从尿囊液中生产高滴度重组新城疫病毒

新城疫病毒，也称为禽原原病毒-1，是一种包膜性禽副粘液病毒，有可能用作溶瘤病毒或病毒载体疫苗^{1，2，3，4，5，6，7}。最近，设计用于表达SARS-CoV-2的刺突蛋白的NDV已被描述为小鼠和仓鼠挑战模型^7，8，9中的有效鼻内疫苗。当用作癌症免疫疗法时，它导致先天免疫细胞的募集，特别是自然杀伤细胞，产生I型干扰素，并产生抗肿瘤特异性T细胞^{10，11，12，13}。除了这些有效的免疫刺激特性外，NDV还具有很强的安全性，并且具有完善的反向遗传学系统^14，15。这些理想的特征促使在众多临床前和人体临床试验（NCT04871737，NCT01926028，NCT04764422）^16，17中评估NDV。为了进一步发展这种非常有前途的免疫刺激病毒载体，需要详细的方法来生产和纯化可以在 体内安全施用的高滴度超纯NDV。

由于NDV是一种禽副粘病毒，因此最常在胚胎鸡蛋中扩增。虽然有基于细胞的系统可用于繁殖NDV，但大多数系统无法产生类似于胚胎鸡蛋¹⁸中达到的滴度。然而，在鸡蛋中生产NDV存在一些缺点，包括基于鸡蛋的生产冗长且不易扩展，采购大量SPF鸡蛋可能会有问题，并且存在鸡蛋过敏原污染的可能性^{13，18，19，20}.最近，一组研究表明，在无血清培养基中悬浮液中生长的Vero细胞可以支持NDV的复制，其滴度与纯化²¹之前在鸡蛋中达到的滴度相当。然而，这需要病毒的连续传代以使病毒适应Vero细胞，并且仍然需要优化从悬浮液Vero细胞纯化NDV的方法²¹。

如前所述，用于纯化高滴度 体内级病毒的方法因问题²²中的病毒而异。有一个完善的反向遗传学系统可用于产生重组NDV。该过程涉及使用cDNA克隆，辅助质粒和表达T7 RNA聚合酶的帮助病毒，先前已详细描述^15，23。该方案可应用于致慢性或中源性 NDV。该方案中描述的病毒是一种重组中观NDV，编码来自 维多利亚 水母的绿色荧光蛋白（GFP），作为单独的转录单元插入病毒P和M基因之间，因为这以前被描述为外来转基因插入²⁴的最佳位点。

封闭的方法根据其大小（范围为100至500nm）和密度¹⁵概述了NDV的纯化。这使得从接收卵到最终滴度，在大约3周内产生 体内级高滴度的NDV储液。描述了大规模生产基于鸡蛋的病毒时经常使用的技术，例如切向流过滤，深度过滤和密度梯度超速离心，从而使这些方法能够转化为更大规模的生产。前面描述的用于纯化NDV的技术已经通过掺入病毒稳定缓冲液，在密度梯度超速离心期间使用碘克沙醇以及描述各种质量控制措施来确保 体内级质量¹⁵而得到改进。这使得 体内级NDV的纯化达到3×10 10 PFU / mL从0.8至^1.0L 的尿囊流体中达到3×PFU / mL。

所有涉及使用动物的工作均由圭尔夫大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会批准。所有工作均在加拿大的生物安全2级（BSL2）实验室进行，其中中胚层NDV是风险组2病原体。为了安全和无菌目的，NDV扩增和纯化所涉及的所有步骤都应在IIA型生物安全柜中进行。

