流式细胞术分析用于检测人类精子功能缺陷的生物标志物

摘要

本实验方案提供了一种实用方法，可利用单台流式细胞仪对人类精子的细胞凋亡、线粒体膜电位及DNA损伤进行检测。

摘要

传统的精液参数分析被广泛用于评估男性生育力。然而，研究发现约15%的不育患者在传统精液参数中未表现出异常。需要借助其他技术来解释特发性不育并检测细微的精子缺陷。目前，精子功能的生物标志物，包括精子凋亡、线粒体膜电位（MMP）和DNA损伤，可在分子水平上揭示精子的生理状态，并能够预测男性生育力。

利用流式细胞术（FCM）技术，可对人类精液样本中的每一种标志物进行快速、准确且精确的检测。但如果所有生物标志物均需使用单台流式细胞仪进行检测，则会显著增加时间成本，并可能影响检测结果。在本方案中，精液样本采集后立即在37 °C条件下孵育以完成液化，随后采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）染色法分析精子凋亡情况。线粒体膜电位（MMP）使用5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）探针进行标记，而DNA损伤则通过吖啶橙（AO）染色的精子染色质结构分析法（SCSA）进行评估。因此，对精子功能标志物的流式细胞术分析可成为实验室和临床中诊断不孕症及评估精子功能的一种实用且可靠的工具。

引言

不孕症已成为一个公共卫生问题，其中男性因素占所有病例的40%–50%^1,2。尽管常规精液质量分析在评估男性生育潜力方面具有重要作用，但约有15%的不孕患者其精子参数（如精子浓度、活力和形态）均在正常范围内³。此外，常规精子检查重复性差，提供的精子功能信息有限，无法对男性生育力进行准确评估，也不能反映精子的细微缺陷。目前已开发出多种检测精子功能的技术，如半透明带结合试验（HZA）、精子穿透试验、低渗肿胀试验和抗精子抗体检测，但这些方法耗时较长，且易受操作者主观因素影响。因此，有必要开发快速、准确的精子功能分析方法。

流式细胞术（FCM）是一种于20世纪70年代发展起来的快速单细胞分析技术，已广泛应用于细胞生物学和医学的各个领域。FCM是一种用于评估精子功能的有力工具，可分析经特异性荧光探针标记的精子⁴。精子通过单通道或多通道激光束时，会产生散射光和发射荧光。散射光包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），分别反映被测细胞的大小以及细胞的颗粒度或内部结构。这些信号由计算机系统收集、显示并进行分析，从而快速、准确地测定精子的一系列特征。因此，FCM是一种快速、客观、多维度且高通量的技术，在精子分析领域受到越来越多的关注。FCM的应用可弥补传统方法的不足，为精子内部结构与功能的检测提供了新的途径。

精子凋亡与男性生育力密切相关⁵。检测精子凋亡是评价精子分子水平功能的重要指标。流式细胞术（FCM）被广泛认为是一种可靠且灵敏的检测精子凋亡的方法，常采用Annexin V-FITC/PI染色法。其基本原理是，在凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层转移至外层。Annexin V是一种依赖Ca²⁺的磷脂结合蛋白（通常用FITC标记），对PS具有高亲和力，因而可检测暴露于细胞膜外表面的PS⁶。结合PI染色可区分坏死与凋亡。因此，Annexin V-FITC/PI双染法被广泛应用，该方法快速、简便，易于检测不同类型的凋亡精子细胞。

一个成熟的哺乳动物精子含有大约72-80个线粒体⁷，这表明精子线粒体的保留具有生物学意义⁸。研究发现，精子线粒体在维持精子运动能力和生育力方面发挥着重要作用⁹。JC-1染料可作为多种细胞类型中线粒体膜电位（MMP）的指示剂，是评估精子线粒体活性最常用的荧光染料之一¹⁰。JC-1是一种阳离子染料，能够依赖膜电位在线粒体内聚集。当JC-1结合到高电位（ΔΨm，80-100 mV）的膜上时，会形成J-聚集体¹¹，其最大荧光发射波长从525 nm（绿色）转变为约590 nm（橙红色）。因此，精子线粒体去极化表现为红/绿荧光强度比值的下降，而流式细胞术（FCM）可用于检测人精液样本中的线粒体膜电位水平。

