本实验方案描述了一种利用全骨髓贴壁法分离和培养人下颌骨骨髓来源的间充质干细胞的高效方法。通过细胞增殖实验、流式细胞术以及多向分化诱导对培养的细胞进行了鉴定。
本文内容
摘要
摘要
人源间充质干细胞（hMSCs）在骨组织再生、免疫调节以及难治性慢性疾病治疗方面展现出巨大潜力。近年来已发现多种获取hMSCs的来源，但骨髓仍被认为是主要来源。来自不同供体骨部位的骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）因微环境因素而具有不同的生物学特性。研究表明，来自颌面骨的BMSCs可能比来自长骨或髂嵴的BMSCs具有更强的增殖能力和成骨潜能。因此，颌面骨来源的BMSCs被认为更适用于颌面组织的干细胞治疗。下颌骨，尤其是升支区域，骨髓含量充足，是获取BMSCs的可行供区。本研究描述了一种获取、分离和培养人下颌骨骨髓来源间充质干细胞（hmBMSCs）的实验方案。此外，还包括对hmBMSCs进行免疫表型分析、增殖能力检测以及 体外 成骨、成脂及成软骨分化诱导实验用于鉴定培养的细胞。采用该方案可帮助研究人员成功获得足量高质量的人骨髓间充质干细胞（hmBMSCs），这对于进一步研究其生物学功能、微环境影响及临床应用至关重要。
引言
人源间充质干细胞（hMSCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，可分化为中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，内胚层来源的肝细胞和胰腺细胞，以及外胚层来源的神经细胞1。因此，hMSCs 在组织再生领域展现出巨大的应用潜力。此外，hMSCs 具有强大的免疫调节功能，能够调控宿主组织的微环境，有效治疗多种慢性难治性疾病2。因此，hMSCs 已被广泛应用于临床研究中的细胞治疗。由此可见，以简便、高效的方式获得足量且高质量的 hMSCs 显得尤为重要。
自从首次在骨髓中发现人源间充质干细胞（hMSCs）以来，人们已找到多种其他MSCs来源，例如脂肪组织、滑膜液、骨骼肌、羊水、子宫内膜、牙源性组织以及脐带1,3。然而，骨髓仍是大多数临床前和临床研究中hMSCs的主要来源，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）也被视为比较其他来源MSCs的参照标准4。多年来，髂嵴或长骨（胫骨和股骨）一直是获取骨髓最常用的解剖部位1,5。然而，与颌面部骨骼相比，髂嵴和长骨具有不同的胚胎起源和发育模式5,6。大量临床、实验室及发育生物学研究表明，不同来源的BMSCs表现出部位特异性特征，且移植后的BMSCs在受体部位仍保留供体部位的特性5,6,7,8,9。从发育起源的角度来看，上颌骨、下颌骨、牙本质、牙槽骨、牙髓和牙周韧带等颌面部组织完全起源于神经嵴细胞；而髂嵴和长骨则由中胚层发育形成。此外，下颌骨通过膜内成骨方式形成，而中轴骨和附肢骨骼则通过软骨内成骨方式发育。而且，一些临床研究显示，与髂嵴和长骨相比，颌面部骨髓来源的hMSCs具有更强的细胞增殖活性和分化潜能6,8。因此，来源于颌面部区域的BMSCs有望成为颌面部组织再生及颌面部慢性难治性疾病治疗的更优选择。
下颌骨由两层致密的皮质骨构成，中间含有松质骨骨髓，从而能够承受咀嚼时产生的力量。因此，在颅颌面外科手术中，下颌骨尤其是下颌升支区域，通常被用作获取自体骨移植材料的供区10。在下颌骨矢状劈开截骨术和下颌角缩小成形术等手术中，常需去除部分下颌骨的皮质骨和松质骨，以获得理想的面部轮廓。这些被废弃的松质骨可能成为间充质干细胞（hMSCs）的潜在来源。然而，目前鲜有研究报道快速分离并培养高质量人下颌骨髓来源间充质干细胞（hmBMSCs）的技术方案。
本研究采用改良的全骨髓贴壁法，建立了一种可靠且可重复的人下颌骨髓间充质干细胞（hmBMSCs）分离与培养方案。通过间充质干细胞的流式细胞术免疫表型分析、增殖能力检测以及多向分化诱导实验对所获得的干细胞进行鉴定。应用该标准化操作流程，有助于研究人员获得高质量的人下颌骨髓来源间充质干细胞，对于进一步研究其生物学功能、微环境影响及临床应用具有重要意义。
方案
采集人类下颌骨标本的程序已获得第四军医大学口腔医学院伦理委员会批准。本研究遵循1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则。所有供体均被告知本研究可能存在的风险及研究目的。供体年龄范围为18至40岁，无性别偏向。所有人类参与者均签署了书面知情同意书。