1. 使用指定的无病原体胚胎鸡蛋扩增NDV

1. 接种SPF胚胎鸡蛋
   注意:通常，八打SPF胚胎化的鸡蛋用于产生一批 体内级NDV。订购一两打额外的鸡蛋，以应对运输过程中的损坏以及生存能力的可变性。胚胎鸡蛋是生物材料，应根据机构指南进行处理。但是，由于胚胎未孵化，因此不需要机构动物护理委员会的批准。
   1. 在接受SPF胚芽的鸡蛋后，在37°C，60%湿度的鸡蛋培养箱中孵育9天。确保孵化器设置为每小时自动摇动/旋转种蛋。
      注意:鸡蛋可以在室温下储存长达24小时或4°C长达72小时;然而，这可能会降低胚胎的活力。
   2. 孵化8-11天后（最好在第9天），蜡烛鸡蛋以确定胚胎活力。寻找网状脉管系统（图1A）和胚胎运动作为可行胚胎的指标。处理缺乏这些特征的卵子（图1B）。
   3. 在活卵上，用铅笔用"X"标记气囊和胚胎之间的界面（图1A）。确保该注射部位不会导致脉管系统穿孔。在准备接种物时将标记的鸡蛋放回孵化器。
   4. 计算注射所有SPF胚胎鸡蛋所需的病毒量。确保每个卵子接受100 PFU的病毒，体积为100μL;将病毒在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释至1×10³ PFU / mL的浓度。准备额外的20%的接种物，以解决病毒给药的不准确之处。
   5. 使用抗静电擦拭，用10%碘溶液清洁标记的鸡蛋的顶部，用70%乙醇稀释。等待约1-2分钟，使溶液干燥。
   6. 用一对无菌的锋利镊子小心地刺穿贝壳。在鸡蛋之间用70%乙醇消毒镊子。
   7. 使用1mL注射器和25G针头，将步骤1.1.4中制备的100μL接种物注射到绒毛膜腔中（图1C）。用针头以接近卵子90°的角度接近。将针头插入绒毛膜的顶部。
   8. 接种后，使用指甲油覆盖穿刺部位并将卵放回孵化器。确保摇动设置开启，直到接种后24小时。
   9. 在接种后24小时检查卵子的活力。丢弃绒毛膜和胚胎运动中缺乏脉管系统的死卵（图1B）。
      注意:这些卵子由于接种过程而死亡，而不是由于NDV。
   10. 将鸡蛋放回孵化器，摇杆设置为 OFF，以防止鸡蛋蛋白污染尿囊液。
   11. 按照步骤1.1.9所述，每12-24小时检查一次卵以识别死卵。将接种后24小时后死亡的卵子移动到4°C，以尽量减少自溶。在冷却2-12小时内收获尿囊液。
   12. 将卵孵育至少72小时。
       注意:如果繁殖NDV的中观菌株，最佳孵育时间为60-72小时，因为由于尿囊液的透明度降低，孵育时间延长会损害纯化过程。在繁殖慢发性NDV菌株时，这个问题并不那么重要，因为它们需要更长的时间才能杀死胚胎。
   13. 在适当的孵化期后，将剩余的卵移动到4°C2-12小时，然后收获尿囊液。
2. 收获含有 NDV 的尿囊液
   1. 将冷冻鸡蛋移入生物安全柜中。用70%乙醇清洁鸡蛋的顶部。
   2. 使用无菌镊子和手术剪刀切开气囊所在的卵子的顶端。
   3. 取下外壳以显示绒毛膜（图1D）。
   4. 小心地刺穿膜并将其剥离以暴露异囊腔（图1E）。确保蛋黄囊不被意外刺穿，因为这会破坏鸡蛋。
   5. 使用钝镊子抓住胚胎并打开胚胎囊。
      注意:胚胎囊内的液体也含有NDV。
   6. 用镊子压下胚胎，并使用10mL血清移液器收集尿囊液。
   7. 将尿囊液储存在15 mL锥形管中的冰上，直到澄清。
      注意:如果尿囊为黄色，则卵黄囊已受损，应丢弃尿囊。
   8. 在4°C下以1，500× g 离心含有尿囊流体的锥形管10分钟。
   9. 暂停点:将澄清的尿囊流体等分到50 mL锥形管中，并将其储存在-80°C下进行长期储存（例如，数周至数月），用蔗糖补充液体至最终浓度为5%，以保护病毒免受冻融的恶劣影响。或者，对于短期储存（例如，1-3天），在4°C储存之前，用蔗糖（最终5%）或3x甘露醇 - 赖氨酸（ML）缓冲液（15%甘露醇，3%赖氨酸，参见 补充表S1 的缓冲配方）补充尿囊液以产生1x（5%甘露醇，1%赖氨酸）的最终浓度。

