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方法文章

坐骨神经的制备 离体 神经生理学

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DOI：

10.3791/63838

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2022年7月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Electronic Engineering, Imperial College London, 2Centre for Bioinspired Technology, Imperial College London, 3Care Research and Technology (CR&T), Imperial College London and the University of Surrey, 4Dementia Institute (UK DRI), 5Department of Bioengineering, Imperial College London

本文内容

摘要

本方案描述了大鼠坐骨神经全组织的制备方法 离体 在环境可控的双室灌流生理盐水浴中进行电生理刺激与记录

摘要

离体（ex vivo）制备方法能够在脱离机体整体环境的情况下研究多种神经生理过程，同时保持局部组织结构的完整性。本文描述了用于离体神经生理学研究的大鼠坐骨神经制备方法，包括缓冲液配制、动物操作、设备设置以及神经生理信号记录。本文还概述了利用该方法可开展的各类实验类型。所述方法旨在对离体的周围神经组织在严格控制的条件下进行长达6小时的刺激与记录，以获得高度一致的实验结果。采用该方法所获得的结果为A类纤维的复合动作电位（CAP），在整个实验过程中，其峰-峰振幅可达毫伏（mV）量级。CAP的振幅和波形具有良好的一致性和可重复性，因此适用于测试和比较新型电极与现有电极模型的性能，或评估各类干预手段对神经组织的影响，例如化学物质的应用、手术操作改变或神经调控刺激技术。实验中测试了两种电极：一种是带有铂-铱接触点的传统商用套管电极，另一种是自制的导电弹性体电极；两者在神经刺激的强度-时程响应方面表现出相似的结果。

引言

目前对基本神经功能的in silico建模理解在多个方面仍存在不足，尤其是关于神经组织在胞体、轴突和树突之外的区室化效应。轴突-髓鞘相互作用至今仍 poorly 被理解，这一点可由如下事实证明：即使是能够充分模拟哺乳动物神经常规电刺激反应的详细计算神经模型（如MRG1），也无法再现其他实验中观察到的现象，例如高频阻滞的持续效应2或继发性激活反应3。

本方案提供了一种在急性小型实验动物模型中高效研究神经水平神经生理学过程的方法，通过标准化的制备流程来分离神经、控制其环境并将其从周围组织中分离出来 体内 上下文到一个 离体 上下文。这将防止其他身体过程或使用的麻醉剂干扰 体内 神经刺激方案以改变神经活动并干扰测量结果或其解释4,5这有助于建立更加真实的模型，以专注于研究目前尚不明确的神经组织特异性效应。该方案还可作为新型神经刺激与记录电极材料、几何构型以及新型刺激范式（如高频阻断）的测试平台。2,3该技术的多种变体此前已被用于在高度受控条件下研究神经生理学6，例如，用于测量离子通道的动力学特性、性质或局部麻醉药的作用效果7.

与急性方法等替代技术相比，该技术具有多种优势 体内 小型动物实验8该技术由于组织已从体内取出，无需维持麻醉深度，从而减少了对麻醉扩散器、氧气浓缩器和加热垫等设备的需求。这简化了实验流程，降低了出错风险。由于麻醉剂可能影响神经功能4，该技术可确保这些麻醉化合物的副作用不会干扰检测结果。最后，与急性实验相比，该技术更为合适 体内 在研究河豚毒素等神经毒性化合物的影响时，此类实验可避免因麻醉动物瘫痪而致死的情况。

周围神经切片是一种独特的ex vivo系统，因为记录到的神经信号所对应的神经纤维很可能不包含任何胞体。这些胞体通常位于脊髓（运动神经元）或脊髓旁的背根神经节（感觉神经元）中，因此哺乳动物神经切片可大致建模为两端开放、含有离子通道的管状膜结构集合9。组织离体时轴突中已存在的线粒体可维持其代谢活动10。提取后建议缝合轴膜的开放末端，以封闭两端，从而有助于维持膜上现有的离子梯度，这对神经的正常功能至关重要。

