本方案描述了大鼠坐骨神经全组织的制备方法 离体 在环境可控的双室灌流生理盐水浴中进行电生理刺激与记录
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摘要
摘要
离体（ex vivo）制备方法能够在脱离机体整体环境的情况下研究多种神经生理过程，同时保持局部组织结构的完整性。本文描述了用于离体神经生理学研究的大鼠坐骨神经制备方法，包括缓冲液配制、动物操作、设备设置以及神经生理信号记录。本文还概述了利用该方法可开展的各类实验类型。所述方法旨在对离体的周围神经组织在严格控制的条件下进行长达6小时的刺激与记录，以获得高度一致的实验结果。采用该方法所获得的结果为A类纤维的复合动作电位（CAP），在整个实验过程中，其峰-峰振幅可达毫伏（mV）量级。CAP的振幅和波形具有良好的一致性和可重复性，因此适用于测试和比较新型电极与现有电极模型的性能，或评估各类干预手段对神经组织的影响，例如化学物质的应用、手术操作改变或神经调控刺激技术。实验中测试了两种电极：一种是带有铂-铱接触点的传统商用套管电极，另一种是自制的导电弹性体电极；两者在神经刺激的强度-时程响应方面表现出相似的结果。
引言
目前对基本神经功能的in silico建模理解在多个方面仍存在不足，尤其是关于神经组织在胞体、轴突和树突之外的区室化效应。轴突-髓鞘相互作用至今仍 poorly 被理解，这一点可由如下事实证明：即使是能够充分模拟哺乳动物神经常规电刺激反应的详细计算神经模型（如MRG1），也无法再现其他实验中观察到的现象，例如高频阻滞的持续效应2或继发性激活反应3。
本方案提供了一种在急性小型实验动物模型中高效研究神经水平神经生理学过程的方法，通过标准化的制备流程来分离神经、控制其环境并将其从周围组织中分离出来 体内 上下文到一个 离体 上下文。这将防止其他身体过程或使用的麻醉剂干扰 体内 神经刺激方案以改变神经活动并干扰测量结果或其解释4,5这有助于建立更加真实的模型，以专注于研究目前尚不明确的神经组织特异性效应。该方案还可作为新型神经刺激与记录电极材料、几何构型以及新型刺激范式（如高频阻断）的测试平台。2,3该技术的多种变体此前已被用于在高度受控....
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方案
所有动物护理和操作均在英国政府内政部根据《动物（科学程序）法案》（1986年）颁发的适当许可证下进行，并已获得伦敦帝国理工学院动物福利与伦理审查委员会的批准。
1. 缓冲液的配制
注意：除最后涉及制备1倍浓度改良克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（mKHB）的步骤外，本实验方案的这一部分可提前较长时间进行。
- 配制 1 M CaCl2 储存液
- 将 14.701 g 二水合氯化钙（CaCl2）加入洁净的 100 mL 烧杯中，加入约 75 mL 去离子水，搅拌至盐完全溶解。
- 将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，用去离子水定容至 100 mL。将溶液转移至试剂瓶中，并于 4 °C 冰箱中保存。
- 配制 10 倍浓缩的 mKHB 储存液
- 在 2 L 烧杯中加入 66.03 g 氯化钠（NaCl）、3.57 g 氯化钾（KCl）、1.63 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）和 1.44 g 硫酸镁。
- 向烧杯中加入约 750 mL 去离子水，搅拌至盐类溶解（底部可能残留少量盐晶体）。加入 25 mL 1 M CaCl2 储存液（步骤 1.1），....
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结果
采用本方案可获得的代表性结果为坐骨神经中A型神经纤维产生的一致的复合动作电位。这些动作电位在电极处的峰-峰幅值通常约为1 mV，经放大后可达100 mV（图2）。相似的刺激强度和脉冲宽度应产生相似的CAP幅值。与 commercially available 铂金袖状电极相比，导电弹性体袖状电极通常需要略高的刺激强度才能达到相同的CAP幅值。然而，这种差异通常小于因刺激来自不同动物的神经所需刺激强度的个体间变异。这是因为无论袖状电极材料如何，神经尺寸和袖状电极贴合度的微小差异都会对获得特定CAP幅值所需的刺激强度产生显著影响。该系统可用于测试不同缓冲液成分的影响，例如不同离子浓度，或添加河豚毒素等神经兴奋性或抑制性物质。若将缓冲液废液管路引至额外容器，则可实现神经兴奋性调节物质的暂时性添加，其洗脱速率取决于缓冲液流入速率。
将激活A型纤维并在示波器上获得可观察的复合动作电位所需的最小电流密度（计算方法为刺激幅度除以刺激电极的表面积）对脉冲宽度作图，结果如图3所示。.......