2. 从尿囊液中纯化NDV

1. 尿囊流体的深度过滤
   1. 将澄清的尿囊流体储存在-80°C，并在净化前一天晚上将其解冻在4°C。
   2. 在生物安全柜中，如图 2所示设置管路和蠕动泵。
   3. 如果尚未进行，请将尿囊液与3x ML缓冲液混合至最终浓度为1x。
   4. 在安装深度过滤器之前，通过将50 mL的0.5 M NaOH通过系统进入废物容器来对管道进行灭菌。
   5. 通过使100 mL无菌分子级水通过系统并进入废物容器来冲洗管道。
      注意:由于NaOH会使NDV失活，因此在引入含有病毒的尿囊液之前，必须充分清洗管路。
   6. 通过运行 50 mL PBS 通过系统来启动系统，当管中剩余约 5 mL PBS 时停止泵。
   7. 将具有1-3μM保持等级的深度过滤器连接到管道上，并取下深度过滤器顶端的第二个盖子以排出过滤器。开始通过系统额外运行 50 mL PBS。
   8. 一旦PBS开始流过过滤器顶部的通风口，关闭端口并继续通过管路流动PBS。
      注意:轻微的气泡是可以接受的，但是存在大量空气将需要再次排放过滤器，如步骤2.1.7和2.1.8中所述。
   9. 当管中残留约 5 mL PBS 时，请停止泵。
   10. 用新的无菌收集容器替换废物容器，并开始通过深度过滤器运行变种异体流体。
       注意:压力不应超过10 psi，因为这会导致病毒剪切。压力可以通过降低或增加泵的流量来操纵。如果压力开始超过10 psi并且流速不能进一步降低，则应使用新的深度过滤器。在这种情况下，应在恢复尿囊流体流动之前执行步骤2.1.6-2.1.8。
   11. 一旦所有尿囊液通过过滤器，通过管路运行50 mL的1x ML缓冲液，以最大限度地提高病毒恢复率。
   12. 收集液体，直到管路干涸。将病毒储存过夜或在4°C下储存长达36小时。
       注意:对病毒进行深度过滤后，在完成深度过滤后的36小时内继续纯化过程。
   13. 断开深度过滤器并消毒管道，方法是在0.5 M NaOH中储存100 mL 0.5 M NaOH，400 PPM漂白剂预热至42°C。
2. 用于 NDV 浓度的切向流过滤
   1. 将 图3A 所示的盒式磁带组件（以及前面²⁵所示）组装在生物安全柜中。
      注意:歧管和端板应在洗涤剂中清洗并干燥后使用。硅垫片是可重复使用的，应与盒一起储存在0.5 M NaOH中。
   2. 将切向流过滤（TFF）（也称为错流过滤）系统设置为"开放"构象（图3B）。
      1. 如果首次使用凝胶盒，请将TFF盒组装在洗脱构象中，并与100mL无菌分子级水冲洗（图3C）。
      2. 一旦储罐中只剩下5 mL水，请暂停泵并将TFF系统设置更改为封闭构象（图3D）。
      3. 向储液槽中加入100 mL 0.5 M NaOH，400 PPM漂白剂预热至42°C，并在系统中循环30-60分钟。
      4. 暂停流动并将TFF系统返回到洗脱设置，恢复流动以洗脱清洁溶液。
      5. 当储液槽中剩余约 5 mL 时，暂停泵并加入 100 mL 无菌分子级水以冲洗系统。
      6. 当储液器中剩余约5 mL时，暂停泵并将TFF系统置于开放构象中（图3B）。继续执行步骤 2.2.3。
   3. 通过使用蠕动泵将 100 mL 0.5 M NaOH 输送到系统中，对盒式磁带和管子进行灭菌。确保压力不超过30 psi，以保持盒式磁带的完整性。
   4. 当储液槽中还剩下大约 5 mL 0.5 M NaOH 时，暂停泵。
   5. 向储液槽中加入 100 mL 无菌分子级水，并继续将液体通过凝胶盒。旋转储液槽以清洗储液槽侧面的所有NaOH，以防止病毒失活。重复储液槽清洗步骤。
   6. 当储液器中残留约 5 mL 无菌分子级水时，暂停泵。
   7. 向储液槽中加入 100 mL PBS，旋转以确保从侧面洗涤无菌的分子级水。恢复液体流经盒。
   8. 当储液槽中剩余约 5 mL 时，暂停泵，向储液器添加深度过滤的尿囊流体，然后恢复泵流量。
