在此，我们提供了一种高效价重组新城疫病毒的制备、纯化与定量的详细操作流程。该方案可稳定获得 > 6 × 109 每毫升噬斑形成单位，提供适用于病毒定量的合适数量 体内 动物实验。为确保安全性而进行的额外质量控制检测 体内 已描述。
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摘要
摘要
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），也称为禽副粘病毒血清型1（avian orthoavulavirus serotype-1），是一种负链单股RNA病毒，已被开发为溶瘤病毒和病毒载体疫苗。由于其成熟的反向遗传学系统、强大的免疫刺激特性以及优异的安全性，NDV成为一种具有吸引力的治疗和预防制剂。当作为溶瘤病毒或病毒载体疫苗使用时，NDV可引发强烈的抗肿瘤或抗原特异性免疫反应，激活免疫系统的先天性和适应性免疫应答。
鉴于这些理想的特性，新城疫病毒（NDV）已在多项临床试验中得到评估，是研究最为深入的溶瘤病毒之一。目前，有两项注册的临床试验涉及NDV：一项评估基于重组NDV载体的SARS-CoV-2疫苗（NCT04871737），另一项评估表达白细胞介素-12（Interleukin-12）的重组NDV与抗PD-L1抗体Durvalumab联合使用的疗效（NCT04613492）。为了推动这一极具前景的病毒载体的进一步发展，亟需建立简便的方法以制备高滴度、适用于体内实验（in vivo-grade）的重组NDV（rNDV）。
本文描述了一种在无特定病原体（SPF）鸡胚中扩增重组新城疫病毒（rNDV）并从尿囊液中纯化rNDV的详细步骤，其中包含若干改进措施以减少纯化过程中的病毒损失。同时提供了推荐的质量控制检测方法，用于确认病毒制品无污染物且具有完整病毒结构。总体而言，该详细操作流程可实现高滴度、 体内-级、重组型、低毒力型和中等毒力型新城疫病毒（NDV），用于临床前研究。
引言
新城疫病毒（Newcastle Disease Virus），也称为禽副粘病毒-1型（Avian Orthoavulavirus-1），是一种有包膜的禽副粘病毒，具有作为溶瘤病毒或病毒载体疫苗的潜力1,2,3,4,5,6,7。最近，经基因工程改造表达SARS-CoV-2刺突蛋白的NDV已在小鼠和仓鼠攻毒模型中被证实是一种有效的鼻内疫苗7,8,9。当用作癌症免疫治疗时，该病毒可诱导天然免疫细胞（特别是自然杀伤细胞）的募集、I型干扰素的产生以及抗肿瘤特异性T细胞的生成10,11,12,....
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方案
所有涉及动物使用的实验均经加拿大动物护理委员会认可的圭尔夫大学动物护理委员会批准。所有实验均在加拿大生物安全二级（BSL2）实验室中进行，其中中等毒力新城疫病毒（mesogenic NDV）属于第二类风险病原体。为确保安全性和无菌性，新城疫病毒（NDV）扩增与纯化的所有步骤均须在IIA型生物安全柜内操作。
1. 使用无特定病原体的鸡胚扩增新城疫病毒
- SPF 鸡胚接种
注意：通常使用八打 SPF 鸡胚来制备一批适用于 in vivo 的新城疫病毒（NDV）。建议额外订购一至两打鸡蛋，以弥补运输过程中的破损以及胚胎存活率的个体差异。鸡胚属于生物材料，应按照机构规定进行操作。但由于胚胎不会孵化，因此无需获得机构动物护理委员会的批准。- 收到 SPF 鸡胚后，将其置于 37 °C、60% 湿度的孵卵器中孵育 9 天。确保孵卵器设置为每小时自动 rocking/旋转一次。
注意：鸡蛋可在室温下保存最多 24 小时，或在 4 °C 下保存最多 72 小时；但这些操作可能会降低胚胎的存活率。 - 孵育 8–11 天后（理想时间为第 9 天），对鸡蛋进行照卵以判断胚胎活力。观察是否存在网状血管系统（图 1A）以及胚胎运动，作为胚胎存活的指标。丢弃缺乏这些特征的鸡蛋（
- 收到 SPF 鸡胚后，将其置于 37 °C、60% 湿度的孵卵器中孵育 9 天。确保孵卵器设置为每小时自动 rocking/旋转一次。
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结果
收集尿囊液
在从鸡胚中收集尿囊液时，液体应呈清澈透明状。如果液体浑浊发黄，则表明存在污染物。在纯化过程中若混入此类尿囊液，会导致纯化压力迅速上升并超过10 psi，从而引起病毒剪切，导致感染性病毒丢失。若尿囊液呈血性，提示鸡胚接种的病毒PFU数量过多。该批鸡胚的病毒产量将显著低于预期，且该病毒很可能无法用于体内实验。接种弱毒株新城疫病毒（lentogenic NDV）的鸡胚在72小时后仍应可见明显的血管系统，且胚胎应保持存活，如图1所示。若血管系统消失或胚胎死亡，则提示胚胎可能已受到损伤或污染。
碘克沙醇密度梯度超速离心
超速离心后，应在10%与20%梯度之间观察到一条高滴度、白色、含有新城疫病毒（NDV）的条带（图4B）。
SDS-PAGE 凝胶的考马斯亮蓝染色
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讨论
用于临床前研究的治疗性病毒必须经过高度纯化，以避免给药时产生毒性 体内15若未能去除外源性因子或污染物，可能导致严重的不良反应，从而抵消病毒制剂的治疗效果28由于新城疫病毒（NDV）是在鸡胚中生产的，其中含有多种污染性卵蛋白（如卵清蛋白），在使用前必须将其去除。 体内 在临床前或临床模型中29即使经过充分纯化，卵清蛋白中仍会发现29去除这些污染蛋白是一个严格的过程，需要耗费大量时间和资源。15,22如果新城疫病毒（NDV）能够在基于细胞的系统中以足够高的滴度生产，以满足所需水平 体内 应用，这可能会简化纯化过程并改善新城疫病毒（NDV）向 临床环境中。然而，基于鸡蛋的溶瘤性新城病毒（NDV）生产已用于多项人体临床试验30........