1. 手术准备
- 选择合适的供体。
- 选择计划接受如下手术的患者作为供体：下颌后退术（经矢状劈开下颌支截骨术）和下颌角缩小整形术。
- 准备保存液。
- 于手术前一天，在无菌且无酶的50 mL离心管中，将30 mL磷酸盐缓冲液（1× PBS）添加1%青霉素和链霉素。于4 °C冰箱中保存。
- 在手术当天，将装有保存液的离心管放入冰盒，并于手术前1小时带入手术室。
- 于手术前一天对用于分离骨髓的器械（包括剪刀、镊子和刀具）进行灭菌处理，条件为120 °C、0.27 MPa压力下维持20分钟。
- 通过将α-最低必需培养基（α-MEM）与10%胎牛血清（FBS）及1%青霉素和链霉素混合，配制α-MEM培养基 。
- 通过将α-MEM培养基与50 mM抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸钠和0.1 mM地塞米松混合，配制成骨诱导分化培养基（见材料表）。
- 通过将α-MEM培养基与1 mM地塞米松、0.2 mM吲哚美辛、10 µg/mL胰岛素和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）混合，配制脂肪诱导分化培养基A（见材料表）。
- 通过将α-MEM培养基与10 µg/mL胰岛素混合，配制脂肪诱导分化培养基B。
- 通过将高糖改良杜尔贝科必需培养基（HG-DMEM）与100 nM地塞米松、100 µg/mL丙酮酸钠、25 mg/mL维生素C、40 mg/mL脯氨酸、10 ng/mL转化生长因子-β3（TGF-β3）以及1% ITS混合，配制软骨诱导分化培养基（见材料表）。
注：上述成骨、脂肪和软骨诱导分化培养基可自行配制。但在本研究中使用了 commercially available kits（见材料表）。
2. 获取人类下颌骨标本
- 手术前，仔细研究供体的三维计算机断层扫描图像及手术模拟规划（图1）。
- 选择供体计划在手术中切除且富含松质骨及骨髓的下颌部位作为取骨部位。
- 手术操作前对患者进行消毒并铺巾。
- 使用超声骨刀刀片（见材料表）切除选定的下颌骨供区，避免损伤下牙槽神经及供体骨结构。
- 尽快将下颌骨标本放入保存液中（步骤1.2）。
- 将含有骨标本的保存液置于冰盒中，直至在实验室开始间充质干细胞（MSCs）的分离。
注意：为保持细胞活性，应在获取组织后尽快开始MSCs的分离。若无法立即进行分离，含有骨标本的保存液可在冰盒中或4 °C条件下冷藏保存，最长不超过2小时。
3. 人骨髓间充质干细胞的分离与培养
- 从保存液中取出骨组织样本，在超净工作台的生物安全柜中用含1%青霉素和链霉素的1×PBS浸泡5分钟。
注意：此步骤旨在清除血凝块和残留的口腔液体，并进一步消除微生物，因为口腔并非完全无菌的环境。在细胞分离与培养前，需用酒精清洗并消毒双手，佩戴一次性无菌手套和口罩。 - 使用无菌湿纱布清洁骨表面附着的软组织和血渍。
- 向一个6 cm的无菌培养皿中加入5 mL α-MEM培养基。
- 将骨组织放入无菌培养皿中，用灭菌的刀或剪刀将其切成小块（体积约为2–3 mm3）。
注意：使用镊子夹持骨组织样本，以避免手指割伤。 - 用1 mL一次性无菌注射器抽吸培养皿中的α-MEM培养基。
- 将含有α-MEM培养基的注射器针头深入松质骨组织块的骨髓腔内。
- 从骨组织块的各个侧面反复冲洗骨髓至培养皿中，每侧至少冲洗5–10次。
- 重复步骤3.5–3.7，直至所有骨组织块变为纯白色，以确保尽可能多的骨髓被冲洗至培养基中。
注意：上述步骤3.1–3.8的总操作时间需控制在冰上30分钟以内。 - 用镊子移除并丢弃所有骨组织块，再使用孔径为70 µm的细胞滤网去除其他细小碎片。
- 轻轻摇动培养皿，使冲洗出的细胞均匀分布。
- 将培养皿放入细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2的湿化气氛中进行培养。
- 培养第3天，在光学显微镜下观察细胞形态和生长状态，移除未贴壁的细胞和组织碎片所在的半量培养基，并加入3 mL新鲜α-MEM培养基。
- 培养第7天，更换全部培养基，加入5 mL新鲜α-MEM培养基。
- 此后每3天更换一次α-MEM培养基。
- 每天观察细胞形态和生长情况。
注意：当原代细胞培养物（P0）在培养7–10天后达到70%–80%融合度时，进行细胞传代。