   9. 监测压力表1（图3B），确保其不超过10 psi，以防止病毒剪切。结合使用蠕动泵的速度和使用 C 型夹具来增加对浪费的洗脱。
      注意:蠕动泵和C型夹的速度组合将导致压力增加。
   10. 当储液罐中剩余 50-100 mL 尿囊液时，通过添加 150-200mL 1x ML 缓冲液来暂停泵以进行缓冲液交换。
   11. 恢复泵流量，再次监测压力表1（图3B），以确保其不超过10 psi。
   12. 当储液槽中剩余 5-10 mL 时，暂停泵。
   13. 使用两个C型钳，如图 3C所示关闭两条废物管路。
   14. 断开送入储液槽的截留管，并将其插入50 mL锥形管中（图3C）。
   15. 恢复泵的流动，当储罐中残留几滴液体时暂停。
   16. 从废物管路中取出C型钳，然后将截留物进料管重新连接到储罐（图3B）。
   17. 加入 20-25 mL 1x ML 缓冲液并恢复泵流，直到储液罐中剩余约 5 mL。
   18. 重复步骤 2.2.13 至 2.2.16。
       注意:可以通过重复步骤2.2.17和2.2.13至2.2.16来完成^第三次 洗脱，以提高病毒产量。然而，大多数病毒存在于前两个洗脱中。
   19. 洗脱完成后，将病毒放在冰上或4°C。
   20. 要清洁这些管路，请将系统设置为闭环格式（图3D），并将废管路反馈回储液槽，如图 3D所示。
   21. 通过加入250 mL 0.5 M NaOH，400 PPM漂白剂预热至42°C，继续清洁系统。
   22. 将清洁溶液流过系统过夜。
       注意:在对清洁溶液进行再循环时，如果泵以 50 mL/min 的速度运行，则应观察到约 5 psi 的压力。如果压力超过此值，则盒子脏污，应更换清洁溶液，并重复该过程。
   23. 通过将废物管路和截留管路引导到废物容器中来洗脱清洁溶液。
   24. 向储液器中加入 400-500 mL 无菌水，使其流过系统并进入废物容器。
   25. 当储液罐中剩余约 5 mL 时，暂停泵并向储液罐中加入 100-200 mL 0.5 M NaOH，旋转溶液以洗涤储液槽容器。
   26. 一旦储液罐几乎为空，再重复步骤2.2.23两次。
   27. 拆卸TFF装置，将TFF盒和垫圈以0.5 M NaOH的小体积存储在4°C的可重复密封塑料袋中。
       注意:管子可以在室温下储存在0.5 M NaOH中。
3. 碘克沙醇密度梯度超速离心
   1. 打开超速离心机并将其置于预冷至4°C。 在4°C下预冷所需的转子（参见 材料表）。
      注意:转子应储存在4°C。
   2. 使用储备的60%碘克沙醇溶液（购买时的浓度）通过用PBS和3x ML缓冲液稀释至ML缓冲液的1x终浓度来生成40%，20%和10%的碘克沙醇溶液。
   3. 在13.2 mL开顶薄壁超速离心管中，分别覆盖0.5 mL，2.5mL和2.5mL的40%，20%和10%碘克沙醇溶液（图4A）。
      注意:将超速离心管侧倾并缓慢排出溶液将显着降低混合两个梯度层的风险。每层的分离应该是显而易见的，在梯度的每一层之间都有一个可见的"光晕"。
   4. 使用记号笔标记各种渐变图层的界面。
   5. 在密度梯度上从TFF程序中洗脱的病毒的6-6.5mL层。按照步骤2.3.3中所述小心添加病毒，以避免干扰密度梯度。
   6. 使用开顶秤将超速离心管装入摆动式铲斗转子的刀片中（参见 材料表），以在彼此0.01 g的范围内平衡刀片。使用PBS或额外的病毒淋洗液来解释体重差异。
   7. 一旦管子平衡，盖上管子并将它们加载到转子中。
   8. 在4°C下以125，000× g 离心1.5小时。
      注意:如果有具有延迟启动功能的超速离心机，则可以在夜间进行。
   9. 超速离心后，使用一对无菌镊子取出管子。寻找10%和20%梯度之间的目标带-一个大带（图4B）。
   10. 使用蒸馏架将管子悬挂在烧杯的顶部。
   11. 将18 G x 1.5英寸的针头连接到5 mL注射器上，并刺穿超速离心管的侧面。
       注意:管子应被刺穿略低于目标带，针呈向上的角度并向上倾斜，以便进入目标带。
