单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

摘要

本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性 robust，与来源于哺乳动物细胞裂解液的马达蛋白相当。因此，Sf9-杆状病毒系统适用于目标马达蛋白的表达与纯化。

摘要

复杂的细胞环境为单分子运动分析带来了挑战。然而，成像技术的进步显著推动了单分子研究的发展，并在检测和理解荧光标记分子动态行为方面获得了广泛应用。本文详细描述了一种方法 体外 使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对驱动蛋白-3家族马达进行单分子研究。驱动蛋白-3是一个庞大的家族，在从细胞内货物运输、细胞分裂到发育等多种细胞和生理功能中发挥关键作用。我们先前已证明，在哺乳动物细胞中表达驱动蛋白并制备细胞裂解液后，通过单分子水平的研究发现，组成性活化的二聚体驱动蛋白-3马达表现出快速且超程性的运动特性，并具有高微管亲和力。本实验室采用细胞生物学、生物化学和生物物理方法研究驱动蛋白-3马达及其调控机制，此类研究需要大量纯化的蛋白质。若使用哺乳动物细胞表达和纯化这些马达蛋白，成本高昂且耗时；而在原核表达系统中表达则导致蛋白显著聚集 非活性蛋白。为了克服细菌表达系统和哺乳动物细胞裂解液纯化系统所带来的局限性，我们建立了稳定的Sf9-杆状病毒表达系统，用于表达和纯化这些分子马达。驱动蛋白-3（kinesin-3）马达在C末端连接了3个串联的荧光蛋白标签（3xmCitrine或3xmCit），可提供更强的信号并减少光漂白。 体外 使用Sf9纯化蛋白进行的单分子与多马达滑动分析表明，驱动蛋白-3马达具有快速且超程性的特征，这与我们先前使用哺乳动物细胞裂解液的研究结果相似。这些检测方法的其他应用包括深入了解马达蛋白的寡聚状态、与生物化学研究相对应的特异性结合伴侣，以及其动力学状态。

引言

细胞内高度拥挤的环境给靶向蛋白质和分子的分选带来了诸多挑战。细胞质中分子的组织及其时空分布这一繁重任务，主要由分子马达和细胞骨架轨道系统来完成。分子马达是一类能够水解ATP等能量分子并利用所释放能量产生运动和力的酶¹。根据氨基酸序列的相似性，驱动蛋白被分为14个家族，尽管存在序列相似性，但每种马达蛋白在细胞功能中均发挥独特作用。其中，驱动蛋白-3家族是最大的家族之一，包含五个亚家族（KIF1、KIF13、KIF14、KIF16和KIF28）²，参与多种细胞和生理功能，包括囊泡运输、信号转导、有丝分裂、细胞核迁移以及发育过程^3,4,5。驱动蛋白-3运输功能的障碍与多种神经退行性疾病、发育缺陷以及癌症密切相关^6,7,8,9。

近期研究表明，驱动蛋白-3（kinesin-3）马达蛋白在游离状态下为单体，但在货物分子的诱导下可形成二聚体，从而表现出比传....

方案

1. Sf9 细胞培养、转染及病毒制备

注意：将 Sf9 细胞维持在 100 mL 无菌一次性锥形瓶中的 30 mL Sf-900/SFM 培养基中，不添加任何抗生素或抗真菌剂，于 28 °C 培养。将悬浮培养物置于摇床中，以 90 rpm 振荡培养。无需提供 CO₂ 或维持湿度。通常每四天传代一次，接种密度为 0.5 × 10⁶ 个细胞/mL，至第四天细胞密度达到 2.0 × 10⁶ 个细胞/mL。

1. P0 病毒原液制备
   1. 用于转染时，将细胞以 4.5 × 10⁵ 个细胞/mL 的密度接种至 35 mm 培养皿中，并在 28 °C 下静置培养。
   2. 24 小时后，待细胞贴壁且状态良好，按以下步骤进行转染：
      1. 试管 A：将编码组成型活性 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG 特异性驱动蛋白-3 马达的 1 µg 杆状病毒 DNA 与 100 µL 未添加补充物的 Grace's 培养基混合。
      2. 试管 B：将 6 µL 转染试剂与 100 µL 未添加补充物的 Grace's 培养基混合。
      3. 小心地将

结果

为了利用Sf9-杆状病毒表达系统大规模表达和纯化具有活性和功能的重组运动蛋白，需要先生成稳定携带编码序列的病毒颗粒，以感染Sf9细胞。为此，将编码KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG的重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞中。72小时后，大量细胞显示出绿色荧光蛋白（mCitrine）的表达，并伴有细胞和细胞核的增大（图1 和 图2），表明已成功生成病毒颗粒（P0代）。随后，通过用较大体积的P0代病毒颗粒感染新鲜的Sf9细胞群体，进一步扩增病毒，以制备可用于储存和大规模感染的P1代病毒储备液。为纯化驱动蛋白-3（kinesin-3）马达结构域，使用1 mL P1代病毒颗粒感染30 mL Sf9细胞培养物。感染72小时后，收集强烈表达绿色荧光蛋白的细胞，进行裂解，并利用连接有抗FLAG抗体的树脂，通过C端FLAG标签亲和层析进行纯化。有趣的是，向结合了驱动蛋白-3马达的树脂中加入FLAG肽后，大部分目标蛋白以单个洗脱组分被洗脱下来，所得纯化蛋白纯度很高，在图3