4. 细胞传代
- 当P0代细胞融合度达到70%-80%时，移除培养皿中的全部培养基。用1×PBS轻轻洗涤培养皿两次，以清除残留的培养基。
- 向培养皿中加入1 mL含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞。轻轻晃动培养皿，确保胰蛋白酶均匀分布。将培养皿置于37 °C孵育3分钟。
- 在显微镜下观察细胞，当70%-80%的细胞收缩变圆时，加入2 mL α-MEM培养基以终止消化反应。
- 用移液器轻柔吹打培养皿表面数次，使细胞脱落。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g 离心5分钟。
- 弃去上清液，用α-MEM培养基重悬细胞沉淀。按1:2的传代比例将P0代细胞接种于培养瓶（25 cm²）中进行扩增。第一次传代后的细胞称为P1代细胞。
- 当P1代细胞融合度达到70%-80%时，按照步骤4.1–4.6重复传代操作。第二次传代后的细胞称为P2代细胞。
- 从第三代细胞传代开始，将扩增传代比例调整为1:3。
- 使用P3至P5代细胞进行鉴定实验。
5. 流式细胞术分析
- 使用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化P3至P5代MSCs，操作步骤参照4.1–4.5。
- 弃去上清液，将细胞重悬于1× PBS中，浓度为1 × 106 个细胞/mL。
- 将细胞悬液按每管100 µL分装至微量离心管中。
- 向微量离心管中加入免疫标记的小鼠抗人单克隆抗体。
注：本研究中使用了藻红蛋白（PE）标记的抗CD45抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD90、CD34和CD44抗体4,11（见材料表），所有抗体稀释比例均为1:100。抗体稀释比例应遵循生产商说明书。以PBS作为对照。 - 将抗体及PBS对照在室温避光条件下孵育30分钟。
- 在室温下以800 × g 离心5分钟，弃去上清液，加入0.5 mL 1× PBS重悬细胞，重复此步骤两次。
- 将样品管上机进行流式细胞仪检测（见材料表），使用流式细胞仪检测荧光标记细胞数量，每样本至少采集10,000个事件。
注：建议在免疫荧光标记完成后立即开始流式细胞仪检测。若无法立即检测，需将细胞固定于1%多聚甲醛中，于4 °C避光保存，并在24小时内完成检测。
6. 细胞增殖实验
- 使用P3代细胞进行细胞增殖实验。按照步骤4.1-4.5，用0.25%胰蛋白酶消化P3代间充质干细胞（MSCs）。
- 弃去上清液，并用α-MEM培养基重悬细胞。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以每孔3 × 103个细胞的密度将细胞接种至96孔培养板中，共接种35孔，每个计数时间点（第1、2、3、4、5、6、7天）各5孔。每3天更换一次细胞培养基。
- 在每个计数时间点，弃去对应5个孔中的α-MEM培养基，然后每孔加入100 µL新鲜培养基和10 µL CCK-8溶液（参见材料表）。在37 °C孵育1小时。
- 将培养板放入酶标仪（参见材料表）中，于450 nm波长下测定每个时间点5个孔的光密度值（共7个时间点）。以不含细胞的5孔培养基作为空白对照。
- 记录每孔的光密度值，计算每个时间点5个孔的平均值及标准差，并绘制细胞生长曲线5,12。
7. 多向分化
- 按照以下步骤进行成骨分化诱导。
- 使用胰蛋白酶消化P3代细胞，步骤参照4.1–4.5。以2 × 105 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于6孔板中，每孔加入2.5 mL α-MEM培养基。
- 当细胞融合度达到60%–70%时，更换为成骨诱导培养基（步骤1.5），之后每3天更换一次诱导培养基。
- 诱导后每隔3天在显微镜下观察细胞，注意细胞形态变化，并观察是否有明显的矿化结节形成。
- 诱导7天后，进行碱性磷酸酶（ALP）染色，以评估细胞钙化情况。
- 用1× PBS轻柔洗涤细胞两次，加入4%多聚甲醛于室温固定30分钟，再用1× PBS洗涤细胞两次。
- 加入ALP染色液（见材料表），室温孵育10分钟。