   12. 慢慢伸出柱塞以移除目标带。
       注:在目标带内移动针头以最大化提取的病毒。请注意，其他条带或碎屑不要与目标条带混合，并避免服用过量的溶液，因为这会导致使用更多的透析盒。
   13. 一旦提取了目标带，取出针头，让剩余的溶液排入废烧杯中。将目标条带分配到50 mL锥形管中，直到所有其他超速离心管的所有条带都被提取出来。
   14. 重复步骤2.3.10-2.3.13，直到从所有超速离心管中提取所有目标条带。
   15. 提取目标波段的替代方法，如步骤 2.3.10 至 2.3.13 中所述
       1. 使用移液管慢慢取出覆盖在靶带上的液体。到达靶带后，使用移液管取出并将病毒储存在50 mL锥形管中。
          注意:这允许重复使用超速离心管。
4. 从病毒溶液中去除碘克沙醇
   注意:含NDV的带出现在碘克沙醇密度在15%至16%之间。溶液中碘克沙醇的浓度可以通过参照标准曲线测量340nm处的吸光度来确定（补充图S1）。可以省略此步骤，因为当向C57BL / 6小鼠施用该浓度的碘克沙醇溶液时，未观察到不良反应或急性毒性。
   1. 将0.5-3 mL 10 kDa分子量截止透析盒浸入PBS中1分钟，使其预饱满。
      注意:透析膜应从光滑变为褶皱或凹凸的外观。如果提取的病毒体积超过10 mL，则应使用两个0.5-3 mL透析盒或一个5-12 mL透析盒。
   2. 如适用，使用 5 或 10 mL 注射器和 18 G x 1.5 英寸钝充针从 50 mL 锥形管中采集病毒。
   3. 使用注射器进入透析盒，小心不要刺穿膜，并注射病毒。
      注意:透析盒可以旋转以操纵气囊在盒中的位置。在从盒中取出针头之前，应先取出气穴。
   4. 用无菌的1x PBS填充1 L烧杯，将搅拌棒和透析盒放在里面，然后盖上盖子。在4°C下温和搅拌孵育。
      注意:使用挤出聚苯乙烯泡沫和松紧带连接透析盒，使其漂浮在PBS中。由于ML缓冲液，暗盒可能会轻微膨胀。
   5. 1-2小时后，用新鲜的1x PBS替换，并继续在4°C下孵育8-10小时，轻轻搅拌。
      注意:这也可以在一夜之间完成。
   6. 再次用新鲜的1x PBS替换，在室温下孵育1-2小时。
5. 病毒溶液浓度
   1. 从透析缓冲液中取出透析盒（图4C），并将其放入一个小的可密封塑料袋中。加入15-25 mL 40 ，000 MW聚乙二醇，使透析盒完全浸没。
   2. 在室温下摇动孵育。使用 5 或 10 mL 注射器和 18 G x 1.5 英寸钝填充针定期检查盒中的病毒体积。
      注意:浓缩病毒所需的时间将因起始体积和所需的结束体积而异。通常，无论尿囊流体的起始体积如何，最终所需体积都在1至1.5 mL之间。检查体积时，请注意不要使用相同的端口，因为这会损害端口完整性，并可能导致聚乙二醇溶液和病毒的混合。
   3. 在从透析盒中取出浓缩的病毒之前，在1x PBS中短暂冲洗暗盒，并用空气填充18 G x 1.5英寸的钝填充针头。
   4. 将充满空气的注射器插入透析盒并按下柱塞。旋转设备，以便可以除去浓缩的病毒，而无需除去任何引入的空气。
   5. 将浓缩的病毒分配到50 mL锥形管中，注意分配的体积。
   6. 使用相同的注射器和针头，将适量的60%蔗糖注射到透析盒中，以便当与先前去除的病毒结合时，其最终浓度为5%蔗糖。
   7. 使用戴手套的手指按摩膜，以清除可能粘附在膜上的残留病毒，小心不要损坏它。去除透析盒中的一些多余空气，以缓解脱落过程。
   8. 将此洗涤液与已在50 mL锥形管中的病毒混合。
      注意:病毒现在在5%蔗糖中，准备分液到20μL，50μL，100μL或200μL等分试样中，并储存在-80°C。 或者，对于长期储存，NDV可以冻干并在4°C下储存，如第2.6节所述。
6. 新密度病毒的冻干
   1. 将分装在1.5mL离心管或15 mL锥形管中的病毒在44×^10-3 MBAR和-52°C下分装16小时冻干。
   2. 将冻干样品储存在4°C，而不显着降低病毒滴度。

