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方法文章

水凝胶阵列可提高三维肿瘤模型中基质组分与治疗药物筛选的通量

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DOI：

10.3791/63791

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2022年6月16日

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1University of California Los Angeles

本文内容

摘要

本实验方案描述了一种用于评估机械和生化信号对患者来源的胶质母细胞瘤细胞在三维基质模拟培养中化疗反应影响的实验平台，该平台采用定制的紫外光照装置，可实现具有可调机械特性的水凝胶的高通量光交联。

摘要

细胞与基质的相互作用通过生化、力学和几何信号介导复杂的生理过程，影响病理变化及治疗反应。在药物研发早期阶段纳入基质效应，有望提高新型治疗药物的临床成功率。目前已存在基于生物材料的策略，可在三维细胞培养中模拟特定组织微环境，但将其与主要用于药物筛选的二维培养方法整合仍具挑战性。因此，本文所述方案详细介绍了在多孔板格式中构建微型化生物材料基质内三维培养的方法，以促进其与现有药物筛选流程及常规细胞活力检测的整合。由于维持培养细胞中临床相关表型的关键基质特征预期具有高度组织特异性和疾病特异性，因此需要对基质参数进行组合筛选，以确定特定应用的适宜条件。本文所述方法采用微型化培养体系，评估癌细胞对基质力学性能和配体呈递正交变化的响应。具体而言，本研究展示了利用该平台探究基质参数对患者来源的胶质母细胞瘤（GBM）细胞化疗反应的影响。

引言

在过去十年中，研发一种新药的预期成本持续上升，目前估计超过10亿美元1。这部分支出可归因于进入临床试验阶段的药物较高的失败率。2019年，仅有约12%的候选药物最终获得美国食品药品监督管理局（US Food & Drug Administration, FDA）的批准。许多药物因出现未预料到的毒性而在I期试验中失败2，而另一些通过安全性试验的药物则可能因缺乏疗效而失败3。这种因无效而导致的淘汰率，部分原因在于药物研发过程中所使用的癌症模型在预测临床疗效方面众所周知地不可靠4。

功能差异 体外 和 体内 模型的局限性可能源于将肿瘤细胞从其天然微环境中剥离，包括非肿瘤细胞和物理性细胞外基质（ECM）5,6通常，研究团队会使用市售的培养基质，例如Matrigel（一种源自小鼠肉瘤的蛋白质性基底膜基质），为培养的肿瘤细胞提供三维基质微环境。与二维培养相比，膜基质中的三维培养显著提高了临床相关性 体外 结果7,8然而，来源于脱细胞组织（包括膜基质）的培养生物材料通常表现出批次间的变异性，可能影响实验的可重复性9此外，来源于与所研究组织不同组织起源的肿瘤的基质可能无法提供适当的生理信号10最后，具有高度瘤内异质性的癌症，其微环境特征在亚微米尺度上存在差异，而膜基质无法调节以重现这些特征。11.

胶质母细胞瘤（GBM）是一种致死率极高的脑肿瘤，中位生存期约为15个月，其治疗手段的开发尤为困难12,13。目前GBM的标准治疗方案包括原发肿瘤切除，随后进行放疗，再使用替莫唑胺（TMZ）进行化疗14。然而，超过一半的临床GBM肿瘤通过多种机制表现出治疗耐药性15,16,17。预测个体患者治疗方案的有效性极为困难。用于预测个体疗效的标准临床前模型通常将患者来源的肿瘤细胞原位移植到免疫缺陷小鼠体内。尽管患者来源的异种移植模型能够再现临床GBM肿瘤的许多特征，且在临床前研究中具有重要价值18，但其本身成本高昂、通量低、耗时长，并涉及伦理问题19。患者来源细胞的培养，无论是生长在二维塑料表面还是以类球体形式存在，大多可避免上述问题。尽管患者来源的细胞能够保留 遗传异常，但其在二维培养或悬浮类球体中的生长模式在很大程度上并不能很好地模拟患者来源的啮齿类动物异种移植模型及原始患者肿瘤20。此前，我们及其他研究者已证明，在模拟脑组织力学和生化特性的三维细胞外基质（ECM）中培养的GBM细胞能够维持药物耐药表型10,21,22,23。

