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方法文章

从尿囊液中制备高滴度重组新城疫病毒

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DOI：

10.3791/63817

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2022年5月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathobiology, University of Guelph

本文内容

摘要

在此，我们提供了一种高效价重组新城疫病毒的制备、纯化与定量的详细操作流程。该方案可稳定获得 > 6 × 109 每毫升噬斑形成单位，提供适用于病毒定量的合适数量 体内 动物实验。为确保安全性而进行的额外质量控制检测 体内 已描述。

摘要

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），也称为禽副粘病毒血清型1（avian orthoavulavirus serotype-1），是一种负链单股RNA病毒，已被开发为溶瘤病毒和病毒载体疫苗。由于其成熟的反向遗传学系统、强大的免疫刺激特性以及优异的安全性，NDV成为一种具有吸引力的治疗和预防制剂。当作为溶瘤病毒或病毒载体疫苗使用时，NDV可引发强烈的抗肿瘤或抗原特异性免疫反应，激活免疫系统的先天性和适应性免疫应答。

鉴于这些理想的特性，新城疫病毒（NDV）已在多项临床试验中得到评估，是研究最为深入的溶瘤病毒之一。目前，有两项注册的临床试验涉及NDV：一项评估基于重组NDV载体的SARS-CoV-2疫苗（NCT04871737），另一项评估表达白细胞介素-12（Interleukin-12）的重组NDV与抗PD-L1抗体Durvalumab联合使用的疗效（NCT04613492）。为了推动这一极具前景的病毒载体的进一步发展，亟需建立简便的方法以制备高滴度、适用于体内实验（in vivo-grade）的重组NDV（rNDV）。

本文描述了一种在无特定病原体（SPF）鸡胚中扩增重组新城疫病毒（rNDV）并从尿囊液中纯化rNDV的详细步骤，其中包含若干改进措施以减少纯化过程中的病毒损失。同时提供了推荐的质量控制检测方法，用于确认病毒制品无污染物且具有完整病毒结构。总体而言，该详细操作流程可实现高滴度、 体内-级、重组型、低毒力型和中等毒力型新城疫病毒（NDV），用于临床前研究。

引言

新城疫病毒（Newcastle Disease Virus），也称为禽副粘病毒-1型（Avian Orthoavulavirus-1），是一种有包膜的禽副粘病毒，具有作为溶瘤病毒或病毒载体疫苗的潜力1,2,3,4,5,6,7。最近，经基因工程改造表达SARS-CoV-2刺突蛋白的NDV已在小鼠和仓鼠攻毒模型中被证实是一种有效的鼻内疫苗7,8,9。当用作癌症免疫治疗时，该病毒可诱导天然免疫细胞（特别是自然杀伤细胞）的募集、I型干扰素的产生以及抗肿瘤特异性T细胞的生成10,11,12,13。除了这些强大的免疫刺激特性外，NDV还具有良好的安全性以及成熟的反向遗传操作系统14,15。这些理想特性促使NDV在多项临床前研究和人体临床试验中得到评估（NCT04871737、NCT01926028、NCT04764422）16,17。为了进一步推进这一极具前景的免疫刺激性病毒载体，亟需建立详细的方法，以制备和纯化高滴度、超纯的NDV，确保其可安全地用于in vivo给药。

由于新城疫病毒（NDV）是一种禽副黏病毒，通常在鸡胚中进行扩增。尽管已有基于细胞的系统可用于增殖NDV，但大多数系统无法达到在鸡胚中所获得的滴度水平18。然而，在鸡胚中生产NDV也存在一些缺点，包括基于鸡胚的生产周期较长、难以实现规模化，大量获取SPF级鸡胚可能存在困难，且存在被鸡蛋过敏原污染的风险13,18,19,20。最近，有研究团队表明，在无血清培养基中悬浮培养的Vero细胞可在纯化前支持NDV复制，达到与鸡胚中相当的滴度21。然而，该方法需要对病毒进行连续传代以适应Vero细胞，且仍需优化从悬浮培养的Vero细胞中纯化NDV的方法21。

如前所述，用于纯化高滴度、适用于体内实验级别的病毒的方法因具体病毒种类而异22。目前已有成熟的反向遗传学系统可用于重组新城疫病毒（NDV）的构建。该过程涉及使用cDNA克隆、辅助质粒以及表达T7 RNA聚合酶的辅助病毒，其详细步骤已有文献报道15,23。本实验方案适用于弱毒型（lentogenic）或中等毒力型（mesogenic）NDV。本方案中所描述的病毒为一种重组中等毒力型NDV，其在病毒P基因与M基因之间插入了来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）基因，作为一个独立的转录单元。此前研究已表明，该位点是外源转基因插入的最佳位置24。

封闭的方法基于新城疫病毒（NDV）的大小（100至500 nm）及其密度，概述了其纯化步骤15。这使得能够生成 体内-级、高滴度NDV毒株，从接收到鸡蛋到获得最终滴度约需3周。文中描述了基于鸡蛋大规模生产病毒常用的技术，包括切向流过滤、深层过滤和密度梯度超速离心，有助于将这些方法扩展至更大规模的生产。此前报道的NDV纯化技术已得到改进，改进措施包括引入病毒稳定缓冲液、在密度梯度超速离心中使用碘克沙醇，以及详细说明各项质量控制手段，以确保 体内-级质量15。这使得纯化成为可能 体内-级NDV，滴度高达3 × 1010 每0.8至1.0升羊水中的PFU/mL。