3. 质量控制分析

1. 用于基因组确认的病毒RNA分离和逆转录PCR
   1. 解冻20μL病毒等分试样。遵循试剂盒随附的病毒RNA分离方案。
   2. 立即使用分离的RNA作为逆转录PCR（RT-PCR）的模板或将其储存在-80°C。
   3. 按照制造商提供的方案中的描述准备逆转录反应。
   4. 使用所得cDNA作为各种质量控制PCR反应的模板，以确认NDV病理型（表1，F蛋白引物集）和所需基因对照元件的存在（表1，转基因引物集）。
      注意:引物应根据正在传播的NDV菌株进行设计。
      1. 要对F蛋白裂解位点（病理型的主要决定因素）进行测序，请使用F蛋白引物集（表1）。寻找长度为435个碱基对的PCR产物。
         注意:在这里，引物是基于NDV的拉索塔菌株设计的（Genbank加入AF077761.1）。众所周知，当在P和M基因²⁴之间插入外来转基因时，会发生最佳转基因表达。
      2. 使用转基因引物集确认转基因的基因起始和基因终止元件的完整性。对PCR产物进行测序以确认基因起始和基因结束序列的完整性。
   5. 发送用于DNA测序的PCR产品，并将其与同源模板进行比较。
2. SDS 页面和考马斯染色，用于检测污染性蛋白质
   1. 通过首先制备6%和15%聚丙烯酰胺溶液来浇注密度梯度SDS PAGE凝胶（附表S1）。使用10 mL移液管吸取5 mL的15%溶液，然后抽出5mL的6%溶液。
   2. 从溶液中取出移液器，并通过短暂抽取空气产生气泡。
      注意:当气泡向上移动时，这会混合解决方案以创建 SDS 页面渐变。
   3. 将溶液分配到浇注装置中并使其固化30分钟。
   4. 在20μL的最终体积中，将等分试样病毒与4x还原缓冲液（补充表S1）混合，使最终浓度为1x，并在95°C下在热循环仪中煮沸10分钟。加载至少 1 × 10⁷ PFU 的病毒。
   5. 将SDS PAGE浸没在电泳缓冲液中（补充表S1）并加载样品。
   6. 将凝胶在120 V下运行1-1.5小时。
   7. 从电泳缓冲液中取出凝胶并将其转移到较小的容器中。
   8. 加入考马斯染色液（补充表S1）以覆盖凝胶。在室温下孵育4-5小时。
   9. 取出染色液并加入脱色溶液（补充表S1），在室温下搅拌孵育4-8小时。将脱色溶液更换三到四次。
      注意:凝胶应透明，其颜色应与染色前相同。
   10. 在比色设置下对凝胶进行成像。参见 图5 ，了解库马斯染色的SDS PAGE凝胶的代表性图像，该凝胶含有来自尿囊液和纯化病毒的样品。
3. 通过中位组织培养感染剂量（TCID₅₀）和免疫荧光测定对感染性病毒滴度进行定量
   注意:维罗电池可以用作DF1电池的替代品;然而，细胞病变效应（CPE）在Vero细胞中不太明显。NDV携带L289A突变，可增强绒毛发生性，并在 P 和 M 基因之间表达GFP，用于该测定。
   1. 在使用补充有2%胎牛血清（FBS）和125μg/ mL胰蛋白酶的DMEM的前一天，以20，000个细胞/孔的体积接种96孔DF1细胞板。将细胞在37°C和5%CO₂下孵育。
   2. 第二天，在冰上解冻20μL等分试样的病毒。
   3. 使用1.5 mL管制备连续稀释液。首先用990μLPBS稀释10μL病毒，以制备^10-2 稀释液。准备所有其他稀释液，至少最多^10-10 ，用900μLPBS和添加100μL先前稀释液制成。
      注意:在稀释液之间移动时，请使用新的移液器吸头。
   4. 使用20μL的每种稀释液感染96孔板的每个孔，如图 6所示。
      注意:每个孔中的最终体积将为100μL。
   5. 在检查CPE / GFP的存在或进行间接免疫荧光测定（IFA）之前，在37°C和5%CO₂下孵育板至少48小时。
      注意:在这些培养条件下，CPE在10小时后明显（图7A-D），在接下来的24小时内增加（图7E-H）。如果按 GFP 或 CPE 评分，则板可以孵育更长时间，以提高 CPE 的强度。