SCSA 方法由 Evenson 等人发明¹²，被认为是一种精确且可重复的检测方法，能够在 1,024 × 1,024 通道尺度上提供独特的双参数数据（红色与绿色荧光）¹³。在受损精子中，精子细胞核中的 DNA 和变性蛋白质会被吖啶橙（AO）标记，DNA 链断裂通过红色荧光进行测量，而完整的双链 DNA 在流式细胞术（FCM）中发出绿色荧光¹⁴。如今，已有多种方法被开发用于评估精子 DNA 完整性。然而，与 SCSA 不同，这些检测方法通常耗时耗力，且缺乏对男性不育症的诊断能力。SCSA 检测结果与人类 DNA 妊娠率及流产率显著相关，提供了有力证据表明 SCSA 可能适用于人类精液分析，并可作为不孕症临床医生的有价值工具¹⁵。

染色质完整性、线粒体膜电位（MMP）和细胞凋亡反映了精子功能的不同方面，因此，联合使用这些生物标志物可能更全面地评估精子状态。流式细胞术（FCM）可用于分别检测人精液样本中的染色质完整性、线粒体膜电位或细胞凋亡。尽管流式细胞仪的成本以及染料价格限制了这些技术在生殖健康临床实验室中的广泛应用，但其在生育力评估方面的价值正逐渐被认可。

然而，由于每项实验均需对精子样本进行预处理，且所有预处理后的样本都需尽快检测，若使用一台流式细胞仪对同一样本同时测量这三种生物标志物，可能导致部分实验等待时间过长，从而影响结果的可靠性。这是因为在等待过程中，若未充分统筹考虑全部三项实验的流程安排，精子可能会遭受额外损伤。本文介绍了一种实验方案，可在单台流式细胞仪上连续完成这三种生物标志物的检测，同时避免因等待时间延长而对实验质量造成显著影响。

方案

注意：通过流式细胞术检测精子功能损伤生物标志物的工作流程包括（1）细胞制备，（2）荧光试剂染色，以及（3）流式细胞分析与数据分析（图1）。本方案遵循陆军军医大学伦理委员会的指导原则（1.0/2013.4-12）。

1. 细胞准备

1. 通过手淫方式将人类精液样本采集至塑料临床样本罐中，最好在禁欲3-5天后进行。
2. 立即将精液样本放入37 °C培养箱中孵育，并使其完全液化（最长可达1小时）。

2. 使用计算机辅助精子分析（CASA）计数精子细胞

1. 充分混匀液化的精液样本。
2. 取 10 µL 精液加入精子计数板（参见材料表）。
3. 将载玻片放入精子分析仪（Sperm Class Analyzer）中进行扫描（参见材料表），至少计数六个区域和 400 个精子，以估算精子浓度。
   ​注意：用于精子凋亡和线粒体膜电位（MMP）分析的精液样本必须为新鲜样本，不可冷冻。