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方案

所有涉及动物使用的实验均经加拿大动物护理委员会认可的圭尔夫大学动物护理委员会批准。所有实验均在加拿大生物安全二级（BSL2）实验室中进行，其中中等毒力新城疫病毒（mesogenic NDV）属于第二类风险病原体。为确保安全性和无菌性，新城疫病毒（NDV）扩增与纯化的所有步骤均须在IIA型生物安全柜内操作。

1. 使用无特定病原体的鸡胚扩增新城疫病毒

  1. SPF 鸡胚接种
    注意：通常使用八打 SPF 鸡胚来制备一批适用于 in vivo 的新城疫病毒（NDV）。建议额外订购一至两打鸡蛋，以弥补运输过程中的破损以及胚胎存活率的个体差异。鸡胚属于生物材料，应按照机构规定进行操作。但由于胚胎不会孵化，因此无需获得机构动物护理委员会的批准。
    1. 收到 SPF 鸡胚后，将其置于 37 °C、60% 湿度的孵卵器中孵育 9 天。确保孵卵器设置为每小时自动 rocking/旋转一次。
      注意：鸡蛋可在室温下保存最多 24 小时，或在 4 °C 下保存最多 72 小时；但这些操作可能会降低胚胎的存活率。
    2. 孵育 8–11 天后（理想时间为第 9 天），对鸡蛋进行照卵以判断胚胎活力。观察是否存在网状血管系统（图 1A）以及胚胎运动，作为胚胎存活的指标。丢弃缺乏这些特征的鸡蛋（图 1B）。
    3. 在存活的鸡蛋上，用铅笔标记气室与胚胎交界处，标记为“X”（图 1A）。确保该注射位点不会刺穿血管系统。在准备接种液期间，将已标记的鸡蛋放回孵卵器。
    4. 计算接种所有 SPF 鸡胚所需的病毒量。确保每个鸡蛋接种 100 µL 含 100 PFU 病毒的接种液；将病毒用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至浓度为 1 × 103 PFU/mL。额外准备 20% 的接种液，以弥补病毒接种过程中的操作误差。
    5. 使用防静电擦拭布，以 70% 乙醇中稀释的 10% 碘溶液清洁已标记鸡蛋的顶部。等待约 1–2 分钟，使溶液完全干燥。
    6. 使用无菌尖头镊子小心刺穿蛋壳。每处理一个鸡蛋后，需用 70% 乙醇对镊子进行消毒。
    7. 使用 1 mL 注射器和 25 G 针头，将步骤 1.1.4 中制备的 100 µL 接种液注入尿囊腔（图 1C）。进针方向应与蛋壳表面接近 90° 角，针尖仅插入尿囊膜顶部即可。
    8. 接种完成后，用指甲油封闭穿刺孔，并将鸡蛋放回孵卵器。确保 rocking 设置保持开启，直至接种后 24 小时。
    9. 接种后 24 小时检查鸡蛋活力。丢弃尿囊膜无血管系统且无胚胎运动的死亡鸡蛋（图 1B）。
      注意：这些鸡蛋的死亡是由于接种操作所致，而非新城疫病毒感染。
    10. 将存活鸡蛋放回孵卵器，关闭 rocking 设置，以防止蛋内蛋白污染尿囊液。
    11. 按照步骤 1.1.9 的方法，每 12–24 小时检查一次鸡蛋，识别死亡个体。将接种 24 小时后死亡的鸡蛋转移至 4°C，以减少自溶。在冷藏后 2–12 小时内收集尿囊液。
    12. 孵育时间至少为 72 小时。
      注意：若扩增中致病性 NDV 毒株，最佳孵育时间为 60–72 小时，因孵育时间过长会导致尿囊液浑浊，影响后续纯化。而弱毒 NDV 毒株因致死胚胎所需时间较长，此问题影响较小。
    13. 在适当孵育时间结束后，将剩余鸡蛋转移至 4 °C 冷藏 2–12 小时，再进行尿囊液收集。
  2. 收集含 NDV 的尿囊液
    1. 将冷藏的鸡蛋转移至生物安全柜中，并用 70% 乙醇清洁蛋壳顶部。
    2. 使用无菌镊子和手术剪刀，打开气室所在位置的蛋壳顶端。
    3. 移除蛋壳以暴露尿囊膜（图 1D）。
    4. 小心刺破膜并将其剥离，以暴露尿囊腔（图 1E）。注意避免意外刺破卵黄囊，否则会导致样本污染。
    5. 使用钝头镊子夹住胚胎并打开胚囊。
      注意：胚囊内的液体也含有 NDV。
    6. 用镊子压住胚胎，使用 10 mL 移液管收集尿囊液。
    7. 将收集的尿囊液置于冰上，分装至 15 mL 离心管中，待澄清处理。
      ​注意：若尿囊液呈黄色，表明卵黄囊已破裂，应弃用该样本。
    8. 将含尿囊液的离心管在 4 °C 条件下以 1,500 ×g 离心 10 分钟。
    9. 暂停点：将澄清后的尿囊液分装至 50 mL 离心管中，可长期储存于 -80 °C（例如数周至数月），并补充蔗糖至终浓度 5%，以保护病毒免受冻融损伤。若需短期储存（例如 1–3 天），可在尿囊液中添加蔗糖（终浓度 5%）或 3× 甘露醇-赖氨酸（ML）缓冲液（15% 甘露醇，3% 赖氨酸；缓冲液配方见 补充表 S1），使终浓度为 1×（5% 甘露醇，1% 赖氨酸），然后于 4 °C 保存。