透明质酸（HA）是一种在脑细胞外基质（ECM）中大量存在的多糖，在胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤中也呈过表达，其与CD44受体之间的相互作用可调节肿瘤细胞在体外获得耐药性的能力in vitro21,24,25,26,27。 例如，在柔软的三维培养体系中加入HA可增强来源于患者的GBM细胞获得治疗耐药性的能力。这种机械响应性依赖于HA与GBM细胞表面CD44受体的结合21。此外，整合素与含有RGD序列的肽段结合（该肽段被引入三维培养基质中），会以基质刚度依赖的方式增强CD44介导的化疗耐药性21。除HA外，多种细胞外基质蛋白的表达在正常脑组织与GBM肿瘤之间存在差异，其中许多蛋白含有RGD区域28。例如，一项研究报道，在GBM肿瘤中有28种不同的ECM蛋白表达上调29。在这种复杂的肿瘤基质微环境中，癌细胞整合机械信号与生化信号，从而产生特定的耐药表型，而该表型依赖于杨氏模量或整合素结合肽密度的微小差异（例如，不足一个数量级的变化）28,29,30。

本实验方案旨在表征肿瘤细胞如何响应基质信号的独特组合，并识别促进治疗耐药性的复杂且具有患者特异性的基质微环境（图1A）。通过一种光化学方法制备微型化且精确调控的三维培养基质，可实现大范围正交变量空间的构建。为提高自动化程度与可重复性，本研究集成了一套由微控制器驱动的定制化LED阵列，用于在384孔板体系中对水凝胶进行光交联。通过在孔内调节光照强度，改变所形成水凝胶的微机械性能，并利用原子力显微镜（AFM）进行评估。尽管本文未重点介绍照明阵列本身的构建过程，但仍提供了电路图（图1B）和材料清单（材料表），以辅助设备的复制与重现。

本报告展示了在独特的三维微环境中快速生成胶质母细胞瘤（GBM）细胞阵列的方法，其中杨氏模量（跨越一个数量级的四个水平）和整合素结合肽含量（来源于四种不同的细胞外基质蛋白）被正交调控。该方法进一步用于研究水凝胶力学性能以及细胞外基质特异性整合素结合对患者来源的GBM细胞在获得对替莫唑胺（TMZ）化疗耐药过程中存活和增殖能力的相对影响。

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方案

患者来源的胶质母细胞瘤细胞系（GS122 和 GS304）由我们的合作者 David Nathanson 教授提供，这些细胞系是在获得加州大学洛杉矶分校机构审查委员会批准的方案（IRB# 10-000655）下建立的。所提供的细胞已去标识化，因此无法将细胞系与特定患者个体关联。

1. 水凝胶溶液的制备

  1. 通过将 HEPES 粉末以 20 mM 浓度溶解于 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，制备 HEPES 缓冲液。在完全溶解后，将 pH 值调节至 7。
  2. 在 HEPES 缓冲液中溶解巯基化透明质酸（HA，标称分子量为 700 kDa，参见材料表），该物质根据先前报道的方法制备31，使每个葡萄糖醛酸上的羧基有 6%–8% 被巯基修饰，并将浓度调整为 10 mg/mL 的缓冲液溶液。
    注意：建议使用棕色瓶，以避免环境光导致巯基氧化。
    1. 在室温下使用磁力搅拌器（转速 <1,000 rpm）搅拌，直至完全溶解，通常约需 45 分钟。
  3. 在 HA 溶解的同时，分别在微量离心管中制备以下四种溶液：（1）8-臂-PEG-降冰片烯（20 kDa）100 mg/mL 溶液，（2）4-臂-PEG-巯基（20 kDa）100 mg/mL 溶液，（3）半胱氨酸或含半胱氨酸的肽（例如 GCGYGRGDSPG）4 mM 溶液，以及（4）LAP 4 mg/mL 溶液（参见材料表）。
    1. 使用步骤 1.1 中制备的 HEPES 缓冲液配制上述四种溶液。涡旋振荡各溶液，确保在进行步骤 4 前每种试剂完全溶解。
      注意：若测试多种不同的肽，每种肽必须含有半胱氨酸或其他巯基来源，以满足该偶联化学反应的要求。
    2. 在此阶段，制备所有拟固定于单一水凝胶中的肽溶液（终浓度为 4 mM 可用巯基）。
      注意：本研究中所用的肽序列及其来源的细胞外基质蛋白列于表 1。N-乙酰半胱氨酸（参见材料表）是一种细胞不结合的物质，可替代具有生物活性的含巯基肽，用于滴定黏附性肽的浓度或作为阴性对照31。
  4. 将 HA、PEG-降冰片烯、PEG-巯基以及半胱氨酸/含巯基肽的单独溶液混合（参见材料表），以达到表 2中所列最终水凝胶基质的终浓度。在磁力搅拌器上搅拌（转速 <1,000 rpm）至少 30 分钟，确保充分混合。
    ​注意：HA 溶液黏度较高，最好使用正向置换移液器操作（参见材料表）。若无正向置换移液器，也可使用标准微量移液器配合宽口吸头缓慢移液来分装黏稠溶液。