3. 精子细胞染色

1. 使用 Annexin V-FITC/PI 染色法检测精子凋亡
   1. 将 1 × 10⁶ 个精子细胞加入到一个 1.5 mL 离心管中。
   2. 用 500 µL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
   3. 将精子细胞悬液在 300 × g 条件下离心 7 分钟，弃去上清液。
   4. 用 200 µL 的 1× 结合缓冲液重悬精子细胞。
   5. 加入 2 µL FITC 标记的 Annexin V 和 2 µL 碘化丙啶（PI）（参见材料表）。
   6. 轻轻涡旋混匀细胞，在室温（25 °C）避光孵育 15 分钟，立即放入流式细胞仪进行分析。
2. 使用 JC-1 探针分析线粒体膜电位
   1. 将 2 × 10⁶ 个精子细胞加入到一个 1.5 mL 离心管中，在 600 × g 条件下离心 5 分钟。
   2. 用 1 mL JC-1 工作液重悬精子细胞悬液（参见材料表）。
   3. 轻轻涡旋混匀细胞，在 37 °C 避光孵育 20 分钟。
   4. 在 600 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
   5. 用 1 mL PBS 以 600 × g 离心 5 分钟洗涤沉淀两次。
   6. 将染色后的精子细胞用 1 mL PBS 重悬于流式细胞仪检测管中，立即放入流式细胞仪进行分析。
   7. 使用羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）作为阳性对照。将精子细胞（如步骤 3.2.1 所述）用 1 mL CCCP 工作液重悬（参见材料表），轻轻涡旋混匀，在室温避光孵育 20 分钟。在 600 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。重复步骤 3.2.2–3.2.6。
3. 精子染色质结构分析（SCSA）
   1. 取一份液化后的原始精液（0.25 mL）放入冻存管中，立即在液氮（-196 °C）中速冻，待进行 SCSA 检测时使用。
   2. 在 37 °C 水浴中解冻精液样本，并用 TNE 缓冲液（参见材料表）稀释至浓度为 1–2 × 10⁶ 个细胞/mL。
   3. 取 200 µL 稀释后的样本加入流式细胞仪检测管中，与 400 µL 酸溶液（参见材料表）混合 30 秒。
   4. 加入 1.2 mL AO 染色液（参见材料表）对样本进行染色，立即放入流式细胞仪进行分析。
   5. 使用参考样本作为内部标准，用于流式细胞仪的设置和校准。将参考样本用 4 °C 的 TNE 缓冲液稀释至浓度为 1–2 × 10⁶ 个细胞/mL。重复步骤 3.3.1–3.3.4。
      注意事项：所有溶液和缓冲液均保存在 4 °C。（1）在快速冷冻前不应稀释精液。原始精液样本应在流式细胞术检测时解冻并用 TNE 缓冲液稀释。（2）对于不孕症诊所，应将约 0.25 mL 原始精液在超低温冰箱或液氮罐中进行速冻。这些冷冻样本可随后在干冰或液氮干式运输罐中送至 SCSA 诊断实验室。（3）选用一个显示 DNA 完整性异质性的男性射精样本（例如，DNA 断裂指数 [DFI] 为 15%）作为内部标准参考。

4. 流式细胞仪设置

注意：在启动流式细胞仪之前，应执行仪器的系统检查，以验证其分析性能。在所有检查项目完成并合格后，再运行样本。

1. 打开流式细胞仪软件并启动细胞仪。
2. 收集样本数据。
   1. 首先，将对照样本加载到流式细胞仪上，点击“运行”（RUN）以开始数据采集（如有需要，可调整设置）。等待仪器开始吸取样本，并实时显示检测到的事件预览。
      注意：对照样本包括：用于精子凋亡分析的阴性对照（未染色的精子细胞）；用于线粒体膜电位（MMP）分析的阳性对照（经CCCP处理的细胞）；用于SCSA分析的参考样本。
   2. 创建用于查看数据的散点图，选择横轴/纵轴参数（如FSC、SSC）以及线性显示方式，以确定数据的呈现形式。绘制多边形门控以圈定用于分析的精子群体，使仪器能够实时绘制检测到的事件。
   3. 分析该区域内的精子事件。
      1. 对于精子凋亡分析，将FL1设为横轴，FL2设为横轴。通过点击并拖动象限门控，将精子群体划分为四个特定亚群，以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
      2. 对于MMP分析，将FL1设为横轴，FL2设为纵轴。创建一个多边形门控，将精子群体划分为两个特定亚群。
      3. 对于SCSA分析，将FL4设为横轴（红色荧光，125/1,024流式通道），FL1设为纵轴（绿色荧光，475/1,024流式通道）。以45°角绘制门控，以排除细胞碎片信号。
   4. 设置运行限制，以指示何时停止数据采集。每份样本在进行精子凋亡、MMP和SCSA分析时，均需总计分析10,000个精子细胞。
   5. 根据细胞数量设置流速（慢、中、快，或自定义流速）。
      注意：对于SCSA分析，为确定精子浓度，需将冷冻的原始样本解冻后在流式细胞仪（FCM）上运行。若流速>250/秒，则需将样本稀释至合适的流速。所有样本均需独立测量两次，并计算平均值。每测量10–15个样本后，需检测一次参考样本，以确保仪器在不同日期间的标准化和稳定性。
   6. 设置阈值，以从细胞样本中排除碎片和噪声。将这些设置应用于实验中的所有样本。
   7. 如有需要，设置颜色补偿以校正荧光溢出。
   8. 在将样本加载到流式细胞仪之前，轻轻反复吹打混匀，命名样本后开始运行。
   9. 所有样本运行完毕后，将样本数据保存为FCS文件，并命名以便后续软件分析。可选择性地保存当前实验的工作模板，供未来实验调用。