2. 从尿囊液中纯化新城疫病毒

  1. 羊水深度过滤
    1. 将澄清的尿囊液储存在 -80 °C 并将其在 4 °C 纯化前一晚。
    2. 在生物安全柜中，按照图示设置管路和蠕动泵 图2.
    3. 如果尚未进行，将尿囊液与3倍体积的ML缓冲液混合，使终浓度为1x。
    4. 在安装深层过滤器之前，通过系统向废液容器中通入 50 mL 0.5 M NaOH，以对管路进行灭菌。
    5. 通过系统向废液容器中通入100 mL无菌分子级水，以冲洗管路。
      注意：由于 NaOH 会使 NDV 失活，因此在加入含病毒的羊膜液之前，必须充分清洗管道。
    6. 通过系统运行 50 mL PBS 进行预冲洗，当管中剩余约 5 mL PBS 时停止泵。
    7. 连接深度滤器，孔径为1-3 µM 将管路连接至滤器并打开顶端深度滤器的第二个盖子以排气。开始向系统中继续注入50 mL PBS。
    8. 一旦 PBS 开始从滤器顶部的排气口流出，关闭该端口并继续使 PBS 流经管路。
      注意：少量小气泡可以接受，但若存在大量空气，则需按照步骤 2.1.7 和 2.1.8 中所述方法再次对滤器进行排气。
    9. 当管中剩余约 5 mL PBS 时，停止泵。
    10. 更换废液瓶为新的无菌收集瓶，并开始将尿囊液通过深层滤器。
      注意：压力不得超过10 psi，否则会导致病毒剪切。可通过降低或提高泵的流速来调节压力。如果压力开始超过10 psi，且流速无法进一步降低，则应更换新的深层滤器。此时，在恢复羊水流动前，应先执行步骤2.1.6–2.1.8。
    11. 当所有尿囊液通过滤膜后，让 50 mL 的 1x ML 缓冲液流经管路，以最大程度回收病毒。
    12. 收集液体直至流干。将病毒在4 °C下保存过夜或最长36 h 4 °C.
      注意：病毒经深层过滤后，须在完成深层过滤后的36小时内继续进行纯化过程。
    13. 断开深度过滤器，并通过运行 100 mL 预热至 0.5 M NaOH 和 400 PPM 次氯酸钠溶液对管路进行消毒 42 °C 在储存于 0.5 M NaOH 之前，使样品通过该系统。
  2. 用于新城疫病毒（NDV）浓缩的切向流过滤
    1. 按照图示组装盒式组件 图 3A （以及先前已展示的）25在生物安全柜中。
      注意：使用前应将流道板和端板用洗涤剂清洗并干燥。硅胶垫圈可重复使用，应与盒体一同保存在 0.5 M NaOH 中。
    2. 安装切向流过滤（TFF，也称为错流过滤）系统，使其处于“开放”构型图3B).
      1. 若首次使用滤器，将切向流过滤（TFF）滤器组装为洗脱构型，并用100 mL无菌分子级水冲洗（图3C).
      2. 当储液罐中仅剩5 mL水时，暂停泵运行，并将切向流过滤（TFF）系统调整为封闭构型（图3D).
      3. 加入100 mL 0.5 M NaOH和预热至400 PPM的次氯酸钠溶液 42 °C 向储液器中加入并循环通过系统 30-60 分钟。
      4. 暂停流速，将TFF系统恢复至洗脱装置，然后恢复流速以洗脱清洗液。
      5. 当储液器中剩余约 5 mL 时，暂停泵运行，并加入 100 mL 无菌分子级水以冲洗系统。
      6. 当储液器中剩余约 5 mL 时，暂停泵运行并将 TFF 系统置于开放构象（图3B）。继续进行步骤 2.2.3。
    3. 使用蠕动泵将100 mL的0.5 M NaOH溶液通过系统，对 cassette 和管路进行灭菌。确保压力不超过30 psi，以保持cassette的完整性。
    4. 当储液瓶中剩余约 5 mL 的 0.5 M NaOH 时，暂停泵的运行。
    5. 向储液槽中加入100 mL无菌分子级水，继续使液体流经滤盒。轻轻摇动储液槽，冲洗内壁残留的NaOH，以防止病毒失活。重复清洗储液槽步骤。
    6. 当储液器中剩余约 5 mL 无菌分子级水时，暂停泵。
    7. 向储液槽中加入 100 mL PBS，轻轻旋转以确保冲洗掉管壁上的无菌分子级水。恢复液体通过滤器的流动。
    8. 当储液器中剩余约5 mL时，暂停泵的运行，向储液器中加入经深度过滤的羊水，然后恢复泵的流动。
    9. 监测压力表 1（图3B）以确保压力不超过10 psi，防止病毒剪切。通过调节蠕动泵速度并结合使用C型夹增加洗脱至废液的流速。
      注意：蠕动泵速度与C型夹联用将导致压力升高。
    10. 当储液器中剩余50-100 mL尿囊液时，暂停泵运行，加入150-200 mL 1x ML缓冲液以进行缓冲液置换。
    11. 恢复泵流，再次监测压力表1（图3B）以确保其不超过 10 psi。
    12. 当储液器中剩余 5-10 mL 时，暂停泵。
    13. 使用两个 C 形夹，夹住两条废液管，如下图所示 图3C.
    14. 断开向储液槽供液的截留液管路，并将其插入一个 50 mL 圆锥形离心管中图3C).
    15. 恢复泵的流动，当储液罐中仅剩少量液体时暂停。
    16. 从废液管上拆下 C 形夹，并将截留液进液管重新连接至储液罐（图3B).
    17. 加入20–25 mL的1× ML缓冲液，并恢复泵流速，直至储液罐中剩余约5 mL为止。
    18. 重复步骤 2.2.13 至 2.2.16。
      注意：一个 3rd 可通过重复步骤 2.2.17 以及 2.2.13 至 2.2.16 以提高病毒得率进行洗脱。然而，大部分病毒存在于前两次洗脱液中。
    19. 洗脱完成后，将病毒置于冰上或4℃ 4 °C.
    20. 为清洗管路，将系统设置为闭环循环模式（图3D）废液管路如图所示回流至储液槽中 图3D.
    21. 加入250 mL预热至指定温度的0.5 M NaOH和400 PPM次氯酸钠溶液，对系统进行清洗 42 °C.
    22. 将清洗液在系统中循环过夜。
      注意：在循环清洗液过程中，若泵的运行速度为50 mL/min，应观察到约5 psi的压力。如果压力超过此值，则表明 cassette 被污染，应更换清洗液并重复清洗过程。
    23. 将废液管路和截留液管路均导向废液容器，以排出清洗液。
    24. 向储液罐中加入 400–500 mL 无菌水，使其流经系统并进入废液容器。
    25. 当储液罐中剩余约5 mL时，暂停泵，向储液罐中加入100–200 mL的0.5 M NaOH，混匀溶液以清洗储液容器。
