利用循环死亡供体心脏的大鼠异位心脏移植模型

摘要

本文描述了利用循环死亡供体心脏进行小鼠异位心脏移植的制备过程及技术细节。

摘要

本实验方案的目的是建立一种采用循环死亡后捐献（DCD）供体心脏的大鼠异位心脏移植模型。该方案包括两个部分：供体心脏准备和受体准备。在供体心脏准备阶段，Sprague Dawley 大鼠接受麻醉、经气管插管并进行机械通气。通过右颈动脉插管给予肝素和肌松剂维库溴铵。通过停止通气启动 DCD 过程。停止通气 20 分钟后，暴露心脏，并在头臂干远端夹闭主动脉。在停止通气 25 分钟时，通过颈动脉导管灌注冰冻的威斯康星大学（UW）溶液以冲洗心脏。随后切断主动脉、肺动脉、上下腔静脉及肺静脉，获取供体心脏，并将其保存于 UW 溶液中以备移植。在受体准备阶段，Lewis 大鼠使用异氟烷进行麻醉，并皮下注射缓释布托啡诺以促进术后平稳恢复。通过腹部正中切口暴露肾下腹主动脉和下腔静脉，并使用无创血管夹夹闭。将供体心脏的主动脉和肺动脉分别以连续缝合法使用 8-0 Prolene 缝线吻合至受体的腹主动脉和下腔静脉。移除血管夹以恢复心脏灌注。缝合腹壁后，使大鼠苏醒。在设定的时间间隔（24 小时至 2 周）后，再次麻醉受体大鼠，暴露移植心脏，并经心尖插入带球囊导管至左心室，利用数据采集系统记录左心室发展压及 dP/dt。随后取心脏组织用于组织学、免疫学或分子生物学分析。成功建立 DCD 供体大鼠心脏移植模型将有助于进一步研究心肌保护策略，以改善 DCD 供体心脏移植的预后。

引言

心脏移植（HTx）的小动物模型对于开展研究移植心脏所受影响的病理生理状况至关重要。根据Oto和Lindsey描述的啮齿类动物异位HTx模型，研究人员得以研究在缺血与再灌注条件下观察到的病理生理变化¹。传统上，用于移植的供体心脏来源于跳动心脏供体，也称为脑死亡后捐献（DBD）供体；然而，需要进行HTx的患者数量却在不成比例地增加²。近年来，在实验环境中已开始使用循环死亡后捐献（即循环停止后捐献，DCD）供体的心脏进行移植³。DBD与DCD供体心脏之间的主要区别在于，后者的心脏经历了不同持续时间的缺血，因而限制了其在常规HTx临床实践中的应用。

既往文献报道的啮齿类异位心脏移植（HTx）仅采用了跳动心脏供体条件^4,5,6。异位无心跳供体（DCD）心脏移植则需要进行细微的技术调整，否则移植后心脏将无法恢复搏动⁷。本方案旨在向读者介绍一种经过优化的大鼠DCD心脏移植技术。全心肌缺血是DCD器官捐献固有的特征。目前仅在ex vivo（离体）模型中研究过模拟全心肌缺血的实验设置

方案

所有动物实验均按照机构指南以及美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 86-23，2011 年修订版）进行⁸。以下操作程序已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会的批准。所有操作均遵循职业安全与健康管理局（OSHA）指南以及推荐的无菌技术⁹。Sprague Dawley 大鼠饲养于湿度受控的环境中，温度为 23 °C，光照周期为 12 小时明/暗循环。

1. 实验室的设置

注意：应指定专用区域，在体视显微镜下进行无菌啮齿类动物存活手术。手术室环境温度应保持温暖；在手术及术后恢复过程中使用加热垫，对维持受体大鼠体温至关重要。

1. 准备并妥善存放必需用品（材料表），包括注射器、0.9% 生理盐水（NaCl）、麻醉剂（异氟烷、氯胺酮/赛拉嗪）、肝素、维库溴铵、器官保存液、冰桶以及镇痛剂（缓释型丁丙诺啡），确保随时可用。
2. 将显微外科器械整齐摆放于手术区域（图1A，B）。随时备好快速灭菌包，以便立即清洁被污染的关键器械。