5. 数据分析

1. 将数据导入流式细胞仪的数据分析软件中（参见材料表）。
2. 双击工作区中的第一个样本，等待图形窗口打开，显示FSC与SSC参数下各事件的散点图。创建一个门控区域，圈定精子群体，从而从原始事件集中生成一个“子代”群体。
3. 在门控区域内双击，打开一个新的仅包含精子事件的图形窗口。设置x轴和y轴参数以选择荧光通道。
4. 选择门控工具，点击图中区域以显示门控，使所创建的门控分离出不同的细胞群体。
5. 右键单击（或按住Control键单击）任意高亮显示的行，选择复制分析至分组，将门控策略树应用于该分组内的所有样本。
6. 保存并导出数据表格。

结果

图2展示了使用Annexin V-FITC/PI染色法检测精子凋亡。FITC信号（绿色荧光）在FL1通道中检测，PI信号（红色荧光）在FL2通道中检测。在Annexin V/PI双变量分析中，象限标记可识别出四种不同的精子群体。结果以各亚群所占百分比表示：Annexin V⁻/PI⁻精子（活细胞）、Annexin V⁺/PI⁻精子（早期凋亡细胞或凋亡细胞）、Annexin V⁺/PI⁺精子（晚期凋亡细胞）和Annexin V⁻/PI⁺精子（坏死细胞）^16,17（图2B）。同时使用阴性对照（未染色的精子细胞）进行补偿调节和象限设定（图2A）。

图3展示了使用JC-1探针检测人精子线粒体膜电位（MMP）的结果。MMP百分比通过分析流式细胞图中橙红色荧光与（绿色加橙红色）荧光的比值来表示。高质量的精液样本通常显示较强的橙红色荧光和较弱的绿色荧光（活性线粒体，左上象限）（图3A）。相反，低质量的精液样本通常表现为较弱的橙红色荧光和较强的绿色荧光（非活性线粒体，右下象限），这可能与线粒体功能受损有关（图3B）。

图4展示了SCSA^13,14的数据。这些典型的SCSA细胞流式图来自两个独立样本。样本A来自一名生育能力正常的男性，样本B来自一名不育男性。流式细胞术数据使用FlowJo软件进行分析。细胞流式图显示了SCSA数据各组分的来源。横轴（红色荧光，具有1,024级红色荧光强度）表示断裂的DNA；纵轴（绿色荧光，具有1,024级绿色荧光强度）表示天然DNA的染色能力。纵轴y = 750处的虚线代表正常精子的边界。位于y = 750线以上的精子具有部分未凝聚的染色质，被判定为未成熟精子。

图1：通过流式细胞术检测精子功能损伤生物标志物的工作流程。 精液样本的获取和预处理如方案步骤1所述。（1）细胞制备，（2）荧光试剂染色，（3）流式细胞术分析与数据解读。缩写：MMP = 线粒体膜电位；SCSA = 精子染色质结构分析；PBS = 磷酸盐缓冲液；AO = 吖啶橙。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：使用 Annexin V-FITC/PI 染色法检测精子凋亡的代表性结果。 左下象限为 Annexin V⁻/PI⁻ 精子（存活或活细胞），右下象限为 Annexin V⁺/PI⁻ 精子（早期凋亡细胞或凋亡细胞），右上象限为 Annexin V⁺/PI⁺ 精子（晚期凋亡细胞），左上象限为 Annexin V⁻/PI⁺ 精子（坏死细胞）。(A) 阴性对照（未染色的精子细胞）；(B) 一份存在精子凋亡的样本。缩写：FITC = 异硫氰酸荧光素；PI = 碘化丙啶。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：使用 JC-1 探针测定线粒体膜电位。（A）高 MMP 的精子亚群。（B）低 MMP 的精子亚群。将 FL1-A 和 FL2-A 分别设为横轴（绿色荧光）和纵轴（橙红色荧光）。缩写：MMP = 线粒体膜电位。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：利用精子染色质结构分析法检测人精子DNA损伤。 （A）具有正常染色质结构的精液样本。（B）具有高比例染色质结构异常精子的精液样本。使用FlowJo软件对识别出的细胞群体设置门控，包括：1）正常精子，2）HDS精子，3）DFI精子，以及4）细胞碎片，并计算HDS和DFI精子的百分比。缩写：SCSA = 精子染色质结构分析法；HDS = 高DNA染色能力；DFI = DNA断裂指数。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