2. 水凝胶的光照与光交联 通过 一个LED阵列

警告：佩戴防紫外线护目镜，并用吸收紫外线的材料覆盖照明区域。

注意：本方案中描述的LED阵列由六组串联的八个LED组成，如所提供的电路图所示（图1A）。每组LED可独立供电，从而可在每次运行中实现最多六种不同的辐照度。补充文件1 包含与以下操作步骤相对应的截图，以提供进一步指导。

  1. 从以下位置下载照明装置.zip 文件： 补充编码文件. 该目录包含以下文件：Arduino.zip（补充编码文件 1），Drivers.zip（补充编码文件 2），GUI.zip（补充编码文件 3）和 Holder.zip（补充编码文件 4).
    注意：3D 打印用于固定电路板的顶部和底部部件（参见 补充编码文件 详情请参见）。
  2. 下载并安装微控制器软件（参见 材料表).
  3. 下载并安装图形用户界面软件（参见 材料表）。参考 补充文件 1 软件操作说明。
  4. 开放 处理 并安装 controlIP5 库 通过 点击 草图 > 导入库 > 添加文库然后，在文库中搜索 controlIP5 并点击 安装首次执行此操作。
  5. 接通照明装置电源（参见 材料表使用36伏电源供电，并通过微型USB线缆连接至计算机。
    注意：某些设备不会为各种 Arduino Nano 开发板自动安装驱动程序。设备压缩文件中提供了一组驱动程序。
  6. 使用 Arduino IDE 打开位于 Adruino.zip 文件夹中的 Arduino.ino 文件。
  7. 点击编译 Arduino.ino 文件 对勾标记 按钮。通过点击上传已编译的代码 箭头 按钮
  8. 使用 Processing 打开位于 GUI.zip 文件夹中的 GUI.pde 文件。
  9. 点击 运行 在处理程序中启动用于控制照明设备的图形用户界面。
  10. 在图形用户界面窗口中，单击 强度 用于交联含有水凝胶前体溶液的柱子，并输入所需的光强。点击 时间 方框中输入所需时间。对于提供的溶液 表2，这将是15秒。
    注意：最终用户需要使用辐射计将数字强度值校准为辐照度。典型强度示例见于 图2A.
  11. 将样本与照明装置对齐（图2B）与硅胶模具中单列的每个其他LED相连（参见 材料表）或 384 孔板。点击 完成 开始光照。根据需要重复此过程，以对多张载玻片或384孔板中的其他孔进行光照。
    注意：该支架的设计使得在光照过程中，384孔板与内腔的一个角落齐平放置。
    1. 光照后，当置于一个角落时，将培养板移至下一个角落并重复操作。为照射培养板另一半的孔，需将培养板从支架中取出并旋转 180°.
  12. 按照以下步骤制备具有不同力学性能的水凝胶，用于力学表征。
    1. 使用胶带清洁载玻片和硅胶模具，去除碎屑。将硅胶模具粘附到载玻片上，按压以确保密封良好，并排除任何气泡。
    2. 移液器 80 µL 将按步骤1.4制备的水凝胶前体溶液加入载玻片上每个硅胶模具中。
    3. 将玻璃载玻片放置在照明装置上，使其与单列中每隔一个的LED对齐。按照步骤2所述，将水凝胶前体暴露于紫外光下照射15秒，以实现光交联。
    4. 光照停止后，取出载玻片，用细头工具沿模具内缘划线，使凝胶与模具分离10 µL 移液器吸头、30 G针头等）。用镊子或钳子取出硅胶模具。
    5. 将交联水凝胶转移至12孔板的各个孔中，操作时需润湿刮刀，轻轻将其从玻片上推下。每孔加入2 mL DPBS（参见 材料列表在添加水凝胶之前，将凝胶在DPBS溶液中溶胀至少12小时（通常为过夜），于室温下进行（以备次日进行力学性能表征）。