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
J.G.E.Y 获得了安大略兽医学院博士奖学金和安大略省研究生奖学金。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金资助，授予 SKW（项目编号 #304737）和 LS（项目编号 #401127）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶 | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL 滑动式针头注射器 | BD | 309659 | |
| 10 mL 鲁尔锁式注射器 | BD | 302995 | |
| 10% 聚维酮碘溶液 | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G × 1 1/2 英寸钝头填充针 | BD | 305180 | |
| 18G × 1 1/2 英寸精密滑动针 | BD | 305196 | |
| 25G × 5/8 英寸针头 | BD | 305122 | |
| 2-巯基乙醇 | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% 多聚甲醛-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL 鲁尔锁式注射器 | BD | 309646 | |
| 96 孔组织培养板 - 平底 | Greiner Bio One | 655180 | |
| 冰醋酸 | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| 琼脂糖 | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 离心机 | Beckman Coulter | B08861 | |
| 过硫酸铵 | BioRad | 161-0700 | |
| 漂白剂 (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| 宽头无齿镊 | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate 夹具架 | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 培养箱 | Thermo-Fisher | ||
| 考马斯亮蓝 R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 细胞 | ATCC | CRL-12203 | |
| 饮食凝胶恢复剂 | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman 孵化器 | Berry Hill | 1502W | |
| D-甘露醇 | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| 验蛋灯 | Berry Hill | A46 | |
| 乙醇 (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液，pH 8.0，0.5 M 水溶液 | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| 尼龙材质，1/8 英寸 NPT(F) 内螺纹三通接头 | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 12483-020 | |
| 精细尖头高精度镊子 | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| 荧光显微镜 | ZEISS AXIO | 若不进行免疫荧光检测或NDV不编码荧光蛋白，则非必需 | |
| Freezone 4.5 冷冻干燥系统 | LABCONCO | ||
| GiBOX 凝胶成像系统 | Syngene | 琼脂糖凝胶成像 | |
| 甘油 | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| 甘氨酸 | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| 高糖 Dulbecco 改良必需培养基 | Cytiva | SH30022.01 | |
| 湿度套件 | Berry Hill | 3030 | |
| 碘克沙醇 | Sigma-Aldrich | D1556 | 水中 60% (w/v) 碘克沙醇溶液（无菌） |
| L-赖氨酸单盐酸盐 | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| 1/8 英寸国家管螺纹 NPT 鲁尔锁公母接头 | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S 数字驱动器 | Cole-Parmer | RK-07522-20 | 带数字显示的蠕动泵 |
| Masterflex 精密管用 L/S 易装泵头 | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex 硅胶管（铂金固化）L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | 生物制药级铂金固化硅胶 |
| MC Pro 5 梯度PCR仪 | Eppendorf | EP950040025 | |
| 甲醇 | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra 电泳槽 | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE 制胶与电泳装置 |
| 小鼠抗NDV抗体 | Novus Biologicals | NBP2-11633 | 克隆株 6H12 |
| 正常山羊血清 | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega 膜 LV Centramate 夹具，100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 超速离心机 | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A 小型凝胶电泳系统 | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X 溶液 | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| 聚乙二醇 平均分子量 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | 型号 1655050 - 用于琼脂糖凝胶电泳 | |
| Q5 高保真 2X 预混液 | New England Biolabs | M0492S | |
| QIAamp 病毒RNA小型提取试剂盒 | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer 透析夹具（高强度），10,000 MWCO，0.5–3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| 氢氧化钠（颗粒） | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| 无特定病原体鸡蛋 | CFIA | NA | 供应商因地区而异 |
| 蔗糖 | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 深层过滤器 | PALL | SC050V100P | |
| 手术剪 | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti 转子 | Beckman Coulter | 331362 | 用于实验步骤 2.3.1、2.3.6、2.3.7 |
| SX4750 转子 | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 圆底管适配器 | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| 超透明薄壁离心管 (9/16 英寸 × 3 1/2 英寸) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris 碱 | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| 管路螺钉夹 | PALL | 88216 | |
| 吐温 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| 通用压力表 | Cole-Parmer | 68355-06 |
参考文献
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. V....
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