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讨论
在本研究中，我们描述了一种制备大鼠坐骨神经用于离体神经生理学实验的方案。ex vivo 组织提取过程大约需要30分钟，包括动物操作、麻醉、处死和解剖；而神经清理、置于浴槽中以及电极植入则还需额外约30分钟，之后方可开始记录。缓冲液的配制可在30分钟内完成，但也可在实验其他步骤之前提前准备。此类制备方法和实验此前已有应用和报道7,12，所用缓冲液相似，且针对相同类型的组织。据作者所知，本文首次在同一份文档中完整描述了缓冲液配制、解剖过程、设备组装及后续记录的全部步骤。
该方案可实现多种神经生理学实验，而这些实验在以往条件下均无法完成 体外 或 体内 情境中。例如，一个优势是 离体 制备方法的优势在于其能够在将组织从机体其余部分分离的同时，保持所提取组织的宏观和微观结构。这使得实验装置更为简便，因为无需维持麻醉状态，而麻醉在其他情况下通常是必需的 体内 实验。在支持实验开展方面， .......
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披露
作者无利益冲突。
开放获取声明：
为了开放获取的目的，作者已对由此产生的任何作者接受稿件版本应用了知识共享署名（CC BY）许可（在英国研究与创新署（UKRI）允许的情况下，可改用“开放政府许可”或“知识共享署名-禁止演绎（CC BY-ND）许可”）。
数据共享：
作者将提供本文图表所用的原始数据，且不会设置不当限制。
致谢
作者感谢美国宾夕法尼亚州普鲁士王市葛兰素史克制药公司及加尔瓦尼生物电子公司（英国史蒂夫尼奇）的 Gerald Hunsberger 博士向我们分享了其原始的神经制备技术。作者感谢 Robert Toth 提供双室神经浴设计。作者感谢工程与物理科学研究理事会（EPSRC）医疗技术挑战奖（HTCA）基金的资助。作者感谢帝国理工学院高性能嵌入式与分布式系统博士培训中心（HiPEDS CDT）对 Adrien Rapeaux 的资助（项目编号：EP/L016796/1）。Adrien Rapeaux 目前由英国痴呆症研究所护理与技术研究中心资助。 作者衷心感谢帝国理工学院生物工程系的 Zack Bailey 在 JoVE 视频文章制作过程中对实验工作的协助以及对动物组织的使用支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 L 玻璃瓶 | VWR International Ltd | 215-1595 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 1 L 玻璃量瓶 | VWR International Ltd | 612-3626 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 2 L 玻璃瓶 | VWR International Ltd | 215-1596 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 2 L 玻璃量瓶 | VWR International Ltd | BRND937254 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 适配器，气动，8 mm 转 1/4 NPT | RS 英国 | 536-2599 | 氧气管与气体分散管之间的推入式直通接头 |
| 烷氧基保形涂层 | 法内尔 | 1971829 | 用于解剖培养皿制备的ACC15烷氧基保形涂层 |
| 麻醉剂 | 香奈儿 | N/A | 异氟烷吸入麻醉剂，250 mL 瓶装 |
| 烧杯，2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 双极神经套管 | Cortec GMBH | N/A | 内径800微米，垂直引出，无连接器端接 |
| Bossheads | N/A | N/A | 用于将夹持器连接至杆的标准湿实验室接头 |
| 二水合氯化钙 | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g，塑料瓶装 |
| 碳合气体罐 | BOC | N/A | F型滤毒罐 |
| 离心管，15 mL 容量 | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon 管 |
| 导电弹性体神经袖带 | N/A | N/A | 用于刺激的高电荷容量神经袖带，参见制造方案参考 |
| 连接器，终端器 | Mouser 英国 | 538-505073-1100-LP | 这些应焊接到带有鳄鱼夹的导线上（参见第11项） |
| 鳄鱼夹连接器 | RS 英国 | 212-1203 | 这些应焊接到带有 TermiMate 连接器的导线上（参见第 10 项） |
| 去离子水 | N/A | N/A | 从去离子水分配器中获取 |
| 45度角弯曲的镊子 | InterFocus Ltd | 91110-10 | 精细镊子，学生用型号 |
| Dumont #7 标准镊子 | InterFocus Ltd | 91197-00 | 学生用持针钳 |
| 气体分散管，孔隙度3 | 默克 | 12547866 | N/A |
| 无水葡萄糖，粉末状 | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g，塑料瓶装 |
| 夹持器 | N/A | N/A | 标准湿实验用杆式安装夹持器 |