人类精子的染色质完整性、线粒体膜电位（MMP）以及凋亡情况已被证实为预测生殖结局的重要指标。最新发布的《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》（第六版）也强调了其中部分指标（染色质完整性和凋亡）的重要性，将其列为常规参数（如精子数量）基本检查之外的扩展检测项目¹⁸。近期的研究文献还表明，这些指标对外部有害暴露的反应可能更为敏感，提示其在更早阶段识别生殖损伤方面具有潜在应用价值^19,20。将这些指标与常规检查相结合，可能有助于更全面地了解精子功能障碍的特征以及人群中男性生殖损伤的复杂性。

使用流式细胞术（FCM）进行精子分析的成功与否在很大程度上取决于几个关键因素。首先，精子线粒体膜电位（MMP）和凋亡的检测必须在精液液化后立即进行。为尽量减少操作时间，可由两名技术人员分别同时处理同一样本的MMP和凋亡分析的预处理步骤。由于凋亡分析的预处理步骤较为简单，其进入流式细胞术检测阶段的速度将快于MMP分析。对于精子染色质结构分析（SCSA），新鲜精液样本应在液化后立即进行冷冻保存。精子样本随后可长期储存在液氮中，无需立即检测。

因此，实验的现场耗时可压缩至40分钟，即线粒体膜电位（MMP）分析与精子流式细胞分析步骤所需时间的总和。第二，在流式细胞分析平台中，每批样品需单独设定设门（gating）策略。可选择在散点图中细胞亚群清晰的精子样本作为参考，用于划定设门区域。第三，由于本实验各项指标尚无广泛认可的临床参考值，历史检测结果可作为质量控制的重要依据。建议在每批检测中均设置阳性和阴性对照，尤其是对于精子染色质结构分析（SCSA）和线粒体膜电位（MMP）检测。

此处提供的精子分析代表性结果是使用 Accuri C6 获得的。然而，该技术经过轻微修改后也可应用于其他商业平台。通常，总共需要 5 × 10⁶ 个精子细胞，以满足所有指标检测的要求。如果某个样本的精子浓度远低于平均水平，则所需精液体积将相应增加。

与常规精液参数类似，人类精子的染色质完整性、线粒体膜电位（MMP）以及凋亡情况也存在明显的个体内变异²¹。因此，对不同时间采集的样本进行多次检测，可能更准确地评估精子功能损伤水平。尽管世界卫生组织（WHO）未对流式细胞术分析前的禁欲时间提出明确建议，但可采用常规精液分析所推荐的2-7天射精禁欲期。这有助于提高不同实验室之间以及同一男性不同样本之间检测结果的可比性。

该方法的一个主要局限性在于，所检测的三种生物标志物中有两种——即细胞凋亡和线粒体膜电位——需要使用新鲜精液样本。这可能会限制该方法在无法向实验室提供精液样本的男性中的应用。对于DNA损伤检测（SCSA），应在实验前制备参考样本，以校准流式细胞仪。需要注意的是，本实验方案的应用要求实验室配备流式细胞仪（FCM），尽管在某些地区可选择与第三方服务机构合作作为替代方案，但对许多临床实验室而言，这仍然是一个相当大的挑战。

