动态光散射（DLS）已成为评估静脉注射用铁-碳水化合物复合物粒径及其分布的合适检测方法。然而，现有方案缺乏标准化，需针对每种被分析的铁-碳水化合物复合物进行相应调整。本方案详细描述了铁蔗糖分析中DLS的应用及其特殊注意事项。
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本文内容
摘要
摘要
静脉注射的铁-碳水化合物纳米颗粒复合物被广泛用于治疗缺铁症。这类药物包含多种结构异质的纳米颗粒复合物，其对现有理化表征方法所需条件的敏感性各不相同。目前，铁-碳水化合物复合物的关键质量属性尚未完全确立。动态光散射（DLS）已成为测定完整颗粒尺寸及分布的基本方法。然而，在不同实验室间的方法标准化、针对不同铁-碳水化合物产品的特定操作调整，以及如何最优描述粒径分布等方面仍存在挑战。尤为重要的是，所用稀释液及系列稀释步骤必须实现标准化。在样品制备和数据报告方面方法差异较大，限制了DLS在不同铁-碳水化合物制剂间比较中的应用。本文中，我们详细描述了一种稳健且易于重复的实验方案，利用Z均粒径（Z-average）和多分散指数（polydispersity index）来测定铁-蔗糖复合物的颗粒尺寸及其分布。
引言
蔗糖铁（IS）是一种胶体溶液，由含有多核羟基氧化铁核心与蔗糖复合物的纳米颗粒组成。对于患有多种基础疾病、无法耐受口服补铁治疗或口服铁剂无效的患者，蔗糖铁被广泛用于治疗铁缺乏症1。根据美国食品药品监督管理局（FDA）的定义，蔗糖铁属于复杂药物类别，这类药物具有与生物制品相当的复杂化学结构2。对复杂药物产品的监管评估可能需要额外的正交物理化学方法和/或非临床或临床研究，以准确比较后续开发的复杂药物产品3,4。这一点至关重要，因为已有若干研究报道，使用原研蔗糖铁与后续开发的蔗糖铁产品在临床效果上并不相同。这凸显了采用新颖且正交的表征技术的重要性，这些技术应能够有效检测不同蔗糖铁产品之间在理化性质上的差异5,6。
准确阐明免疫原性物质（IS）的粒径及其分布具有重要的临床意义，因为粒径是影响调理作用速率和程度的主要因素，而调理作用是这类复杂药物体内分布的首要关键步骤。7,8即使颗粒大小和粒径分布的微小变化也与氧化铁纳米颗粒复合物药代动力学特征的改变相关9,10最近，Brandis 等人的一项研究表明，通过 DLS 测得的粒径存在显著差异（14.9 nm ± 0.1 nm 与 10.1 nm ± 0.1 nm）。 p < 0.001）时，分别比较参比列名药物与仿制的葡萄糖酸铁钠产品11铁-碳水化合物产品的批间质量、安全性和有效性完全依赖于生产工艺的放大，必须仔细考虑潜在的生产偏差。9制造工艺可能导致残留蔗糖，其含量会因生产商而异12制造工艺参数的任何变动都可能导致最终复杂药物产品在结构、复合物稳定性等方面发生显著变化 体内 处置9.
为了评估药物的一致性并预测其in vivo行为，需要采用现代正交分析方法来确定复杂纳米药物的理化性质。然而，目前方法学缺乏标准化，可能导致不同实验室在结果报告中存在较大差异13。尽管全球监管机构和科学界已认识到这些挑战14，但参照物标准品（IS）的大多数理化特性仍未得到充分定义，且在现有监管指南文件的背景下，尚未明确界定全部关键质量属性15。美国食品药品监督管理局（FDA）发布的针对铁-碳水化合物复合物的草案产品特异性指南文件建议将动态光散射（DLS）作为评估仿制产品粒径及粒径分布的方法16,17。
已有若干出版物详细描述了用于测定IS纳米颗粒尺寸的既定DLS方案13,18。然而，由于已发表方法在样品制备、实验条件、仪器类型及仪器参数设置方面存在差异，若缺乏标准化的结果解读方法，则无法直接比较不同DLS结果13,18。方法学和数据报告方式的多样性限制了对这些特性进行恰当的比较评估19。尤为重要的是，先前发表的许多用于评估IS的DLS方案未考虑悬浮液中游离蔗糖引起的蔗糖扩散效应，而该效应已被证明会虚假地提高胶体溶液中纳米颗粒的Z-平均水动力学半径13,18。本方案旨在标准化IS颗粒尺寸及其分布的测量方法，该方法已为此目的进行了开发与验证。
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方案
1. 机器的操作
- 启动机器和软件
注意： 补充图 S1A-D 描述了启动机器和软件的步骤。- 在开始测量前至少30分钟打开仪器，然后启动计算机。
- 双击 仪器软件图标 启动程序。
- 在登录窗口中输入用户名和密码。确保每位用户都有各自的账户。
- 等待右下角的三个黑色横条全部变为绿色，表示设备已准备就绪，可以运行。
- 若长时间不活动，用户将被自动注销，此时 安全, 点击 登录，然后重新输入密码。
- 创建测量文件
注意：每次测量开始时都会创建一个新的测量文件。所有测量数据均在该测量文件中列出并保存。有关此操作步骤的详细信息，请参见 补充图 S2A-B.- 单击以创建新的测量文件 文件 | 新建 | 测量文件在打开的窗口中，选择 储存位置，以及 名称 测量文件。通过点击确认详细信息 保存.