3. 原子力显微镜（AFM）测量

  1. 根据制造商的说明（参见材料表）开启原子力显微镜（AFM）。本方案提供了使用该仪器及相关软件的简要说明。
  2. 安装 AFM 探针（参见材料表）。
    注意：在本研究中，使用了一个标称弹性常数为 0.01 N/m 的三角形氮化硅悬臂，其顶端修饰有一个直径为 2.5 µm 的二氧化硅微球。
  3. 安装完成后，将激光对准三角形探针的尖端，然后调节镜面和激光偏转，以最大化信号总和（通常在 1.5–2.2 伏特之间）。
  4. 将探针浸入 DPBS 中，并等待最多 15 分钟以达到热平衡。点击校准按钮，选择接触依赖型校准。点击采集热调谐按钮，在数据采集完成后，选择约 3 kHz 处的峰值进行校准。
    注意：由于折射率的变化，探针浸入液体后可能需要轻微调整镜面和激光偏转器。
  5. 通过将接近参数设置为恒定速度、目标高度为7.5 µm、接近速度为15 µm/s，使探针接近培养皿（塑料）表面。启用每次运行进行基线测量以实现接近，以确保接近过程持续进行，不会因偏转器漂移而提前停止。
  6. 接近表面后，设置力图谱采集参数：回转力为 4 nN，压入距离为 2 µm，速度为 1 µm/s，接触时间为 0 s。按下开始按钮，开始在塑料表面（例如孔板）上采集力曲线。
  7. 返回校准窗口，选择对应于探针与塑料接触及压入阶段的力曲线部分。接受软件计算出的灵敏度和探针刚度值，完成校准。
  8. 校准完成后，升起 AFM 探针，放置待检测的水凝胶样品。按照步骤 5 提供的设置接近水凝胶表面。
    注意：在接近水凝胶表面的过程中，仪器可能错误地触发“已接近”状态。为验证实际接近情况，请按照步骤 6 采集一条力曲线。如果所得曲线未显示接触及后续压入，则重复接近操作。
  9. 当表面接近成功后，切换至力图谱模式，并将采集参数设置为 8 × 8 点阵，每轴长度为 40 µm。在不同区域获取力图谱，以评估刚度测量的均匀性。
    1. 使用软件JPK SPM Data Processing对力曲线进行解析，采用赫兹/斯内登（Hertz/Sneddon）模型拟合（公式 1 和公式 2，所有变量定义见表 3），并选择球形几何构型32,33,34。
      接触力计算公式，用于机械应力分析。   公式 132
      静态平衡公式 δ=(a/2)ln[(Rs+a)/(Rs-a)]；用于科学分析的方程。   公式 232

4. 三维基质包埋培养物的建立与药物处理

  1. 将所需细胞制备成单细胞悬液。
    注意：不同类型的细胞可能需要不同的传代方法。有关从T-75培养瓶中传代GBM类球体悬浮培养物的典型方案，请参见参考文献31。
  2. 将GBM类球体（直径约150 µm）从T-75培养瓶的悬浮培养物中收集至15 mL锥形管中。用5 mL DPBS冲洗培养瓶，以去除残留的细胞和培养基，并将冲洗液加入锥形管中。
  3. 在室温下以200 x g离心5分钟。离心后，用5 mL移液管小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后用5 mL DPBS重悬细胞。
  4. 在室温下以200 x g再次离心5分钟以洗涤细胞。用5 mL移液管小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于2 mL细胞解离试剂中（见材料表）。
  5. 在室温下孵育10–15分钟。加入3 mL完全培养基（见材料表），轻轻吹打3–5次，使类球体解离为单细胞悬液31。
  6. 将单细胞悬液在室温下以400 x g离心5分钟，使细胞沉淀（单细胞悬液可适当提高转速以促进沉淀形成）。用5 mL移液管小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于1 mL完全培养基中。
    注意：若传代后细胞仍以团块形式存在而非单细胞悬液，可通过40 µm细胞筛网过滤以获得单细胞悬液。
  7. 取部分细胞用于血细胞计数板计数。用台盼蓝将该部分细胞稀释两倍，台盼蓝可进入膜完整性受损的死细胞。仅计数存活的无色细胞。通常，每T-75培养瓶接种80万细胞，培养一周后可收获200–300万细胞。
  8. 确定包封所需的细胞数量。将含有所需总细胞数的培养基转移至无菌1.7 mL微量离心管中，在室温下以400 x g离心5分钟使细胞沉淀。
    注意：例如，若需以250万细胞/mL的密度包封细胞，则至少需要将250万细胞重悬于1 mL凝胶体积中。1 mL凝胶体积可分配为100个凝胶液滴，每个液滴体积为10 µL。建议额外准备约20%体积的细胞-水凝胶前体混合液，以补偿移液过程中的损失。因此，在本例中应准备300万细胞和1.2 mL水凝胶前体溶液。推荐最低细胞密度为50万细胞/mL。
  9. 用微量移液器小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于步骤1.4中配制的水凝胶前体溶液中，使用1000 µL移液器上下吹打4–5次，充分混匀。
  10. 将细胞悬液装入可调重复移液器（见材料表），设定每次分配体积为10 µL。为避免气泡和分配不均，先向废液容器中额外排液1–2次以预润洗移液器。
  11. 在384孔板的每个孔中，使用重复移液器分配10 µL含细胞的水凝胶溶液。使用LED阵列照射每个含细胞的孔（步骤2），照射时间为15秒，光强设置如下（示例结果见图2A，所用光强分别为1.14、1.55、2.15、2.74 mW/cm2），以获得所需的力学性能。
    注意：建议每个实验条件设置5个重复，随后可根据终点检测的通量需求和变异程度调整重复数量。
  12. 向每个含细胞的孔中加入40 µL完全培养基。向非实验用的干燥孔中加入50 µL DPBS，以减少蒸发造成的培养基损失。
  13. 对于GBM细胞，在包封后第3天开始，向含细胞的孔中加入40 µL含药物的培养基（如TMZ，见材料表），以达到最终所需浓度（10 µM–100 µM，溶于二甲基亚砜（DMSO）或相应载体DMSO）。