为了在体外维持组织稳态，必须严格控制多种环境变量，包括温度11、供氧12、渗透压、pH13,14，以及葡萄糖的供应以维持代谢。本实验方案采用持续用氧气和二氧化碳混合气体进行通气的改良克雷布斯-亨塞尔特缓冲液（mKHB）15,16。mKHB属于心肌停搏缓冲液家族6,17，常用于在体外保存离体组织，例如在离体（ex vivo）实验中。这些缓冲液不含血红蛋白、抗生素或抗真菌剂，因此仅适用于短时间内处理少量组织的实验。pH通过碳酸盐与二氧化碳的氧化还原对进行调控，需持续向缓冲液中通入二氧化碳以维持pH平衡。此举可避免使用其他常见的缓冲剂（如HEPES），因其可能影响神经细胞功能18。为实现缓冲液的氧合和pH调控，采用含5%二氧化碳的氧气混合气体（称为碳合气，carbogen，95% O2, 5% CO2）。使用加热搅拌器控制缓冲液容器的温度，缓冲液经神经浴灌流后，再循环回起始容器。典型的实验可持续6–8小时，之后神经组织将失去活性，对刺激的反应不足以代表健康组织的生理状态。

为了优化信噪比，采用氯化银电极进行记录，该电极的制备方法参照先前已描述的方法19。对于刺激，可结合使用市售的铂金袖状电极和自制的导电聚合物袖状电极。导电聚合物袖状电极具有显著更高的电荷容量，在使用高幅值波形刺激神经时尤为有用20。

本方案中使用的刺激器此前已有描述20。其相关文档、设计文件和使用软件脚本均已公开21。其他刺激器也可用于执行本方案；然而，该定制刺激器还具备高频交流电（HFAC）阻断功能2,20，从而可支持更广泛的神经生理学实验。若需使用HFAC阻断，建议采用导电弹性体套管，以避免对神经造成损伤。导电弹性体神经套管是一种柔软且完全由聚合物构成的电极阵列，其导电部分由导电弹性体构成，绝缘部分则由聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成22。这些器件采用常规激光微加工技术制备为双极构型。

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方案

所有动物护理和操作均在英国政府内政部根据《动物（科学程序）法案》（1986年）颁发的适当许可证下进行，并已获得伦敦帝国理工学院动物福利与伦理审查委员会的批准。

1. 缓冲液的配制

注意：除最后涉及制备1倍浓度改良克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（mKHB）的步骤外，本实验方案的这一部分可提前较长时间进行。

  1. 配制 1 M CaCl2 储存液
    1. 将 14.701 g 二水合氯化钙（CaCl2）加入洁净的 100 mL 烧杯中，加入约 75 mL 去离子水，搅拌至盐完全溶解。
    2. 将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，用去离子水定容至 100 mL。将溶液转移至试剂瓶中，并于 4 °C 冰箱中保存。
  2. 配制 10 倍浓缩的 mKHB 储存液
    1. 在 2 L 烧杯中加入 66.03 g 氯化钠（NaCl）、3.57 g 氯化钾（KCl）、1.63 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）和 1.44 g 硫酸镁。
    2. 向烧杯中加入约 750 mL 去离子水，搅拌至盐类溶解（底部可能残留少量盐晶体）。加入 25 mL 1 M CaCl2 储存液（步骤 1.1），并充分搅拌；确保此为最后加入的盐溶液。
    3. 将溶液转移至 1 L 容量瓶中，用去离子水定容至 1 L。将溶液转移至 1 L 试剂瓶中。将浓缩的 10× mKHB 储存液于 4 °C 冰箱中保存。
      NOTE：浓缩 mKHB 储存液可在更换前保存约 1 个月。
  3. 制备解剖用培养皿（涂层）
    1. 通过仔细清洗并干燥，准备一个洁净的玻璃培养皿（直径 120 mm），用于涂层处理。
    2. 按照保形烷氧基涂层产品的使用说明和固化要求，小心地将涂层混合物倒入培养皿中，使底部形成约 3–5 mm 厚的涂层，直至达到所需厚度。
    3. 将涂层置于 60 °C 烤箱中固化，直至触感坚硬。解剖用培养皿现已制备完成。
      ​NOTE：每次使用后轻柔清洗，可确保涂层多年无需更换。更换涂层时，务必在涂覆新涂层前彻底清除所有旧涂层材料。请注意，本实验方案中使用的保形烷氧基涂层（材料表）保质期不足一年。