讨论

Sf9-杆状病毒表达系统是高通量蛋白质生产的最通用且最成功的方法之一^19,36,37。Sf9细胞的翻译后修饰能力与哺乳动物系统高度相似¹⁵。使用该系统的一个显著缺点是操作周期较长且易受污染。其中最关键的步骤是实现Sf9细胞的高效感染和成功表达，这要求在无任何污染的情况下对Sf9细胞进行正确的操作和培养维护。该系统需要专用的无尘空间以及恒温培养箱和摇床等仪器设备。不规范的细胞培养操作或使用过度生长的培养物将导致感染效率低下、生长缓慢以及显著的细胞死亡。

在Sf9细胞中表达的蛋白进行FLAG标签纯化具有多项优势。首先，Sf9细胞可被高效裂解，从而获得大部分处于活性和可溶形式的蛋白。其次，与HIS和GST树脂相比，FLAG树脂的非特异性蛋白吸附更少。³⁸因此，大量蛋白质以单一洗脱步骤被纯化释放。在生化ATP酶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sf9 细胞培养与转染材料
抗 FLAG M2 亲和树脂	Biolegend	651502	用于蛋白纯化
抑肽酶（Aprotinin）	Sigma	A6279	用于蛋白纯化
Cellfectin	Invitrogen	10362100	用于 Sf9 细胞转染
DTT	Sigma	D5545	用于运动性分析和蛋白纯化
FLAG 肽段	Sigma	F3290	用于蛋白纯化
甘油	Sigma	G5516	用于蛋白冷冻保存
HEPES	Sigma	H3375	用于 Sf9 细胞裂解缓冲液
IGEPAL CA 630	Sigma	I8896	用于 Sf9 细胞裂解缓冲液
KCl	Sigma	P9541	用于缓冲液配制
亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）	Sigma	L2884	用于蛋白纯化
MgCl2	Sigma	M2670	用于缓冲液配制
NaCl	Sigma	S7653	用于裂解缓冲液配制
PMSF	Sigma	P7626	用于蛋白纯化
Sf9 细胞	由印度浦那印度科学教育与研究所 Thomas Pucadyil 博士惠赠		用于杆状病毒表达系统及蛋白纯化
Sf9 细胞培养瓶	Thermo Scientific	4115-0125	用于悬浮培养
Sf-900/SFM 培养基（1X）	Thermo Scientific	10902-096 -500ml	用于 Sf9 细胞培养
蔗糖	Sigma	S1888	用于配制 Sf9 细胞裂解缓冲液
未添加补充物的 Grace’s 培养基	Thermo Scientific	11595030 -500ml	用于 Sf9 细胞转染
微管聚合与单分子分析材料
ATP	Sigma	A2647	用于运动性与滑动分析
BSA	Sigma	A2153	用于封闭运动性分析室
过氧化氢酶（Catalase）	Sigma	C9322	用于运动性与滑动分析
DMSO	Sigma	D5879	用于溶解罗丹明
EGTA	Sigma	3777	用于缓冲液配制
葡萄糖	Sigma	G7021	用于运动性与滑动分析
葡萄糖氧化酶	Sigma	G2133	用于运动性与滑动分析
GTP	Sigma	G8877	用于微管聚合
KOH	Sigma	P1767	用于配制 PIPES 缓冲液（pH 6.9）
PIPES	Sigma	P6757	用于配制运动性与滑动分析缓冲液
微管滑动分析材料
26G 针头	Dispovan		用于剪切微管
酪蛋白（Casein）	Sigma	C3400	用于微管滑动分析
GFP 纳米抗体	由美国明尼苏达大学 Sivaraj Sivaramakrishnan 博士惠赠		用于将马达蛋白固定于盖玻片
罗丹明	Thermo Scientific	46406	用于制备标记微管蛋白
显微镜及其他仪器
0.5 ml、1.5 ml 和 2 ml 微量离心管	Eppendorf		用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化
10 ml 一次性无菌移液管	Eppendorf		用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化
10 μl、200 μl、1 ml 移液器吸头	Eppendorf		用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化
15 ml 锥形管	Eppendorf		用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化
35 mm 细胞培养皿	Cole Palmer	15179-39	用于 Sf9 细胞培养
天平	Sartorious		量程：0.01 g - 300 g
台式轨道摇床培养箱	REMI		用于 28°C 下 Sf9 悬浮培养
相机	EMCCD Andor iXon Ultra 897		用于 TIRF 成像与图像采集
双面胶带	Scotch		用于构建运动性分析室
玻璃盖玻片	Fisherfinest	12-548-5A	尺寸：22×30
载玻片	Blue Star		用于构建运动性分析室
加热块	Neuation		用于溶解石蜡
倒置显微镜	Nikon Eclipse Ti-U		用于检测蛋白表达
激光器	488 nm（100 mW）		用于 TIRF 成像
液氮			用于样品冷冻与储存
微毛细管加样尖端	Eppendorf	EP022491920	用于剪切微管
显微镜	Nikon Eclipse Ti2-E，配备 DIC 装置		用于 TIRF 成像
小型离心机（Mini spin）	Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd		用于快速离心
物镜	100X TIRF 物镜，数值孔径 1.49，油浸		用于 TIRF 成像
Optima UltraCentrifuge XE	Beckman Coulter		用于蛋白纯化
Parafilm 封口膜	Eppendorf
pH 计	Corning	Corning 430	用于调节 pH
移液器助吸器（Pipette-boy）	VWR		用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化
Sorvall Legend Micro 21	Thermo Scientific		用于蛋白纯化
Sorvall ST8R 离心机	Thermo Scientific		用于蛋白纯化
ThermoMixer	Eppendorf		用于微管聚合
超速离心转子	Beckman Coulter		SW60Ti 转子
超速离心管	Beckman		5 mL，开口薄壁透明超速离心管，13 × 51 mm
涡旋混合器	Neuation		用于样品混匀
石蜡	Sigma	V001228	用于密封运动性分析室