5. CCK8 增殖实验

  1. 向每个含有细胞的孔中加入 10 µL CCK8 试剂（参见 材料表）。
    注意：如果首次进行此实验，应设置阴性对照孔，例如仅含培养基或不含细胞的水凝胶置于培养基中。
  2. 根据制造商说明书，在 1–4 小时内孵育。
    注意：孵育时间可能因细胞类型和密度而异，因此需针对每种应用测试孵育时间，以确保吸光度值处于线性范围内，这是应用比尔定律35的前提条件。
  3. 孵育结束后，在 450 nm 波长下读取所有孔的吸光度。
  4. 计算每组中对照处理条件下第 3 步测得的 450 nm 吸光度平均值。将每孔药物处理组的吸光度值除以对应组别的对照组平均值。
  5. 通过百分位法生成自举分布（N = 10,000），计算置信区间36。
    注意：通常可采用 95% 置信区间，若某处理条件的置信区间不跨越 1，则认为具有显著性，值得进一步研究。将置信区间设为 95% 相当于设定显著性阈值 p = 0.05。对于结果中展示的数据，有必要区分促进或抑制基质介导药物耐药性的条件，因此需要进行双侧分析。

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结果

原子力显微镜（AFM）测量结果证实，在使用定制的、由Arduino控制的LED阵列进行光交联时，可通过调节紫外光辐照强度（mW/cm2）精确调控水凝胶的力学性能（图2A）。本实验方案所用水凝胶的配方见表2。所提供的模板上LED的间距与384孔板每隔一个孔的间距相匹配，从而可在孔板内形成凝胶（图2B）。对单个水凝胶表面微米级区域进行AFM检测表明，平均杨氏模量较软的水凝胶，其模量变化范围也比较硬的水凝胶更小（图2C-E）。

应针对每种细胞类型通过实验确定可使细胞存活率最大化的接种密度。本研究显示，将GS122细胞以2,500,000个细胞/mL的密度接种，在培养7天后其存活率显著高于以500,000个细胞/mL密度接种的细胞（图3A