    26. 当储液槽即将排空时，重复步骤 2.2.23 两次。
    27. 拆解TFF装置，将TFF膜包和垫片置于密封塑料袋中，加入少量0.5 M NaOH溶液，密封保存于 4 °C.
      注意：导管可置于0.5 M NaOH溶液中，于室温下保存。
  3. 碘克沙醇密度梯度超速离心
    1. 开启超速离心机并设置预冷 4 °C. 将所需转子预冷至 4 °C 同样（参见 材料表).
      注意：离心转子应保存在 4 °C.
    2. 使用购入时浓度的60%碘克沙醇储备液，用PBS和3倍浓缩ML缓冲液稀释，配制40%、20%和10%的碘克沙醇溶液，使ML缓冲液的终浓度为1倍。
    3. 在一支13.2 mL开口、薄壁超速离心管中，依次加入0.5 mL、2.5 mL和2.5 mL的40%、20%和10%碘克沙醇溶液图 4A).
      注意：将超速离心管侧向倾斜并缓慢排出溶液，可显著降低两层梯度溶液混合的风险。每层之间的分界应清晰可见，具有 "halo" 可见于梯度各层之间。
    4. 使用记号笔标记各梯度层的界面。
    5. 将TFF步骤中洗脱的病毒液6-6.5 mL小心地铺加到密度梯度上层。加样时需按照步骤2.3.3所述方法进行，避免扰动密度梯度。
    6. 将超速离心管装入摆动桶转子的转子插件中（参见 材料表使用开放式天平将插入物之间的重量差异调整至0.01 g以内。用PBS或额外的病毒洗脱液补偿重量差异。
    7. 待试管平衡后，盖上管盖，并将其装入转子中。
    8. 离心 1.5 小时，125,000 × g × g 在 4 °C.
      注意：如果超速离心机具备延迟启动功能，此步骤可过夜进行。
    9. 超速离心后，使用无菌镊子取出离心管。在10%与20%梯度之间寻找目标条带——一条较宽的条带。图 4B).
    10. 使用铁架台将试管悬置于烧杯上方。
    11. 将18 G × 1.5英寸针头连接至5 mL注射器，并穿刺超速离心管管壁侧面。
      注意：应在目标条带略下方刺入试管，针头向上倾斜且斜面朝上，以便进入目标条带。
    12. 缓慢推动活塞以切下目标条带。
      注意：在目标条带内移动移液针以最大化提取病毒。注意避免其他条带或杂质混入目标条带，并避免吸取过多溶液，以免增加透析盒的使用量。
    13. 目标条带提取完毕后，移除针头，将剩余溶液排入废液杯中。将目标条带收集至50 mL锥形管中，直至所有超速离心管中的条带均被提取完毕。
    14. 重复步骤 2.3.10–2.3.13，直至从所有超速离心管中提取出所有目标条带。
    15. 提取目标条带的替代方法，如步骤 2.3.10 至 2.3.13 所述
      1. 使用移液器缓慢移除目标条带上方的液体。到达目标条带时，用移液器吸取并收集病毒，储存于50 mL锥形管中。
        注意：这允许超速离心管重复使用。
  4. 去除病毒溶液中的碘克沙醇
    注意：含新城疫病毒（NDV）的条带出现在碘克沙醇密度为15%至16%的区间。可通过测定溶液在340 nm处的吸光度，并参照标准曲线来确定溶液中碘克沙醇的浓度。补充图 S1）。当将此浓度的碘克沙醇溶液给予 C57BL/6 小鼠时，未观察到不良反应或急性毒性，因此该步骤可省略。
    1. 将一个0.5–3 mL、截留分子量为10 kDa的透析盒浸入PBS中预润湿1分钟。
      注意：透析膜的外观应从光滑变为起皱或凹凸不平。若提取的病毒体积超过10 mL，应使用两个0.5–3 mL透析盒或一个5–12 mL透析盒。
    2. 根据具体情况，使用5 mL或10 mL注射器配合18 G × 1.5英寸钝头灌注针，从50 mL锥形管中收集病毒。
    3. 使用注射器插入透析盒，注意不要刺穿膜，然后注入病毒。
      注意：可通过旋转透析盒来调节盒内气泡的位置。在将针头从透析盒中取出之前，应先排除气泡。
    4. 将1 L烧杯中装入无菌的1×PBS，放入搅拌子和透析盒，盖上盖子。于指定温度下孵育 4 °C 轻轻搅拌。
      注意：使用挤出式聚苯乙烯泡沫和弹性带将透析盒固定，使其漂浮在 PBS 中。由于 ML 缓冲液的作用，透析盒可能会轻微膨胀。
    5. 孵育1-2小时后，更换为新鲜的1x PBS，继续孵育 4 °C 继续轻轻搅拌孵育8-10小时。
      注意：此步骤也可过夜进行。
    6. 再次更换为新鲜的1×PBS，室温孵育1-2小时。
  5. 病毒溶液浓度
    1. 从透析缓冲液中取出透析盒图 4C）并放入一个小的可密封塑料袋中。加入15–25 mL的40% 20,000 MW聚乙二醇，使透析盒完全浸没。
    2. 室温下轻轻振荡孵育。使用5或10 mL注射器配合18 G × 1.5英寸钝头灌注针，定期检查盒式容器中病毒的体积。
      注意：浓缩病毒所需的时间取决于起始体积和期望的终末体积。通常情况下，无论尿囊液的起始体积如何，最终期望的体积通常在 1 至 1.5 mL 之间。在检测体积时，切勿使用同一端口，以免破坏端口完整性，导致聚乙二醇溶液与病毒混合。
    3. 在从透析盒中取出浓缩病毒之前，先用1×PBS短暂冲洗透析盒，并用空气填充一支18 G × 1.5英寸钝头灌注针。
    4. 将装有空气的注射器插入透析盒中并推动活塞。旋转装置，以便在不移除所引入空气的情况下取出浓缩的病毒。
    5. 将浓缩的病毒加入50 mL锥形管中，记录所加入的体积。
    6. 使用同一支注射器和针头，向透析盒中注入适量的60%蔗糖溶液，使其与先前移出的病毒混合后，蔗糖的终浓度为5%。
    7. 戴上手套，用手指轻轻按摩膜，以去除可能粘附在膜上的残留病毒，注意不要损坏膜。排出透析盒中部分多余的空气，以利于病毒的脱离过程。
    8. 将此洗涤液与已位于50 mL锥形管中的病毒混合。
      ​注意：病毒现处于5%蔗糖溶液中，可分装使用 20 µL, 50 µL, 100 µL，或 200 µL 分装并保存于 -80 °C. 或者，对于长期保存，可将新城疫病毒（NDV）进行冻干处理并储存于 4 °C 如第2.6节所述
  6. 新城疫病毒（NDV）的冻干
    1. 将分装于1.5 mL离心管或15 mL锥形管中的病毒在44℃下进行冻干 × 10-3 MBAR 和 -52 °C 16小时。
    2. 将冻干样品置于 4 °C 病毒滴度未出现显著降低。