      1. 如果按 CPE 或 GFP 评分且未执行 IFA，请跳至步骤 3.3.18.1。
   6. 如果进行IFA，请用100μL1x PBS冲洗细胞两次。
   7. 向每个孔中加入100μL在PBS中稀释的4%多聚甲醛，并在室温下孵育15分钟。
   8. 用100μL 1x PBS，0.1%吐温20（0.1%PBS-T）洗涤细胞3x 5分钟。
   9. 通过在PBS中加入100μL的0.1%NP-40并在室温下孵育10分钟来透化细胞。
   10. 用100μL0.1%PBS-T洗涤细胞3x 5分钟。
   11. 加入100μL由5%（V / V）正常山羊血清组成的封闭缓冲液，在室温下在0.1%PBS-T中稀释1小时或在4°C下过夜。
   12. 每孔加入100μL在0.1%PBS-T中稀释至1μg/ mL的原代小鼠抗NDV核糖核蛋白抗体，在室温下孵育1小时或在4°C下过夜。
   13. 在100μL0.1%PBS-T中洗涤细胞3x5分钟。
   14. 加入100μL在0.1%PBS-T中稀释的AlexaFluor 488山羊抗小鼠二抗至2μg/ mL。在室温下孵育1小时。
   15. 在100μL0.1%PBS-T中洗涤细胞3x5分钟。
   16. 最终洗涤后，将细胞留在100μL0.1%PBS-T中。
   17. 使用倒置荧光显微镜对孔进行成像。
   18. 当进行IFA时，寻找大于阴性对照孔中的荧光，表明该孔对NDV呈阳性，如图 8所示。
       1. 寻找合胞体和表征NDV CPE的大而圆的细胞的存在。如果评分井感染了表达 GFP 的病毒，请查找 GFP 的存在。
   19. 在斯皮尔曼-卡伯滴度计算器²⁶ 中输入适当的信息，以确定病毒的PFU / mL（表2）。参见 图6 ，了解TCID₅₀ 滴定度板的示例。
4. 通过定量实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 定量病毒滴度
   注意:建议使用一步式qRT-PCR试剂盒，以节省时间并减少样品的操作。基于探针的测定用于提高病毒序列检测的特异性。
   1. 创建已知数量的病毒序列的标准曲线（补充图S2A，B）。
      注意:这可以通过购买NDV L基因的合成500 bp双链DNA片段来完成。NDV L基因500 bp片段的序列可以在 补充图S2C中看到。
   2. 通过使用阿伏加德罗的数和分子到分子的分子式（等式（1）），将病毒DNA片段的量（通常由制造商以纳克或飞摩尔的形式提供）转换为DNA片段的分子或拷贝数。
      （1）
   3. 通过制备已知病毒DNA片段拷贝的十倍稀释系列来制备标准曲线样品，从1.00×^10个 拷贝到1.00×10^个0 个拷贝。
   4. 为了确定未知样品中NDV RNA的量，请使用RNA提取试剂盒提取NDV RNA。遵循试剂盒随附的实验方案。提取RNA后，继续使用一步法qRT-PCR试剂盒中提供的推荐方案。
   5. 在具有以下温度和循环条件的实时PCR仪器中运行反应:1）在55°C下进行一个循环逆转录10分钟;2）在95°C下初始变性1分钟循环;3）40个周期的变性（95°C持续10秒），延伸（60°C持续30秒）和荧光信号采集。
   6. qRT-PCR测定完成后，使用实时荧光定量PCR仪器软件基于标准曲线样品生成标准曲线（补充图S2A，B）。
      注意:该软件还将根据标准曲线计算未知样品中NDV RNA的量。
5. 小鼠急性毒性的安全性测试
   1. 通过尾静脉静脉将1×^{10 8} PFU病毒注射到三只8周龄的BALB / C小鼠中，以评估急性毒性。
   2. 监测小鼠的不良事件，如体重减轻（>20%），驼背姿势，褶皱的外套，嗜睡和呼吸变化。在前48小时内每天评估三到四次。由于小鼠应在48小时后开始恢复，因此每天监测它们一到两次，直到完全恢复。
      1. 皮下注射生理盐水，并根据需要给予支持性治疗。例如，补充恢复性饮食凝胶，花生酱，或使用热冰球。如动物护理机构指南所述，对已达到终点标准的小鼠实施安乐死，方法是异氟醚过量，然后进行宫颈脱位。