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讨论

本研究介绍了一种在基于透明质酸（HA）的水凝胶中生成三维微型化细胞培养体系的方法，同时可调控基质刚度以及可用于整合素结合的多肽种类。该技术能够以更高的通量系统性地研究基质参数对细胞表型的影响（例如，癌细胞在化疗药物暴露下的存活能力）。以往的方法（包括本文所述方法）通常通过改变终产物中总聚合物的百分比来调节水凝胶的刚度，其中较硬的水凝胶具有更高的聚合物含量21,31。然而，这种方法需要为每种目标刚度单独配制独特的水凝胶配方，本质上降低了实验通量。本文通过在交联过程中调节紫外光辐照强度来调控水凝胶刚度，从而能够从单一前体溶液获得多种不同刚度的水凝胶。未来的研究者若无法构建本文所述的定制化光照装置，可轻松替换为市售的紫外点固化设备，并在对多孔板不同区域进行固化时调整光照条件。使用市售点固化设备的缺点是通量低于定制化光照装置。当前方法的一个局限性在于，仍需为每种多肽条件单独配制溶液。此前已有其他研究组采用类似方法制备含刚度梯度的水凝胶37,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者特别感谢Carolyn Kim、Amelia Lao、Ryan Stoutamore和Itay Solomon在光凝胶方案早期版本开发中的贡献。GS122和GS304细胞系由David Nathanson慷慨提供。所有插图均使用BioRender.com制作。加州大学洛杉矶分校（UCLA）核心设施、分子筛选共享资源平台以及纳米与皮米表征实验室对本研究工作起到了关键作用。陈家俊（Chen Chia-Chun）得到了加州大学洛杉矶分校Eli和Edythe Broad再生医学与干细胞研究中心培训项目的支持。Grigor Varuzhanyan得到了美国国立卫生研究院肿瘤细胞生物学培训项目基金（T32 CA 009056）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.1 kOhm 电阻器，6 WDigikey35601k1ft
1.7 mL 微量离心管Genesse Scientific21-108
15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyltpl-c034uvh365
384 孔板Bio Greiner One781090
40 µm 细胞筛MTC bioC4040
四臂硫醇封端聚乙二醇（20 kDa）Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 个 NPN 双极结型晶体管（BJT）Digikey2n5550ta
80 Ohm 电阻器，0.125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
八臂降冰片烯封端聚乙二醇（20 kDa）Jenkem TechnologyA7025-1
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104500 细胞解离 试剂
AFM 探针Novascan标称弹簧常数 0.01 N/m，2.5 µm SiO2 颗粒
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P 微控制器板
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
离心机Thermoscientificsorvall legend xtr
CP100STGilsonF148415正置换移液器吸头
Cubis 半微量天平SartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
无钙无镁 DPBSGenesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/mL
无水乙醇Fisher ScientificA405P加入去离子水稀释至 70%
Fisherbrand B 级棕色螺口玻璃瓶Fisher Scientific03-339-23C
Fisherbrand 称量纸Fisher Scientific09-898-12B
G21 补充剂Gemini Bio400-16050x
Hanks 平衡盐溶液Thermo Fisher Scientific14175095
HCl，ACS 级，12 MSigma AldrichS25838A加入去离子水稀释至 1 M
来自猪肠黏膜的肝素钠盐Sigma AldrichH3149-100Ku25 µg/mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
热风枪WagnerHT1000
整合素结合唾液酸蛋白（IBSP）肽GenscriptCustom OrderGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
光引发剂锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰二磷（LAP），>95%Sigma Aldrich900889-1G
磁力搅拌器Thermo ScientificSP194715
微量离心机Thermo ScientificSorvall legend micro 21R
Microman E 单通道移液器GilsonFD10004正置换移液器
移液器吸头Various Manufacturs多种规格
mLine 移液器Sartorious
N-乙酰半胱氨酸Sigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4Bruker原子力显微镜（AFM）
NaOHFisher Scientificss255-1加入去离子水稀释至 1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
骨桥蛋白肽GenscriptCustom OrderGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
手动移液控制器Drummond4000102
普通显微镜载玻片Globe Scientific1301
Press-To-Seal 硅胶隔离器，直径 12-4.5 mm × 深度 2 mmGrace Bio Labs664201-A裁剪后可从单张膜上制备 8 个独立模具
ProcessingProcessing3.5.4
Repeater M4Eppendorf4982000322
重复移液器吸头Sartorious300894301 mL 规格
RGD 肽GenscriptGCGYGRGDSPG
透明胶带
移液管Genesse Scientific12-102,12-1045,10 mL 移液管
焊锡膏Digikey315-NC191LT15T5-ND
焊锡丝
直头解剖镊VWR Scientific82027-408
Synergy H1 微孔板读板仪Biotek
T-75 细胞培养处理烧瓶Genesee Scientific25-209
替莫唑胺Sigma AldrichT2577通常使用浓度为 10 µM 至 100 µM
腱生蛋白-C 肽GenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
巯基化透明质酸（700 kDa），修饰度 6-8%Lifecore BiomedicalHA700K5
VWR 旋涡搅拌子，微型VWR58948-375

参考文献

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