| 加热搅拌器 | RS 英国 | 768-9672 | Stuart US152 |
| 止血钳 | N/A | N/A | 任意止血钳 >长度为12 cm较为合适 |
| 昆虫针，不锈钢，2号 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| 笔记本电脑 | N/A | N/A | 任何符合实验室安全标准且至少具有两个未使用 USB 端口的便携式计算机均适用 |
| 线路噪声滤波器 | Digitimer | N/A | Humbug 噪声消除器（50 Hz 工频噪声滤波器） |
| 低噪声前置放大器，SR560 | 斯坦福研究系统 | SR560 | 低噪声电压前置放大器 |
| 硫酸镁盐 | VWR International Ltd | 291184P | 500克，塑料瓶装 |
| MATLAB 脚本 | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | 自定义刺激器的初始化、校准和刺激脚本 |
| MATLAB 软件 | Mathworks | N/A | 标准套餐 |
| 显微镜光源，PL-2000 | 光子学 | N/A | 带有鹅颈管的光源。该产品可从第三方供应商处获得 |
| 显微镜，SMZ 745 | 尼康 | SM745 | 体视显微镜 |
| 矿物油，无毒 | VWR International Ltd | 31911.A1 | 神经浴用油 |
| 神经浴 | N/A | N/A | 定制加工的Plexiglas神经浴槽，详见实验方案。 |
| 示波器 | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer。该产品可从第三方供应商处获取 |
| 氧气管，1 米 | BOC | N/A | 1/4" NPT 终止 |
| 氧气调节器 | BOC | C106X/2B：3.5巴-BS3-1/4"NPTF 230巴 | N/A |
| 蠕动泵 P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | 产品可从第三方供应商处获得 |
| 玻璃培养皿 | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| 氯化钾盐 | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 克，塑料瓶装 |
| 磷酸二氢钾盐 | 默克 | 1.04873.0250 | 250 克，塑料瓶装 |
| 大鼠 | 查尔斯河实验室 | N/A | Sprague Dawley，雌性，250–330 克 |
| 参比电极，ET072 | eDaQ（澳大利亚） | ET072-1 | 银/氯化银参比电极 |
| 杆 | N/A | N/A | 带支架配件的标准湿法实验室棒 |
| 量程 | 赛多利斯 | N/A | M-Power 天平，用于称量粉末。该产品可从第三方供应商处获取 |
| 直刃剪刀 12 厘米刃长 | InterFocus Ltd | 91400-12 | 平端-平端连接，学生适用范围 |
| 信号采集设备 | 剑桥电子设计 | Micro3-1401 | Micro3-1401 多通道ADC |
| 硅脂，无毒 | 法内尔 | 3821559 | 用于浴槽隔断的密封 |
| 硅胶管，内径 2 mm | N/A | N/A | N/A |
| 硅胶管，内径 5 mm | N/A | N/A | N/A |
| 银丝 | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm，退火 |
| 碳酸氢钠盐 | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g，塑料瓶装 |
| 氯化钠盐 | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg，塑料瓶装 |
| 弹簧剪，2毫米刃口，成角设计 | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| 站立 | N/A | N/A | 带有用于固定杆的插孔的标准湿实验台 |
| 刺激器 | Digitimer | DS3 | DS3 或定制刺激器（见参考文献） |
| 搅拌跳蚤 | VWR International Ltd | 442-0270 | 用于加热搅拌器 |
| 注射器针头，钝头，直径1 mm | N/A | N/A | N/A |
| 注射器针头，钝头，直径2 mm | N/A | N/A | N/A |
| 注射器，塑料，10 mL 容量 | N/A | N/A | 注射器应配有鲁尔锁接头 |
| 防水胶带 | N/A | N/A | 用于将管路和线路固定在工作台上 |
| 温度计 | VWR International Ltd | 620-0806 | 玻璃温度计 |
| USB 充电宝 | RS 英国 | 135-1000 | 定制刺激器电源，实验前需完全充电。若使用 DS3 则无需此电源。 |
| 三通鲁尔锁阀 | VWR International Ltd | 229-7440 | 用于将注射器连接至浴液进样管并启动虹吸 |
参考文献
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M.
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