3. 质量控制检测

  1. 病毒RNA提取与逆转录PCR进行基因组验证
    1. 解冻一个 20 µL 病毒分装。按照试剂盒提供的病毒RNA提取方案进行操作。
    2. 立即使用分离的RNA作为逆转录PCR（RT-PCR）的模板，或将其保存在-80°C。80 °C.
    3. 按照制造商提供的说明书制备反转录反应。
    4. 将所得 cDNA 用作模板进行多种质量控制 PCR 反应，以确认新城疫病毒（NDV）的致病型表1，F蛋白引物组）以及必需基因调控元件的存在（表1，转基因引物组）
      注意：引物的设计应基于所增殖的NDV毒株。
      1. 为了对决定毒力型的主要位点——F蛋白切割位点进行测序，使用F蛋白引物组（表1）。在凝胶电泳中观察是否存在长度为435个碱基对的PCR扩增产物。
        注意：此处引物的设计基于新城疫病毒（NDV）LaSota株（GenBank登录号 AF077761.1）。已有充分证据表明，当外源转基因插入P基因与M基因之间时，可实现最佳的转基因表达。24.
      2. 使用转基因引物组确认转基因基因起始和基因终止元件的完整性。对PCR产物进行测序，以验证基因起始和基因终止序列的完整性。
    5. 将PCR产物送交DNA测序，并与模板序列进行同源性比对。
  2. SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色检测污染蛋白
    1. 通过首先配制6%和15%聚丙烯酰胺溶液来制备密度梯度SDS-PAGE凝胶（补充表格 S1使用10 mL移液管吸取5 mL的15%溶液，随后吸取5 mL的6%溶液。
    2. 从溶液中取出移液器，通过短暂吸取空气产生一个气泡。
      注意：随着气泡向上移动，会混合溶液以形成 SDS-PAGE 浓度梯度。
    3. 将溶液注入制胶装置，静置30分钟使其凝固。
    4. 最终体积中 20 µL，将一份病毒等分试样与4x还原缓冲液混合（补充表 S1) 使其终浓度为1x，在100°C下煮沸10分钟 95 °C 在热循环仪中进行。至少上样1 × 107 病毒的PFU
    5. 将SDS-PAGE凝胶浸入电泳缓冲液中（补充表 S1）并上样。
    6. 以120 V电压电泳运行1-1.5小时。
    7. 将凝胶从电泳缓冲液中取出，转移至较小的容器中。
    8. 加入考马斯亮蓝染色液（补充表 S1) 覆盖凝胶，室温孵育4-5小时。
    9. 移除染色液，加入脱色液（补充表 S1），在室温下振荡孵育4-8小时。更换脱色液3至4次。
      注意：凝胶应呈透明状，且其颜色应与染色前一致。
    10. 在比色模式下对凝胶成像。参见 图5 为展示尿囊液样本和纯化病毒样本的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶的代表性图像。
  3. 通过半数组织培养感染剂量（TCID50）定量感染性病毒滴度50）和免疫荧光检测
    注意：Vero 细胞可作为 DF1 细胞的替代选择；然而，Vero 细胞中的细胞病变效应（CPE）较不明显。携带 L289A 突变（可增强融合性）并在 NDV 中于 GFP 表达之间的 P 和 M 基因在此检测中被使用。
    1. 在96孔板中接种DF1细胞，每孔20,000个细胞，体积为 80 µL 前一日使用添加了2%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基 125 µg/mL 胰蛋白酶。将细胞在37°C下孵育 37 °C 和5% CO₂2.
    2. 第二天，解冻一个 20 µL 冰上保存的病毒等分试样。
    3. 使用1.5 mL离心管进行系列稀释。首先进行稀释 10 µL 病毒的 990 µL PBS 加至 10-2 稀释。制备其余所有稀释液，直至10-10 至少由……制成 900 µL PBS 的洗涤及添加 100 µL 前一次稀释的
      注意：在不同稀释液之间操作时，须更换新的移液器吸头。
    4. 使用 20 µL 每个稀释度接种至96孔板的每孔，如图所示 图6.
      注意：每孔的最终体积将为 100 µL.
    5. 将培养板在至少48 h内孵育 37 °C 和5% CO2，然后观察 CPE/GFP 的出现，或进行间接免疫荧光测定（IFA）。
      注意：在此培养条件下，10 小时后即可观察到细胞病变效应（CPE）图7A- D），在接下来的24小时内逐渐增加（图7E- H）。如果通过GFP或细胞病变效应（CPE）进行评分，可延长培养板的孵育时间以增强CPE强度。
      1. 若通过细胞病变效应（CPE）或绿色荧光蛋白（GFP）进行评分且不进行免疫荧光分析（IFA），则跳至步骤 3.3.18.1。