2. 解剖前准备

注意：此步骤为实验的起始步骤。以下步骤必须在同一天内按此顺序完成。

  1. 配制1x mKHB
    1. 准备一个洁净的2 L烧杯用于配制缓冲液。将200 mL的10x mKHB储备液转移至2 L烧杯中，加入2.1 g碳酸氢钠（NaHCO3）和0.99 g无水右旋糖（D-葡萄糖）。
    2. 向烧杯中加入约1 L去离子水，搅拌至盐类完全溶解。将溶液转移至2 L量瓶中，并用去离子水定容至总体积2 L。
    3. 将溶液转移至一个置于加热磁力搅拌器上的2 L玻璃瓶中，设置温度为37 °C。
      注意：由于盛水容器体积较大，热惯性较强，较小的加热磁力搅拌器通常难以达到目标温度37 °C。应适当调高设定温度，使瓶内溶液在搅拌条件下达到37 °C。实验过程中需持续监测温度，若出现超调应及时降低设定温度。
    4. 将温度计插入2 L玻璃瓶中以监测温度，使用夹具固定温度计，防止其受到搅拌子碰撞。用碳合气（carbogen）对缓冲液进行至少30分钟的通气，以充分氧合溶液，使pH值稳定在7.4。使用pH计测量溶液pH值，确保其在37 °C下处于7.4 ± 0.1 pH单位范围内。
      注意：如需调节pH至7.4，可根据需要使用盐酸或氢氧化钠溶液进行调整。
    5. 取两个15 mL离心管和一个100 mL试剂瓶，装入mKHB后置于冰上冷却。
      注意：每次实验后，这些离心管和试剂瓶可清洗后重复使用，无需高压灭菌。
    6. 在后续实验阶段，需持续在37 °C条件下对2 L玻璃瓶中的缓冲液进行碳合气通气，并保持搅拌。
      注意：若无自动系统可在气体泄漏时关闭气流，则无人看管使用碳合气可能存在危险。建议配备自动传感器和电子截止阀以降低风险；否则，若解剖操作在其他房间进行，必须安排专人监管设备。在任何情况下，均应在装置附近安装氧气传感器，当环境氧浓度超过25%时及时警示操作人员。如有可能，应在具备主动通风条件的房间内进行操作。
  2. 开启信号采集设备、低噪声前置放大器、工频噪声滤波器以及示波器，用于记录和刺激，预留足够时间以确保设备温度稳定。
  3. 确保所有电生理记录设备正确配置
    1. 将低噪声前置放大器设置为交流耦合输入，输入带通滤波器设置为每十倍频程6 dB滚降，高通和低通滤波器的截止频率分别设为30 Hz和3 kHz。
    2. 将低噪声前置放大器的增益设为100。

3. 动物麻醉与安乐死

注意：实验选用体重在250至330克之间的雌性大鼠（材料表）。

  1. 准备手术器械和耗材：12 cm直剪（钝头）；2 mm刃口角度弹簧剪；4 cm精细剪，锐利或半锐利；#7杜蒙镊；45°角精细镊，以及6-0缝合丝线或缝线。
  2. 将大鼠放入麻醉容器或麻醉室中。连接氧气和麻醉气体扩散器至容器。设定麻醉剂（异氟烷）浓度为3.5%，等待约10分钟，或直至动物出现麻醉迹象，如翻正反射消失。
  3. 当大鼠出现麻醉迹象后，通过脚趾夹捏回缩反射测试确认意识丧失。只有在无脚趾回缩反应时方可继续操作；否则，检查所有连接及扩散器中的麻醉剂浓度，并重复步骤3.2。
  4. 将动物从容器中取出，进行颈椎脱位，随后切开股动脉以确认死亡。