- 要打开文件，请单击 文件 | 打开 | 测量文件在打开的窗口中选择测量文件，通过点击确认详细信息 开放，选择 文件名，然后点击 保存.
- 打印结果
- 打印或保存系统适用性测试（SST）的结果（见步骤1.5）以及样品测量的平均值 补充图 S3.
- 标记测量位置 记录视图 的 测量文件.
- 右键单击 批量打印，然后等待另一个小窗口打开。
- 选择 PSD 强度报告 从选项中选择，并通过点击确认 好的.
- 开始测量的一般步骤
注意：启动测量的操作步骤在下文中描述 补充图 S4A-D按照下述路径查找所需的单元参数文件（称为SOP）：- 选择 必需的标准操作程序 从下拉列表中选择。由于最近使用过的标准操作程序会显示在列表中，如果需要使用较早的标准操作程序，请选择 浏览标准操作程序，然后单击确认 绿色箭头. 打开标准操作程序的存储位置后，继续执行步骤1.4.2。
注意：有关蔗糖铁特定的重要系统参数详情（例如衰减器的平衡时间），请参见 表1. - 在打开的窗口中，于相应位置填写所需信息 样本名称 和 注意事项. 通过点击确认 好的，等待测量窗口自动打开。
- 点击绿色按钮开始测量 开始 按钮
- 当测量结束时听到一声声学信号后，关闭 测量 窗口
- 选择 必需的标准操作程序 从下拉列表中选择。由于最近使用过的标准操作程序会显示在列表中，如果需要使用较早的标准操作程序，请选择 浏览标准操作程序，然后单击确认 绿色箭头. 打开标准操作程序的存储位置后，继续执行步骤1.4.2。
- 系统适用性测试（SST）测定
注意：不要触碰比色皿的下部（测量区）。在序列开始和结束时，测量20 nm粒子标准品。- 将约 1 mL 未稀释的颗粒标准品加入聚苯乙烯比色皿中，并盖上盖子。
注意：步骤 1.5.1 中配制的稀释标准品可使用 1 个月。 - 加样后，盖紧比色皿，检查是否存在气泡。若发现气泡，可轻轻敲击比色皿以去除。
- 将比色皿放入仪器的样品池中，确保其方向正确 箭头标记 面向前方，然后关闭测量室盖。
- 加载单元参数标准操作程序，并在启动窗口中输入以下数据：
样品名称：SST 20 nm 粒子标准品
然后，添加一条备注： 标准的编号和有效期 - 开始测量。
- 当测量结束并听到声音信号后，关闭测量窗口。
- 打印报告（参见第 1.1.3 节）。
注意：若粒径满足要求，则视为通过SST Z均值 对应于 分析证书所列数值的±10%.