注意：不同类型的ALP染色液可使细胞呈现不同颜色，如深灰色、红色或蓝色。本方案中细胞染成蓝色。若染色不明显，可适当延长孵育时间。某些ALP染色试剂可能具有毒性，使用前请仔细阅读说明书，实验过程中佩戴手套和口罩，使用后彻底洗手。 - 用去离子水洗涤细胞以终止ALP染色反应，在光学显微镜下观察细胞内蓝色色素颗粒，并拍照记录。使用Image J软件对染色程度进行定量分析。
- 进行茜素红染色（见材料表），以评估细胞的矿化能力。
注意：分化细胞通常在诱导21天后可见明显的矿化结节形成。 - 用1× PBS轻柔洗涤细胞两次，然后加入4%多聚甲醛于室温固定30分钟。
- 用1× PBS洗涤细胞两次，加入0.1%茜素红染色液（见材料表），孵育20分钟，再次用1× PBS洗涤细胞两次。
- 在光学显微镜下观察固定细胞间的红色结节，这些结节代表培养细胞成骨分化的钙盐沉积，并拍照记录。
- 为定量分析茜素红染色量，向茜素红染色的细胞中加入10%十六烷基吡啶氯化物（CPC，见材料表），室温孵育30分钟。
- 吸取50 µL CPC溶液，使用酶标仪在540 nm波长下测定吸光度（OD）。
- 进行成脂分化诱导。
- 按照上述步骤（步骤7.1）将P3代细胞接种于6孔板中。
- 当细胞融合度达到80%–90%时，更换为成脂分化培养基A（步骤1.6）。
- 将细胞置于37 °C、含5% CO2 的湿润环境中，用成脂分化培养基A孵育3天。
- 将诱导培养基更换为成脂分化培养基B（步骤1.7），继续孵育1天。
- 再换回成脂分化培养基A孵育3天，随后更换为培养基B孵育1天。重复此循环3–5次，直至显微镜下可见脂滴。
注意：脂滴通常在诱导约21天后可见。 - 使用成脂分化培养基B继续培养细胞7天，此时可在显微镜下观察到较大且圆形的脂滴。每3天更换一次培养基B。
- 移除诱导培养基，用1× PBS轻柔洗涤细胞，然后加入4%多聚甲醛于室温固定10分钟。
- 用1× PBS洗涤细胞两次，加入油红O染色液（每孔1 mL，见材料表）孵育15分钟，再次用1× PBS洗涤细胞两次。
- 将细胞置于显微镜下观察红色脂滴，以评估分化细胞的成脂情况。
- 进行软骨分化诱导。
- 消化P3代细胞并转移至15 mL离心管中，细胞数量为5 × 105 个。
- 于室温下以250 × g 离心4分钟，小心倾去上清液。
- 向离心管中加入0.5 mL软骨分化培养基（步骤1.8），重悬细胞，再于室温下以150 × g 离心5分钟。重复此步骤两次。
- 松开离心管盖以利于气体交换，将离心管放入培养箱中，在37 °C、含5% CO2 的湿润环境中，用0.5 mL软骨分化培养基进行诱导。
- 在24或48小时内保持离心管稳定，避免移动或振荡，直至细胞开始形成细胞团。轻弹离心管底部，使细胞团重新悬浮于分化培养基中（步骤1.5）。
- 每3天用移液器更换软骨分化培养基，注意避免吸走细胞团。
- 至少诱导21天，直至细胞团直径增至2 mm。
- 用1× PBS洗涤细胞团，4%多聚甲醛固定30分钟。经脱水及石蜡包埋13 后，使用切片机（见材料表）将细胞团切成3 µm厚的切片。
- 将切片置于载玻片上，加入阿利新蓝染色液（见材料表），37 °C孵育1小时，用去离子水洗涤染色后的切片。在光学显微镜下观察切片中呈蓝色的酸性黏多糖，其为软骨组织的标志，并拍照记录。
结果
成功从患者下颌骨采集了骨组织样本。从使用超声骨刀切割至将骨碎片放入离心管的时间约为5分钟。在切除手术过程中及术后均未发生任何潜在并发症，包括下牙槽神经或牙根损伤、感染、血管破裂出血、黏膜损伤、意外性骨骨折等。人下颌骨间充质干细胞（hmBMSCs）成功进行了培养、传代和分化，且无污染发生。
本研究中，初次培养后的第3天在显微镜下可见大量贴壁细胞。第7天时，大多数贴壁细胞已牢固附着于培养皿表面。通常情况下，培养的细胞在初次培养7–9天后达到70%–80%的融合度。传代后，P3代细胞通常被认为是纯化的间充质干细胞（MSCs），其呈现纺锤形、贴壁生长、成纤维细胞样形态（图2）。细胞鉴定实验在P3至P5代细胞中进行。细胞增殖检测显示，细胞生长速率从培养第3天起迅速增加，至第6天时增速减缓（图2）。
根据国际细胞治疗学会的定义，间充质干细胞（MSCs）对特定表面分子具有阳性和阴性表达特征。本研究中，培养细胞的流式细胞术分析显示CD44和CD90呈阳性表达，CD45和CD34呈阴性表达，符合该定义4,11 （图3）。在多向分化能力实验中，培养细胞表现出较强的成骨、成脂和成软骨分化能力。成骨诱导7天后，显微镜下可见细胞外基质出现钙盐沉积；成骨诱导21天后，培养细胞形成明显的矿化结节，经茜素红染色后呈红色（图4）。成脂诱导21天后，细胞质内可见大量圆形脂滴聚集，经油红O染色呈红色（图4）。成软骨诱导21天后，细胞团切片显示形成类似软骨组织的结构，并可见软骨陷窝，经染色后呈蓝色（图4）。