收获尿囊液
由于尿囊液是从胚胎鸡蛋中收获的，它应该看起来清晰透明。如果流体显示为不透明和黄色，则表示存在污染物。在纯化过程中加入这种尿囊流体会阻碍纯化过程，因为压力会迅速上升并超过10 psi，导致病毒剪切和传染性病毒的丢失。出现血性的尿囊液表明卵子接种了过多的病毒PFU。这批卵子的产量将大大低于预期，并且这种病毒不太可能 在体内使用。 接种有致近性NDV的卵子在72小时后仍应具有明显的脉管系统，并且胚胎不应死亡，如图 1所示。如果他们有，这表明胚胎已经以某种方式受损或污染。

碘克沙醇密度梯度超速离心
超速离心后，高滴度，白色，含NDV的条带应位于10%至20%梯度之间（图4B）。

SDS-PAGE 凝胶的考马斯染色
图5 显示了未纯化（泳道2）和纯化病毒库（泳道3）之间的区别。两者的比较表明，污染蛋白质条带的强度显着降低，纯化的病毒储液中出现了显性NDV条带。

通过 TCID 50 定量病毒滴度
如果在滴定NDV浓缩储备时使用推荐的条件，CPE应在24小时后明显（图6）。与滴度的相似热源菌株NDV相比，CPE在同一时间点的中观菌株中更为明显。

8周龄BALB/C小鼠的急性毒性分析
当静脉注射1×10 8 PFU时，应监测小鼠的不良反应，例如体重减轻>20%，褶皱的外套，驼背的姿势和呼吸异常。在最初的24-36小时内，小鼠将开始减肥，并可能发展出褶皱的外套和驼背的姿势。然而，如果病毒足够纯净，小鼠开始恢复，正如36小时后体重增加以及姿势和皮毛状况的改善所观察到的那样。在36小时之前没有显示出这些恢复迹象的小鼠应继续密切监测终点标准。通常，这是由于滴定不准确而发生的，可能是由于病毒颗粒的聚集。

图1:从指定的无病原体胚胎化鸡蛋中感染和收获NDV. （A）网状脉管系统（箭头），除了胚胎运动外，孵育9天后应该很明显。"X"表示绒毛膜和气腔之间的界面，以及应该为接种卵子而产生孔的位置。（B）描绘死亡胚胎的图像。注意没有网状脉管系统。还将观察到缺乏胚胎运动。（C）胚胎化鸡蛋的成分图，显示气腔，卵黄囊，羊膜，绒毛膜和尿囊的位置。（D）取出外壳以暴露绒毛膜。（E）说明绒毛膜打开后，尿囊液和胚胎的外观。缩写:NDV = 新城疫病毒。 请点击此处查看此图的大图。

图2:用于深度过滤的装置的一般装配示意图。 确保压力表安装在深度过滤器的上游。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:不同配置的切向流过滤设置。箭头显示流体流动的方向。 （A） TFF盒式磁带如何组装的图示。（B） 在净化和浓缩流体期间使用的TFF系统"开放"配置的示意图。（C） 从系统中洗脱流体时TFF设置的示意图，用于洗脱病毒和清洁溶液。（D） TFF系统"封闭"配置的示意图，用于清洁TFF系统。缩写:TFF = 切向流过滤。 请点击此处查看此图的大图。

图4:密度梯度超速离心和透析来自TFF的浓缩病毒（A）显示碘克沙醇密度梯度的组成示意图。（B）在纯化过程中使用ML缓冲液对产生的病毒进行超速离心后的病毒条带模式。主要的含病毒带由黑色椭圆形表示。（C）透析程序结束时通过碘克沙醇梯度制备的装有10mL病毒的透析盒的典型尺寸。简称:TFF =切向流过滤;ML = 甘露醇-赖氨酸。请点击此处查看此图的大图。

图 5:考马斯染色的 SDS-PAGE 凝胶。 凝胶比较了上样1×105 PFU时未纯化（泳道2）和纯化（泳道3）中观NDV储液之间是否存在污染蛋白。泳道 1 和 4 = 分子量梯度 （MW）。NDV HN，F0及其在裂解后的亚基F1 和F2，以及它们各自的分子量27 以白色字体显示。缩写:SDS-PAGE =十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳;NDV = 新城疫病毒;PFU = 斑块形成单位;HN = 血凝素;F0 = 融合。 请点击此处查看此图的大图。

图 6:用于通过 TCID50 测定病毒滴度的 96 孔板布局示例。 将板分成12列，每列代表不同的连续稀释。阳性孔（由 CPE、转基因表达或 IFA 确定）以灰色表示。给定本例中正孔的数量，使用斯皮尔曼-卡伯滴度计算器（表 2）后的预期滴度列在 TCID50/mL 和 PFU/mL 中。缩写:TCID50 =中位组织培养感染剂量;CPE = 细胞病变作用;IFA = 免疫荧光测定;PFU = 牙菌斑形成单位。 请点击此处查看此图的大图。

图7:DF1细胞感染后CPE与致慢血性或中源性NDV的比较。

作者没有利益冲突需要声明。