4. 解剖方案

注意：将动物腹部朝下放置在解剖台上。对两条腿重复以下步骤。通常先解剖右侧腿。

  1. 用拇指、食指和中指牢固握住脚踝，使用12 cm直头钝头剪刀切断跟腱。
  2. 用精细的锐利剪刀从跟腱处沿腿部背面做皮肤切口，一直延伸至脊柱基部，注意不要损伤下方的肌肉组织。
  3. 使用精细镊子和精细剪刀，小心地切开腿部背面中部附近的肌肉层，直至暴露出坐骨神经。一旦看到坐骨神经，立即用冰冻的mKHB润湿创腔，防止神经干燥。
  4. 使用止血钳将两侧皮瓣拉开，并保持切口开放以便进行更精细的解剖操作。从跟腱切口位置开始，用精细剪刀切断腿部内侧的肌肉以游离神经。持续使用冰冻的mKHB保持该区域湿润。
  5. 随着沿腿部向上暴露神经，逐步分离覆盖在神经上方的肌肉组织。从结缔组织中游离靠近脊柱的神经部分，直至到达脊裂处，此处神经会出现弯曲。此阶段无需清理神经，因速度至关重要。
  6. 用精细剪刀尽可能靠近脊柱处切断神经。为便于解剖操作，可用镊子非常轻柔地牵拉靠近脚踝端的神经末端。切勿夹捏神经中段，仅可操作其末端。切勿将神经拉紧。
    可选步骤：若时间允许，此时可对神经两端进行缝合，以帮助维持其活性。操作应尽量轻柔，减少对神经的损伤。若时间不足（见步骤4.5），可跳过此步骤，稍后执行步骤5.2。
  7. 将解剖好的神经放入盛有mKHB（步骤2.1.5）的15 mL离心管中，盖紧管盖，并将离心管放回冰上，直至开始清洁步骤。
  8. 对另一条腿重复步骤4.1–4.7。理想情况下，每条神经的提取应在5–10分钟内完成，以最大程度保持组织活性。

5. 神经清理步骤

  1. 将冰冷的充氧mKHB加入已包被的培养皿中，至约一半高度。取一条已解剖的坐骨神经放入培养皿中，并用昆虫针将神经两端固定在皿底，使神经保持平直，无弯曲、扭转或螺旋。固定时应尽可能靠近神经末端。
  2. 使用6-0丝线或细线，在神经每一端绑一个双结，以防止胞质液泄漏至缓冲液中。打结位置应紧邻靠近神经中心一侧的昆虫针处，以防止神经组织液渗入缓冲液。若神经此前已结扎，则无需执行此步骤。
  3. 在显微镜下使用2 mm角度弹簧剪精细操作，去除神经上的脂肪、血管和肌肉组织。剪除在刺激与记录实验中不需要使用的任何神经分支。
    1. 每清洁5分钟，更换一次缓冲液，使用新鲜的冰冷充氧mKHB。使用精细镊子牵拉结缔组织、脂肪和血管，以辅助解剖操作。
  4. 将神经重新放回装有新鲜冰冷充氧mKHB的运输管中，并将运输管置于冰上保存。

6. 仪器设备设置

注意：用于进行实验的设备设置如图1所示。简而言之，该系统包括一个双室神经浴槽、一个置于加热搅拌器上的2 L瓶子、用于缓冲液通气的碳酰气（carbogen）气源，以及通过蠕动泵将缓冲液从瓶子输送至浴槽并回流至瓶子的管路系统。浴槽可由有机玻璃加工制成，或使用防水材料3D打印而成。其深度约为2 cm，分隔两个腔室的隔板上设有一个直径为1.5 mm的孔，以便将外周神经穿过两个腔室。其中一个腔室较大，长度至少为4至5 cm，用于盛装缓冲液；另一个腔室长度应至少为3 cm，用于盛装硅油或矿物油。浴槽不宜过大，否则会影响灌流、温度和pH的控制。根据所研究神经组织的大小，可能需要使用不同尺寸的浴槽。