    6. 若进行免疫荧光染色（IFA），用缓冲液将细胞洗涤两次 100 µL 1× PBS 溶液
    7. 添加 100 µL 向每个孔中加入用 PBS 稀释的 4% 多聚甲醛，室温孵育 15 分钟。
    8. 用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次 100 µL 含0.1% Tween 20的1×PBS缓冲液（0.1% PBS-T）
    9. 通过添加破膜剂使细胞破膜 100 µL 用含0.1% NP-40的PBS处理，并在室温下孵育10分钟。
    10. 用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次 100 µL 0.1% PBS-T
    11. 添加 100 µL 由5% (V/V) 正常山羊血清在0.1% PBS-T中稀释而成的封闭缓冲液，室温孵育1小时或4℃过夜 4 °C.
    12. 添加 100 µL 每孔加入用 0.1% PBS-T 稀释的初级小鼠抗新城疫病毒核蛋白抗体 1 µg/mL，室温孵育1小时或4℃过夜 4 °C.
    13. 用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次 100 µL 0.1% PBS-T
    14. 添加 100 µL 0.1% PBS-T 中稀释的 AlexaFluor 488 标记山羊抗小鼠二抗 2 µg/mL室温孵育1小时。
    15. 用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次 100 µL 0.1% PBS-T
    16. 最后一次洗涤后，将细胞留在 100 µL 0.1% PBS-T
    17. 使用倒置荧光显微镜对孔板进行成像。
    18. 进行IFA时，应观察荧光信号是否强于阴性对照孔中的荧光，若强于则表明该孔为NDV阳性，如图所示。 图8.
      1. 观察是否存在合胞体及具有NDV CPE特征的大型圆形细胞。若对表达GFP的病毒感染孔进行评分，需观察GFP的存在情况。
    19. 将适当的信息输入斯皮尔曼-卡尔伯滴定计算器26 以确定病毒的PFU/mL（每毫升噬斑形成单位）表 2）。参见 图6 以 TCID 为例50 滴定板
  4. 通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定病毒滴度
    注意：建议使用一步法qRT-PCR试剂盒，以节省时间并减少对样本的操作。采用基于探针的检测方法，以提高病毒序列检测的特异性。
    1. 创建已知数量病毒序列的标准曲线（补充图 S2A,B).
      注意：可通过购买新城疫病毒L基因的合成500 bp双链DNA片段来实现。新城疫病毒L基因500 bp片段的序列如以下所示： 补充图 S2C.
    2. 使用阿伏伽德罗常数及摩尔数转分子数公式（公式（1)).
      figure-protocol-1 (1)
    3. 通过制备已知病毒DNA片段拷贝数的10倍系列稀释液来准备标准曲线样品，起始浓度为1.00 × 1010 降至 1.00 拷贝 × 100 拷贝数
    4. 为确定未知样本中新城疫病毒（NDV）RNA的含量，使用RNA提取试剂盒提取NDV RNA，并遵循试剂盒提供的操作步骤。RNA提取完成后，按照一步法qRT-PCR试剂盒中推荐的方案进行后续操作。
    5. 在实时荧光定量 PCR 仪中运行反应，温度和循环条件如下：1）逆转录一步，循环 1 次，条件为 55 °C 10分钟；2）初始变性一步，循环条件为 95 °C 1 分钟；以及 3）40 个循环的变性（95 °C 延伸（10 秒）60 °C 30 秒）并采集荧光信号。
    6. qRT-PCR 检测完成后，使用实时荧光定量 PCR 仪器软件，根据标准曲线样品生成标准曲线（补充图 S2A,B).
      注意：该软件还将根据标准曲线计算未知样本中NDV RNA的含量。
  5. 小鼠急性毒性安全测试
    1. 注射 1 × 108 病毒空斑形成单位静脉注射 通过 通过尾静脉向三只8周龄BALB/C小鼠注射以评估急性毒性。
    2. 监测小鼠是否出现体重减轻等不良事件（>20%）、弓背姿势、毛发竖起、精神萎靡以及呼吸变化。在前48小时内每日评估三至四次。由于小鼠应在48小时后开始恢复，此后每日监测一至两次，直至完全康复。
      1. 根据动物护理机构指南中规定的终点标准，对小鼠实施安乐死，方法为异氟烷过量麻醉后行颈椎脱位。必要时皮下注射生理盐水并给予支持性护理，例如补充恢复期饮食凝胶、花生酱或使用加热垫。

