，用于透射电镜 |
| 卢戈氏碘液 | Sigma-Aldrich | 62650 | （用于染色） |
| 样品固定用金属样品台 | Rave Scientific | （用于扫描电镜，不同型号） | |
| 切片机 | Leica Biosystems | 手动旋转切片机或其它型号 | |
| 燕麦培养基（OMA） | Millipore | O3506 | （用于种子萌发试验） |
| OCT 化合物，Tissue-Tek | Sakura Finetek USA | 4583 | 冷冻组织包埋介质 |
| 四氧化锇 | Sigma-Aldrich | 201030 | OsO4（用于透射电镜后固定） |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | 密封用热塑性薄膜 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | （用于Karnovsky’s溶液配制） |
| 聚-L-赖氨酸溶液，0.1% 水溶液（H2O） | Sigma-Aldrich | P8920 | （用于载玻片制备——OCT粘附） |
| Poly-Prep 载玻片 | Sigma-Aldrich | P0425 | 聚-L-赖氨酸涂层载玻片 |
| 聚乙烯模具杯托盘 | Polysciences | 17177A-3 | （6×8×5 mm，用于GMA树脂包埋样品） |
| 聚乙烯模具杯托盘 | Polysciences | 17177C-3 | （13×19×5 mm，用于GMA树脂包埋样品） |
| 碘化钾 | Sigma-Aldrich | 221945 | （用于卢戈氏碘液配制） |
| 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） | Millipore | 70139 | （用于种子萌发试验） |
| 扫描电子显微镜 | Jeol | （任意型号） | |
| 硅烷[(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷] | Sigma-Aldrich | A3648 | （用于载玻片制备——OCT粘附） |
| 硅烷处理载玻片 | Sigma-Aldrich | S4651 | 硅烷涂层玻璃载玻片 |
| 橙色颗粒硅胶 | Supelco | 10087 | （用于干燥过程） |
| 三水合二甲胂酸钠 | Sigma-Aldrich | C0250 | （用于戊二醛-二甲胂酸钠缓冲液） |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881 | NaOH（用于Karnovsky’s溶液配制及透射电镜反差染色） |
| 次氯酸钠溶液 | Sigma-Aldrich | 425044 | NaClO（用于种子表面消毒） |
| 无水磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | 71640 | Na2HPO4（用于NBF溶液和磷酸缓冲液配制） |
| 一水合磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S9638 | NaH2PO4·H2O（用于NBF和磷酸缓冲液） |
| 溅射镀膜仪 | Balzers | （任意型号） | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | C12H22O11（用于冷冻保护和萌发试验） |
| 苏丹III | Sigma-Aldrich | S4131 | （用于染色） |
| 苏丹IV | Sigma-Aldrich | 198102 | （用于染色） |
| 苏丹黑B | Sigma-Aldrich | 199664 | （用于染色） |
| 注射器 | （3 mL，任意品牌，用于透射电镜反差染色） | ||
| 注射器滤器单元，Millex-GV 0.22 µm | Millipore | SLGV033R | PVDF材质，33 mm，γ射线灭菌（用于透射电镜反差染色） |
| Tek Bond 超级胶水 793 | Tek Bond Saint-Gobain | 78072720018 | 中等粘度液体氰基丙烯酸酯粘合剂 |
| 甲苯胺蓝O | Sigma-Aldrich | T3260 | （用于染色） |
| 透射电子显微镜 | Jeol | （任意型号） | |
| 氯化三苯基四氮唑 | Sigma-Aldrich | T8877 | （用于种子萌发的四氮唑试验） |
| 二水合柠檬酸三钠 | Sigma-Aldrich | S1804 | Na3(C6H5O7)·2H2O（用于透射电镜反差染色） |
| 超薄切片机 | Leica Biosystems | （任意型号） | |
| 醋酸铀酰 | Fisher Scientific | 18-607-645 | UO2(CH3COO)2（用于透射电镜反差染色） |
| 真空泵 | （任意型号） | ||
| 麦胚凝集素，Alexa Fluor 488 标记 | ThermoFisher Scientific | W11261 | 荧光染料标记凝集素（可检测唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖残基） |
参考文献
- Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Sprin....
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