  1. 准备一个洁净的双室神经浴装置（设计规格详见补充文件）。使用标准实验室万用夹和夹具，将神经浴置于加热磁力搅拌器上的2 L试剂瓶下方。将神经浴的排水口连接至蠕动泵的进液端。
  2. 将蠕动泵的出液端连接至一根回流至2 L缓冲液瓶的导管。将神经浴的进液口连接至一根带有可调流速阀的导管，并将该导管插入2 L试剂瓶中。使用一个三通阀，其中间出口连接注射器，以辅助通过虹吸作用引液，实现重力驱动的缓冲液流入。
  3. 通过抽拉注射器启动虹吸，直至缓冲液流入注射器。调节阀门，使缓冲液流入神经浴的流速约为5–6 mL·min-1。初始时可适当提高流速以加快注满神经浴。当神经浴中的液面达到排水口高度后，将神经组织放入浴槽中。
  4. 使用昆虫针将神经一端固定在充满缓冲液的浴槽角落处。使用45°角精细镊子，仅夹持神经的末端，小心地将待刺激的神经穿过两个浴槽之间的隔板上的孔洞。
  5. 用昆虫针将神经的另一端固定在神经浴的油室中，确保神经平直但未被拉伸，且无扭曲或折弯。使用硅脂密封，防止缓冲液从缓冲室泄漏至油室。向油室中加入硅油或矿物油。
  6. 将Ag/AgCl记录电极钩置于油室中，并使用万用夹和夹具固定。将神经在油室中的部分轻轻搭在电极钩上，避免拉紧神经。切勿夹压神经；使用斜角镊子轻轻提起神经，避免施加压力。
  7. 若移动神经后观察到任何泄漏，应调整或重新修补硅脂密封。
  8. 将参考Ag/AgCl电极连接至放大器接地端，并使用实验室夹具将其固定于充满缓冲液的浴槽中。

7. 在浴液中对神经进行电极植入

  1. 根据参考文献21准备一个洁净的神经套管电极用于刺激。将电极置于盛有缓冲液的浴槽中。使用镊子或尖端钝化或呈角度的精细镊子，在浴槽中打开电极，使套管内部润湿。
  2. 若仍有气泡存在，使用细针筒从浴槽中吸取缓冲液，并将气泡从套管中排出。在神经下方用镊子轻轻打开套管，将其滑入神经下方。闭合套管以包绕神经，注意避免神经发生任何弯曲或扭转。
  3. 将刺激电极连接至刺激器，并用胶带固定刺激电极导线。将电流回路电极连接至刺激器，并用胶带固定导线。若使用方形铂片作为电流回路电极，应将其置于浴槽中远离神经的位置。

8. 刺激与记录

  1. 将刺激器的TTL信号输出连接到示波器的第4通道，该通道将用于触发示波器。在示波器屏幕上，按下触发通道标签，并将第4通道设置为触发通道。使用电平旋钮将触发阈值设为1 V。
  2. 在示波器上，将时间分辨率设为1 ms/格，电压分辨率设为10 mV/格。将触发参考时间居中，并将触发电平设为1 V。
    注意：如果使用定制刺激器（见材料表），请执行步骤8.3至8.6。假设已根据网上公开提供的定制神经刺激器说明，在实验室计算机上安装了MATLAB软件和设备驱动程序21。否则，请按照商用刺激器制造商的说明进行操作。
  3. 将刺激器连接至实验室计算机。通过将电池电源连接至电源输入端来开启刺激器。在实验室计算机上启动MATLAB软件。
  4. 运行定制的MATLAB脚本：HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m（材料表）。
    注意：计算机与刺激器之间的USB通信线缆应闪烁绿光。若无绿光闪烁，则存在配置错误，需检查电源和连接。
  5. 打开MATLAB脚本：HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m（材料表）。通过直接编辑MATLAB脚本，设置以下参数：刺激器脉冲幅度 = -300 µA，刺激器脉冲宽度 = 300 µs，刺激器脉冲数量 = 10，刺激器脉冲间时间间隔 = 1 s。
  6. 在MATLAB软件中点击运行，启动刺激程序。

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结果

采用本方案可获得的代表性结果为坐骨神经中A型神经纤维产生的一致的复合动作电位。这些动作电位在电极处的峰-峰幅值通常约为1 mV，经放大后可达100 mV（图2）。相似的刺激强度和脉冲宽度应产生相似的CAP幅值。与 commercially available 铂金袖状电极相比，导电弹性体袖状电极通常需要略高的刺激强度才能达到相同的CAP幅值。然而，这种差异通常小于因刺激来自不同动物的神经所需刺激强度的个体间变异。这是因为无论袖状电极材料如何，神经尺寸和袖状电极贴合度的微小差异都会对获得特定CAP幅值所需的刺激强度产生显著影响。该系统可用于测试不同缓冲液成分的影响，例如不同离子浓度，或添加河豚毒素等神经兴奋性或抑制性物质。若将缓冲液废液管路引至额外容器，则可实现神经兴奋性调节物质的暂时性添加，其洗脱速率取决于缓冲液流入速率。

将激活A型纤维并在示波器上获得可观察的复合动作电位所需的最小电流密度（计算方法为刺激幅度除以刺激电极的表面积）对脉冲宽度作图，结果如图3所示。...