- 将约 1 mL 未稀释的颗粒标准品加入聚苯乙烯比色皿中，并盖上盖子。
- 蔗糖铁溶液的测定
- 用移液管将0.5 mL含铁量为2% m/V的内标溶液加入25 mL容量瓶中，用低颗粒水（例如新近去离子并过滤[孔径0.2 µm]的水）定容至刻度；该溶液含铁0.4 mg/mL。
注意：步骤 1.6.1 中的样品制备采用此特定稀释比例是在方法开发过程中确定的，并被认定为达到该目的的最佳稀释比例。 - 初步清洗时，将聚苯乙烯比色皿装入约四分之三满的配制测量溶液，轻轻摇晃后尽可能彻底倒空。
注意：不要触碰比色皿的下部（测量区），且避免摇动比色皿以防止产生气泡。 - 测量时，用移液器将1 mL测量溶液加入比色皿中，并盖上盖子。
- 检查比色皿中的测量溶液是否有气泡。如有气泡，可轻轻敲击比色皿以去除。
- 用移液管将0.5 mL含铁量为2% m/V的内标溶液加入25 mL容量瓶中，用低颗粒水（例如新近去离子并过滤[孔径0.2 µm]的水）定容至刻度；该溶液含铁0.4 mg/mL。
- 进行测量
- 将装有测量溶液的塑料比色皿放入仪器中，注意方向 箭头标记 面向前方，然后盖上盖子。
- 加载参数SOP（参见步骤1.4.1），并在起始窗口中输入以下数据：
样本名称：批号 - 开始测量。
- 测量结束时，当听到声音信号后，关闭 测量 窗口
- 根据六次独立测量值计算平均值 补充图 S5. 在图中标出各个测量值 记录视图 的 测量文件，右键单击 生成平均结果，将平均值的名称添加在下方 样本名称，然后单击确认 好的.
- 等待软件在列表末尾创建一条新记录，并在该记录中查找输入的名称及平均结果。
- 打印报告（参见步骤 1.1.3）。
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结果
根据 ICH Q2(R1)20 对所述方法进行了验证，包括在不同条件下测定测试溶液。Z-平均粒径的精密度仅为 0.5% RSD，而多分散系数（PDI）的最大 RSD 为 3.5%。不同分析人员在不同日期测得的平均结果，Z-平均粒径仅相差 0.4%，PDI 仅相差 1.5%。统计数据来自两名分析人员在不同日期进行的 12 次测量。测试溶液浓度在 50%–200% 范围内的变化，以及测试溶液在冷藏条件下储存长达 5 天，均未对最终结果产生影响。
分析参数
Z-平均粒径
流体动力学直径以Z-平均粒径表示，该参数的测定方法在ISO 22412:201717中有明确定义。Z-平均粒径也称为累积平均值，是动态光散射（DLS）中最推荐使用的粒径参数，因为其计算过程在数学上具有良好的稳定性，且结果对噪声不敏感。根据欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的建议，Z-平均粒径与多分散系数（PDI）是表征纳...
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讨论
动态光散射（DLS）已成为药物开发和监管评价中用于测定纳米颗粒尺寸及其分布的基本分析方法。尽管DLS技术已取得进展，但在稀释剂选择和样品制备方面仍存在方法学上的挑战，这一点对于胶体溶液中的铁-碳水化合物复合物尤为突出。尤为重要的是，目前尚未在生物环境（例如血浆）中对铁-碳水化合物纳米药物的DLS方法进行广泛研究22。因此，根据不同稀释剂的选择，仍迫切需要统一最佳实践操作规程。稀释剂的选择至关重要，因为使用纯化水与等渗盐溶液可能会影响胶体悬浮液的稳定性16。
还需注意，不应将铁-碳水化合物复合物稀释至低于说明书推荐浓度，以避免因溶液颜色深、不透明而带来的操作困难。过度稀释不符合生物相关性，可能影响胶体悬浮液的稳定性。 通过 离子屏蔽的变化可能导致沉淀产生和结果报告不准确。在本方法开发过程中，测试了多种稀释比例和稀释液（未发表数据），最终确定并验证了方案步骤1.6.1中所述的样品制备条件为IS的最佳稀释方案。在进行铁-碳水化合物复合物的DLS分析时，需考虑若干项改进措施。例...
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披露
M.B.、E.P.、M.W. 和 A.B. 是Vifor Pharma的员工。G.B. 是Vifor Pharma的顾问。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | NA | 配备 Zetasizer 软件 7.12、氦氖激光器（633 nm，最大功率 4 mW）和 173°背向散射几何结构 |
| 材料 | |||
| 一次性塑料比色皿 | |||
| LLG-一次性塑料比色皿 | LLG labware | LLG-Küvetten, Makro, PS；货号 9.406011 | |
| 低颗粒水 | （建议使用新鲜去离子并过滤（孔径 0.2 μm）的水）。 | ||
| 微量移液器 | |||
| Venofer 100 mg/5 mL | Vifor Pharma | ||
| 25 mL 容量瓶 | |||
| Nanosphere | Thermo | 3020A | 颗粒标准品 |
| 软件 | |||
| Origin Pro v.8.5 | Origin Lab Corporation |
参考文献
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