图1：基于三维CT图像的供区部位选择。（A）一名21岁女性患者的下颌骨供体三维CT图像。（B）下颌支双侧矢状劈开截骨术的手术模拟。（C）手术规划显示劈开后的下颌骨后退位置。（D）三维CT图像显示皮质骨（半透明部分）、富含骨髓的松质骨以及根据不同CT值识别出的下牙槽神经（红色），可为外科医生选择供区部位并避免神经损伤提供指导。松质骨碎屑取自黑色矩形区域。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：第3代人下颌骨来源骨髓干细胞（hmBMSCs）的显微形态及生长曲线。（A-C）第3代hmBMSCs呈纺锤形、贴壁生长、成纤维细胞样形态（比例尺：A为200 µm，B为100 µm，C为50 µm）。（D）细胞生长曲线显示，hmBMSCs在培养第3天起生长速度迅速增加，至第6天时增长速率减缓。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过流式细胞术检测hmBMSCs的细胞表面抗原表达。 流式细胞术分析显示，hmBMSCs对CD45（A）和CD44（C）呈阴性，对CD44（B）和CD90（D）呈阳性。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：hmBMSCs的成骨、成脂和成软骨分化。 （A）未进行成骨诱导培养7天后的hmBMSCs碱性磷酸酶（ALP）染色结果（比例尺 = 100 µm）。（B）成骨诱导培养7天后的hmBMSCs ALP染色结果（比例尺 = 100 µm）。（C）ALP染色阳性区域的定量结果（***P < 0.001）。（D）未进行成骨分化的hmBMSCs茜素红染色结果（比例尺 = 100 µm）。（E）hmBMSCs经21天成骨诱导后可见明显的矿化结节形成，并可被茜素红染成红色（比例尺 = 100 µm）。（F）茜素红染色的定量结果（***P < 0.001）。（G）未进行成脂分化的hmBMSCs油红O染色结果（比例尺 = 50 µm）；（H）hmBMSCs经21天成脂诱导后可见圆形脂滴，油红O染色呈红色（比例尺 = 50 µm）。（I）成软骨诱导21天后阿利新蓝染色呈阳性（比例尺 = 50 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
近年来，人源间充质干细胞（hMSCs）疗法在组织再生以及多种难治性疾病（如免疫功能紊乱疾病、全身性血液系统疾病、癌症或创伤）的治疗中，已在大量临床试验中展现出巨大前景1,14,15,16,17。在间充质干细胞（MSCs）的多种来源中，骨髓仍是目前应用最广泛且最容易获取的来源。本研究采用人下颌骨松质骨碎片，通过本方案所述的全骨髓贴壁法成功培养出骨髓间充质干细胞（BMSCs）。迄今为止，从骨髓中分离干细胞主要有四种方法，包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、荧光细胞分选法和磁激活细胞分选法10。全骨髓贴壁法操作简便、成本低廉，且可获得大量贴壁细胞。然而，该方法的局限性在于原代培养的BMSCs纯度较低，常混有造血细胞和成纤维细胞。通过定期更换原代细胞的培养基，非贴壁的造血细胞可随弃去的培养基被清除；同时，成纤维细胞也可通过传代培养逐步去除，至第3代（P3）细胞时可获得高度纯化的BMSCs。因此，P0至P2代细胞不能用于细胞治疗，意味着需要额外的时间完成干细胞的纯化。采用荧光细胞分选法和磁激活细胞分选法可获得更高纯度的BMSCs，但这两种方法成本较高，且较长的筛选过程可能影响细胞活力11。为证实所培养的细胞确为MSCs，我们参考了国际细胞治疗学会（ISCT）间充质与组织干细胞委员会提出的人源MSCs定义标准，该标准包括：贴壁生长特性、特定表型标志物（如CD45、CD90等）的阳性与阴性表达，以及多向分化潜能18。