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讨论

在本研究中，我们描述了一种制备大鼠坐骨神经用于离体神经生理学实验的方案。ex vivo 组织提取过程大约需要30分钟，包括动物操作、麻醉、处死和解剖；而神经清理、置于浴槽中以及电极植入则还需额外约30分钟，之后方可开始记录。缓冲液的配制可在30分钟内完成，但也可在实验其他步骤之前提前准备。此类制备方法和实验此前已有应用和报道7,12，所用缓冲液相似，且针对相同类型的组织。据作者所知，本文首次在同一份文档中完整描述了缓冲液配制、解剖过程、设备组装及后续记录的全部步骤。

该方案可实现多种神经生理学实验，而这些实验在以往条件下均无法完成 体外 或 体内 情境中。例如，一个优势是 离体 制备方法的优势在于其能够在将组织从机体其余部分分离的同时，保持所提取组织的宏观和微观结构。这使得实验装置更为简便，因为无需维持麻醉状态，而麻醉在其他情况下通常是必需的 体内 实验。在支持实验开展方面， ...

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披露

作者无利益冲突。

开放获取声明：
为了开放获取的目的，作者已对由此产生的任何作者接受稿件版本应用了知识共享署名（CC BY）许可（在英国研究与创新署（UKRI）允许的情况下，可改用“开放政府许可”或“知识共享署名-禁止演绎（CC BY-ND）许可”）。