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结果

收集尿囊液
在从鸡胚中收集尿囊液时，液体应呈清澈透明状。如果液体浑浊发黄，则表明存在污染物。在纯化过程中若混入此类尿囊液，会导致纯化压力迅速上升并超过10 psi，从而引起病毒剪切，导致感染性病毒丢失。若尿囊液呈血性，提示鸡胚接种的病毒PFU数量过多。该批鸡胚的病毒产量将显著低于预期，且该病毒很可能无法用于体内实验。接种弱毒株新城疫病毒（lentogenic NDV）的鸡胚在72小时后仍应可见明显的血管系统，且胚胎应保持存活，如图1所示。若血管系统消失或胚胎死亡，则提示胚胎可能已受到损伤或污染。

碘克沙醇密度梯度超速离心
超速离心后，应在10%与20%梯度之间观察到一条高滴度、白色、含有新城疫病毒（NDV）的条带（图4B）。

SDS-PAGE 凝胶的考马斯亮蓝染色

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讨论

用于临床前研究的治疗性病毒必须经过高度纯化，以避免给药时产生毒性 体内15若未能去除外源性因子或污染物，可能导致严重的不良反应，从而抵消病毒制剂的治疗效果28由于新城疫病毒（NDV）是在鸡胚中生产的，其中含有多种污染性卵蛋白（如卵清蛋白），在使用前必须将其去除。 体内 在临床前或临床模型中29即使经过充分纯化，卵清蛋白中仍会发现29去除这些污染蛋白是一个严格的过程，需要耗费大量时间和资源。15,22如果新城疫病毒（NDV）能够在基于细胞的系统中以足够高的滴度生产，以满足所需水平 体内 应用，这可能会简化纯化过程并改善新城疫病毒（NDV）向 临床环境中。然而，基于鸡蛋的溶瘤性新城病毒（NDV）生产已用于多项人体临床试验30....