在大多数研究中，股骨和髂嵴是骨髓间充质干细胞（BMSCs）的主要来源，而相比之下，颌面骨（如下颌骨和上颌骨）则较少被使用9,16。然而，近年来关于人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）具有部位特异性特征的理论表明，来自不同骨骼的hBMSCs在分化能力、增殖活性、成骨能力及免疫调节特性方面存在差异6,8。这种部位特异性差异可能与不同骨骼的胚胎起源、对各自骨骼部位功能需求的适应性、局部微环境、血管供应、激素影响等因素有关。此外，研究显示，在植骨术后6个月内，移植的髂骨比颌骨出现更快速的垂直向骨量吸收8。另一方面，研究发现，来自下颌骨骨髓的间充质干细胞（MSCs）的增殖活性优于来自髂骨骨髓的MSCs5,8,19,20。这种增殖活性的差异归因于下颌骨相比髂骨具有更丰富的血液供应和更快的骨转换速率5,6,8。研究还发现，来自下颌骨的BMSCs中Runx-2和OCN的表达水平高于来自股骨的BMSCs，且下颌骨来源的BMSCs的成骨能力等于或高于股骨和髂骨来源的BMSCs5,19,21。此外，人下颌骨BMSCs（hmBMSCs）对钛材料的黏附能力也强于股骨来源的BMSCs，提示hmBMSCs更适用于口腔种植领域5。另外，一项为期3年的临床研究在修复牙槽骨缺损时发现，牙髓来源MSCs再生的骨组织为结构致密、基质密度更高的完全致密骨，而hmBMSCs再生的骨组织则为类似于正常人牙槽骨结构的松质骨22。综上所述，由于具有相同的胚胎起源以及更优越的生物学特性，hmBMSCs是用于颌面组织再生及其他疾病治疗的理想干细胞来源。
然而，下颌骨的骨髓含量少于股骨和髂骨，因此为临床应用获取足够的下颌骨骨髓及骨髓间充质干细胞（BMSCs）显得尤为重要。人体髂骨穿刺可获得大量骨髓用于分离间充质干细胞（MSCs）。研究人员也曾采用下颌骨穿刺获取MSCs，但下颌骨穿刺初始获得的MSCs数量仅为髂骨穿刺的三分之一21。为收集足够量的下颌骨骨髓穿刺物，需额外进行切口，从而增加手术创伤。此外，研究显示，来源于下颌骨骨碎片的MSCs增殖潜能可能优于来源于下颌骨骨髓穿刺物的MSCs8,21。因此，本研究利用被丢弃的下颌骨松质骨碎片来分离MSCs。由于矢状劈开升支截骨术或下颌角缩小成形术通常涉及下颌骨双侧，我们可在不造成额外损伤的情况下从患者获取足够的下颌骨骨髓。近年来，计算机辅助技术已广泛应用于口腔颌面外科，以提高手术效果并减少手术并发症23。为避免在获取下颌骨骨髓过程中损伤下颌骨及神经，本研究获取了供体下颌骨的三维CT图像，并对供体手术方案进行分析，以确定取材部位并实施手术模拟，从而避免了所有手术并发症的发生。此外，研究中还使用了超声骨刀刀头——一种组织特异性设备，可使外科医生在保护邻近软组织的同时进行精确的骨切割24，以避免软组织损伤并保持所获取骨髓的活性。
总之，本研究描述了一种可靠、简便、安全且经济的方案，用于分离和培养足够数量的人下颌间充质干细胞，这些细胞可用于牙科和颌面组织的细胞治疗。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（编号：81903249）和陕西省自然科学基础研究计划（编号：2019JQ-701，2022JZ-50）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | PlantChemMed | PC-00005 | |
| 成脂分化培养基 | OriCell, Cyagen Biosciences | HUXMX-90031 | |
| 阿利新蓝溶液 | OriCell, Cyagen Biosciences | ALCB-10001 | |
| 酒精 | Macklin | e809056 | |
| 茜素红染色液 | Solarbio | G1452 | |
| 碱性磷酸酶（ALP）染色液 | 北京索莱宝科技有限公司 | CW0051S | |
| 高压灭菌器 | ALP Co., Ltd., Japan | CL-40L | |
| CCK-8 溶液 | 翊圣生物科技（上海）有限公司 | 40203ES80 | |
| 细胞滤器（70 μm 孔径） | BD Biosciences | 352350 | |
| 细胞培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 41334177 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5805ZP761456 | |
| 离心管（50 mL，15 mL） | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | F600888-9001 | |