数据共享：
作者将提供本文图表所用的原始数据，且不会设置不当限制。

致谢

作者感谢美国宾夕法尼亚州普鲁士王市葛兰素史克制药公司及加尔瓦尼生物电子公司（英国史蒂夫尼奇）的 Gerald Hunsberger 博士向我们分享了其原始的神经制备技术。作者感谢 Robert Toth 提供双室神经浴设计。作者感谢工程与物理科学研究理事会（EPSRC）医疗技术挑战奖（HTCA）基金的资助。作者感谢帝国理工学院高性能嵌入式与分布式系统博士培训中心（HiPEDS CDT）对 Adrien Rapeaux 的资助（项目编号：EP/L016796/1）。Adrien Rapeaux 目前由英国痴呆症研究所护理与技术研究中心资助。 作者衷心感谢帝国理工学院生物工程系的 Zack Bailey 在 JoVE 视频文章制作过程中对实验工作的协助以及对动物组织的使用支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 L 玻璃瓶VWR International Ltd215-1595硼硅酸盐玻璃
1 L 玻璃量瓶VWR International Ltd612-3626硼硅酸盐玻璃
2 L 玻璃瓶VWR International Ltd215-1596硼硅酸盐玻璃
2 L 玻璃量瓶VWR International LtdBRND937254硼硅酸盐玻璃
适配器，气动，8 mm 转 1/4 NPTRS 英国536-2599氧气管与气体分散管之间的推入式直通接头
烷氧基保形涂层法内尔1971829用于解剖培养皿制备的ACC15烷氧基保形涂层
麻醉剂香奈儿N/A异氟烷吸入麻醉剂，250 mL 瓶装
烧杯，2 LVWR International Ltd213-0469硼硅酸盐玻璃
双极神经套管Cortec GMBHN/A内径800微米，垂直引出，无连接器端接
BossheadsN/AN/A用于将夹持器连接至杆的标准湿实验室接头
二水合氯化钙Sigma AldrichC7902-500g500 g，塑料瓶装
碳合气体罐BOCN/AF型滤毒罐
离心管，15 mL 容量VWR International Ltd734-0451Falcon 管
导电弹性体神经袖带N/AN/A用于刺激的高电荷容量神经袖带，参见制造方案参考
连接器，终端器Mouser 英国538-505073-1100-LP这些应焊接到带有鳄鱼夹的导线上（参见第11项）
鳄鱼夹连接器RS 英国212-1203这些应焊接到带有 TermiMate 连接器的导线上（参见第 10 项）
去离子水N/AN/A从去离子水分配器中获取
45度角弯曲的镊子InterFocus Ltd91110-10精细镊子，学生用型号
Dumont #7 标准镊子InterFocus Ltd91197-00学生用持针钳
气体分散管，孔隙度3默克12547866N/A
无水葡萄糖，粉末状VWR International Ltd101174Y500 g，塑料瓶装
夹持器N/AN/A标准湿实验用杆式安装夹持器
加热搅拌器RS 英国768-9672Stuart US152
止血钳N/AN/A任意止血钳 >长度为12 cm较为合适
昆虫针，不锈钢，2号InterFocus Ltd26001-45N/A
笔记本电脑N/AN/A任何符合实验室安全标准且至少具有两个未使用 USB 端口的便携式计算机均适用
线路噪声滤波器DigitimerN/AHumbug 噪声消除器（50 Hz 工频噪声滤波器）
低噪声前置放大器，SR560斯坦福研究系统SR560低噪声电压前置放大器
硫酸镁盐VWR International Ltd291184P500克，塑料瓶装
MATLAB 脚本Githubhttps://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch自定义刺激器的初始化、校准和刺激脚本
MATLAB 软件MathworksN/A标准套餐
显微镜光源，PL-2000光子学N/A带有鹅颈管的光源。该产品可从第三方供应商处获得
显微镜，SMZ 745尼康SM745体视显微镜
矿物油，无毒VWR International Ltd31911.A1神经浴用油
神经浴N/AN/A定制加工的Plexiglas神经浴槽，详见实验方案。
示波器LeCroyN/A434 Wavesurfer。该产品可从第三方供应商处获取
氧气管，1 米BOCN/A1/4" NPT 终止
氧气调节器BOCC106X/2B：3.5巴-BS3-1/4"NPTF 230巴N/A
蠕动泵 P-1Pharmacia BiotechN/A产品可从第三方供应商处获得
玻璃培养皿VWR International Ltd391-0580 N/A
氯化钾盐Sigma AldrichP5405-250g250 克，塑料瓶装
磷酸二氢钾盐默克1.04873.0250250 克，塑料瓶装
大鼠查尔斯河实验室N/ASprague Dawley，雌性，250–330 克
参比电极，ET072eDaQ（澳大利亚）ET072-1银/氯化银参比电极
杆N/AN/A带支架配件的标准湿法实验室棒
量程赛多利斯N/AM-Power 天平，用于称量粉末。该产品可从第三方供应商处获取
直刃剪刀 12 厘米刃长InterFocus Ltd91400-12平端-平端连接，学生适用范围
信号采集设备剑桥电子设计Micro3-1401Micro3-1401 多通道ADC
硅脂，无毒法内尔3821559用于浴槽隔断的密封
硅胶管，内径 2 mmN/AN/AN/A
硅胶管，内径 5 mmN/AN/AN/A
银丝Alfa Aesar413900.5 mm，退火
碳酸氢钠盐Sigma AldrichS5761-500g500 g，塑料瓶装
氯化钠盐VWR International Ltd27810.2951 kg，塑料瓶装
弹簧剪，2毫米刃口，成角设计InterFocus Ltd15010-09N/A
站立N/AN/A带有用于固定杆的插孔的标准湿实验台
刺激器DigitimerDS3DS3 或定制刺激器（见参考文献）
搅拌跳蚤VWR International Ltd442-0270用于加热搅拌器
注射器针头，钝头，直径1 mmN/AN/AN/A
注射器针头，钝头，直径2 mmN/AN/AN/A
注射器，塑料，10 mL 容量N/AN/A注射器应配有鲁尔锁接头
防水胶带N/AN/A用于将管路和线路固定在工作台上
温度计VWR International Ltd620-0806玻璃温度计
USB 充电宝RS 英国135-1000定制刺激器电源，实验前需完全充电。若使用 DS3 则无需此电源。
三通鲁尔锁阀VWR International Ltd229-7440用于将注射器连接至浴液进样管并启动虹吸

参考文献

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