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

J.G.E.Y 获得了安大略兽医学院博士奖学金和安大略省研究生奖学金。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金资助，授予 SKW（项目编号 #304737）和 LS（项目编号 #401127）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶HyCloneSH30042.02
1 mL 滑动式针头注射器BD309659
10 mL 鲁尔锁式注射器BD302995
10% 聚维酮碘溶液LORIS109-08
15 mL 圆锥形离心管Thermo-Fisher14955240
18G × 1 1/2 英寸钝头填充针BD305180
18G × 1 1/2 英寸精密滑动针BD305196
25G × 5/8 英寸针头BD305122
2-巯基乙醇Thermo-Fisher03446I-100
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1BioRad1610158
4% 多聚甲醛-PBSThermo-FisherJ19943-K2
5 mL 鲁尔锁式注射器BD309646
96 孔组织培养板 - 平底Greiner Bio One655180
冰醋酸Thermo-FisherA38-212
琼脂糖FroggabioA87-500G
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体InvitrogenA11001
Allegra X-14 离心机Beckman CoulterB08861
过硫酸铵BioRad161-0700
漂白剂 (5%)Thermo-Fisher36-102-0599
宽头无齿镊Thermo-Fisher09-753-50
溴酚蓝Sigma-Aldrich114405-25G
Centramate 夹具架PALLCM018V
ChemiDoc XRS+BioRad1708265
CO2 培养箱Thermo-Fisher
考马斯亮蓝 R-259Thermo-FisherBP101-50
DF1 细胞ATCCCRL-12203
饮食凝胶恢复剂ClearH2O, INC72-01-1062
Digital 1502 Sportsman 孵化器Berry Hill1502W
D-甘露醇Sigma-AldrichM4125-500G
验蛋灯Berry HillA46
乙醇 (70%)Thermo-FisherBP82031GAL
乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液，pH 8.0，0.5 M 水溶液Thermo-FisherBP2482-500
尼龙材质，1/8 英寸 NPT(F) 内螺纹三通接头Cole-Parmer06349-50
胎牛血清Gibco12483-020
精细尖头高精度镊子Thermo-Fisher22-327379
荧光显微镜ZEISS AXIO若不进行免疫荧光检测或NDV不编码荧光蛋白，则非必需
Freezone 4.5 冷冻干燥系统LABCONCO
GiBOX 凝胶成像系统Syngene琼脂糖凝胶成像
甘油Thermo-FisherG33-1
甘氨酸Thermo-FisherBP381-5
高容量 cDNA 反转录试剂盒Thermo-Fisher4368814
高糖 Dulbecco 改良必需培养基CytivaSH30022.01
湿度套件Berry Hill3030
碘克沙醇Sigma-AldrichD1556水中 60% (w/v) 碘克沙醇溶液（无菌）
L-赖氨酸单盐酸盐Sigma-Aldrich62929-100G-F
1/8 英寸国家管螺纹 NPT 鲁尔锁公母接头Cole-Parmer41507-44
Masterflex L/S 数字驱动器Cole-ParmerRK-07522-20带数字显示的蠕动泵
Masterflex 精密管用 L/S 易装泵头Cole-ParmerRK-07514-10
Masterflex 硅胶管（铂金固化）L/S 16Cole-Parmer96420-16生物制药级铂金固化硅胶
MC Pro 5 梯度PCR仪EppendorfEP950040025
甲醇Thermo-FisherA412-4
Mini Protean Tetra 电泳槽BioRad1658000EDUSDS-PAGE 制胶与电泳装置
小鼠抗NDV抗体Novus BiologicalsNBP2-11633克隆株 6H12
正常山羊血清AbcamAB7481
NP-40Thermo-Fisher85124
Omega 膜 LV Centramate 夹具，100KPALLOS100T02
Optima XE-90 超速离心机Beckman CoulterA94471
OWL Easycast B1A 小型凝胶电泳系统Thermo-FisherB1A
PBS 10X 溶液Thermo-FisherBP399-20
聚乙二醇 平均分子量 20,000Sigma-Aldrich81300-1KG
PowePac 300BioRad型号 1655050 - 用于琼脂糖凝胶电泳
Q5 高保真 2X 预混液New England BiolabsM0492S
QIAamp 病毒RNA小型提取试剂盒Qiagen52904
RedSafeThermo-Fisher50999562
Slide-a-lyzer 透析夹具（高强度），10,000 MWCO，0.5–3 mLThermo-Fisher66380
十二烷基硫酸钠Thermo-FisherBP166-500
氢氧化钠（颗粒）Thermo-FisherS318-10
无特定病原体鸡蛋CFIANA供应商因地区而异
蔗糖Thermo-FisherS5-3
Supracap 50 深层过滤器PALLSC050V100P
手术剪Thermo-Fisher08-951-5
Sw41Ti 转子Beckman Coulter331362用于实验步骤 2.3.1、2.3.6、2.3.7
SX4750 转子Beckman Coulter369702
SxX4750 圆底管适配器Beckman Coulter359472
TEMEDInvitrogen15524-010
超透明薄壁离心管 (9/16 英寸 × 3 1/2 英寸)Beckman Coulter344059
Tris 碱Thermo-FisherBP152-5
管路螺钉夹PALL88216
吐温 20Sigma-AldrichP1379-1L
通用压力表Cole-Parmer68355-06

参考文献

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219(2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335(2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).

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