| 氯化十六烷基吡啶 | 阿拉丁 | H108696 | |
| 成软骨分化培养基 | OriCell, Cyagen Biosciences | HUXMX-90041 | |
| 超净工作台/层流柜 | BIOBASE | BBS-DDS00030 | |
| 培养皿（6 cm） | Thermo | 150462 | |
| 培养瓶（25 cm²） | Thermo | 156367 | |
| 培养板（96 孔，6 孔） | Corning-Costar | 352350 | |
| 一次性无菌手套和口罩 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | F516018-9001;F516038-9001 | |
| 一次性无菌注射器（1 mL） | 陕西龙康鑫医疗器械有限公司 | 1.00009E+11 | |
| 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（HG-DMEM） | Hyclone | SH30022.01B | |
| EDTA | Solarbio | E8040-500g | |
| 胎牛血清（FBS） | PlantChemMed | PC-00001 | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | EPICS XL | |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人 CD34 单克隆抗体 | Biolegend | 343503 | |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人 CD44 单克隆抗体 | Biolegend | 338804 | |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人 CD90 单克隆抗体 | Biolegend | 328108 | |
| 血细胞计数板 | Koraba | 30119480698 | |
| 冰盒 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | F615002-0001 | |
| Image J 软件 | 美国国家心理健康研究所 | ||
| 光学显微镜 | OLYMPUS | IX71-2L20944 | |
| 微量离心管 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | F601620-0010 | |
| 酶标仪 | BioTek-EPOCH | 259091 | |
| 切片机 | Feica | 1003001 | |
| Mimics 软件 | Materialise | ||
| 最低必需培养基 α 液（α-MEM） | Hyclone | SH30265.01 | |
| 油红 O 染色液 | Solarbio | G1261 | |
| 成骨分化培养基 | OriCell, Cyagen Biosciences | HUXMA-90021 | |
| 青霉素和链霉素 | PlantChemMed | PC-86115 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | PlantChemMed | PC-00003 | |
| 藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人 CD45 单克隆抗体 | Biolegend | 304008 | |
| 移液器 | SORFA | 320511 | |
| ProPlan CMF 3.0 | Materialise | ||
| 剪刀、镊子和刀具 | 上海金钟手术器械有限公司 | ZJA030,YAA110,J11010 | |
| 无菌湿纱布 | 河南飘安集团有限公司 | ||
| 胰蛋白酶 | Gibco | 17075029 | |
| 超声骨刀刀片 | Stryker Instruments | 5450-815-107 |
参考文献
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