此外，染料和其他试剂的费用对于可能需要进行检测的男性而言也是一项经济负担。最后，如果使用不同品牌或型号的流式细胞仪来检测这些生物标志物，则该实验方案可能需要相应调整。总之，本文介绍了一种利用单一流式细胞仪评估人类精子损伤三种生物标志物的实用方法，该方法可为男性生殖健康提供有价值的信息，并补充常规精液检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 柠檬酸缓冲液	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	251275-5G	将 21.01 g/L 一水柠檬酸（分子量 = 210.14；0.10 M）加入 1.0 L H2O 中。可在 4 °C 下保存数月。
0.2 M Na2PO4 缓冲液	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	V900061-500G	将 28.4 g 磷酸氢二钠（分子量 = 141.96；0.2 M）加入 1.0 L H2O 中。可在 4 °C 下保存数月。
10 mM CCCP 储存液	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	C2759	将 20.46 mg CCCP 加入 10.0 mL DMSO 中，配制成终浓度为 10 mM 的 CCCP 溶液，分装后于 −80 °C 保存。
10 µM CCCP 工作液			取 10 mL PBS 加入 15 mL 聚丙烯离心管中，再加入 10 μL CCCP 储存液，配制成终浓度为 10 µM 的 CCCP 溶液。
1 mM JC-1 储存液	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	T4069	JC-1 以冻干粉形式购得。向瓶中加入少量 DMSO，涡旋数分钟直至染料完全溶解。将溶液转移至避光管中，并用适量 DMSO 冲洗原瓶，合并后配制成终浓度为 1 mg/mL 的 JC-1 溶液，分装后于 −20 °C 保存 。
37 °C 培养箱	Thermo Scientific, USA
5 µM JC-1 工作液			取 10 mL PBS 加入 15 mL 聚丙烯离心管中，加入 50 μL 解冻后的 JC-1 储存液，轻轻搅拌以确保均匀稀释。该溶液必须避光保存并尽快使用。
Accuri C6 流式细胞仪	BD Pharmingen, San Diego, CA, United States
酸性溶液，pH 1.2			将 20.0 mL 2.0 N HCl（0.08 N）、4.39 g NaCl（0.15 M）和 0.5 mL Triton X-100（0.1%）溶于 H2O 中，定容至 500 mL。用 5 mol/L HCl 调节 pH 至 1.2。
吖啶橙（AO）储存液，1.0 mg/mL	Polysciences, Inc, Warrington, Pa	65-61-2	将色谱纯化的 AO 溶于 dd-H2O，配制成 1.0 mg/mL 的溶液。
AO 染色液（工作液）			每 100 mL 染色缓冲液中加入 600 μL AO 储存液。
生物安全柜	Airtech, USA
计算机辅助精子分析系统（CASA）	Microptic, Barcelona, Spain		Sperm Class Analyzer 5.3.00
精子计数板	Goldcyto, Spain
仪器
FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 I	BD Biosciences, San Jose, CA	556547	包含：（1）FITC Annexin V：浓度为 100 ng/µL；（2）碘化丙啶（PI）：PI 染色液由 50 µg PI/mL 溶于 PBS（pH 7.4）中组成，经 0.2 µM 滤膜无菌过滤；（3）10x 结合缓冲液：含 0.1 M Hepes（pH 7.4）、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。配制 1x 工作液时，将 1 份 10x Annexin V 结合缓冲液与 9 份蒸馏水混合。4 °C 保存，避免长时间暴露于光线下。切勿冷冻。
FlowJo 10	Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA
水平离心机	Thermo Scientific, USA
液氮罐	Thermolyne, USA
材料
PBS	Beyotime, Shanghai, China	C0221A	即用型 PBS 缓冲液，购入后室温保存
染色缓冲液，pH 6.0			将 370 mL 0.10 M 柠檬酸缓冲液、630 mL 0.20 M Na2PO4 缓冲液、372 mg EDTA（二钠盐，分子量 = 372.24；1 mM）和 8.77 g NaCl（0.15 M）混合，在搅拌器上过夜搅拌，确保 EDTA 完全溶解。用饱和 NaOH 溶液调节 pH 至 6.0。
SCSA 分析用参考样品			将参考样品用冷（4 °C）TNE 缓冲液稀释至工作浓度为 1–2 × 106 个细胞/mL，用于设定流式细胞仪绿色通道为 475/1,024，红色通道为 125/1,024。
TNE 缓冲液，1x，pH 7.4（工作液）			将 60 mL 10x TNE 与 540 mL H2O 混合。检测 pH（7.4）。
TNE 缓冲液，10x，pH 7.4	Perfemiker, Shanghai, China	PM11733	即用型缓冲液，购入后于 4 °C 保存。