结果

异位心脏移植术后24小时至14天，可重新打开腹腔，暴露心脏以测量左心室产生的压力。将带有球囊尖端的导管插入DCD（或CBD）心脏的左心室内，以测量其发展压（DP）、最大+dp/dt和最小−dp/dt。图7展示了移植后24小时DCD心脏与CBD心脏预期DP、+dp/dt和−dp/dt的示例。与CBD心脏相比，DCD心脏的发展压显著降低，且+dp/dt（最大值）和−dp/dt（最小值）均恶化。

图1：异位大鼠心脏移植中使用的显微血管器械。 （1）.......

讨论

要成功实施大鼠DCD异位心脏移植（HTx），必须建立细致周密的实验准备。详细的准备工作需考虑多个因素，包括：1）选择年轻大鼠作为DCD供体；2）使用异氟烷作为首选麻醉剂；3）向供体心脏有效灌注停跳液；4）将供体心脏保存在冰冻溶液中；5）在不损伤腰血管的前提下，仅进行有限的腹部解剖，以暴露肾下腹主动脉和下腔静脉；6）在手术期间及术后维持受体体温；7）使用无血管夹钳以分离下腔静脉和主动脉，便于吻合；8）确保受体腹腔内有足够的空间容纳较硬的DCD供体心脏；9）选用合适的显微血管器械；10）避免对受体进行抗凝处理；11）精细地完成止血性血管吻合；以及12）术前给予镇痛，以确保术后平稳恢复。本文所述方案详细说明了每一步操作，以成功重复实验结果。

本文所述的DCD大鼠异位心脏移植（HTx）方法借鉴了自1964年Abbott首次描述小鼠心脏移植以来文献中报道的多种改进措施¹⁰。上述方案中的关键改进包括麻醉剂的选择：使用异氟烷作为麻醉剂便于监测和调节至所需的麻醉深度。将供体心脏主动脉和肺动脉与受体腹主动脉和下腔静脉进行侧-侧吻合，取代Abbott最初.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 尼龙缝线 聚酰胺单丝	Aros Surgical	SP17A05N-45
5-0 丝线缝线	Surgical Specialties	SP116
8-0 单丝缝线	Aros Surgical	T06A08N14-13
高压灭菌器	Steris	Amsco Lab 250
BD 胰岛素注射器 带可拆卸针头 1 mL 注射器	Fisher Scientific	14-820-28
BD 带鲁尔锁扣头端的注射器（无针头）10 mL 注射器	Fisher Scientific	14-823-16E
Belzer 大学威斯康星冷保存液	Bridge to Life Northbrook IL USA		腺苷 1.34 g/L，别嘌呤醇 0.136 g/L，谷胱甘肽 0.922 g/L，乳糖酸（以内酯形式）35.83 g/L，七水硫酸镁 1.23 g/L，五组分 50 g/L，氢氧化钾 5.61 g/L，磷酸二氢钾 3.4 g/L，棉子糖五水合物 17.83 g/L
Buprenorfin SR 实验室制剂	Zoopharm LLC
Debakey 无创儿科多角度血管夹	Aesculap	F341T
Exel 国际一次性 Safelet 静脉导管 14 G	Fisher Scientific	14-841-10
Exel 国际一次性 Safelet 静脉导管 22 G	Fisher Scientific	14-841-20
Fogarty 导管 4F 规格	Edwards Lifesciences	120404F
带弯曲尖端的镊子	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.228
Gaymar 加热泵	Braintree Scientific, Braintree, MA, USA	TP700
Germinator-500	Braintree Scientific
肝素钠注射液，USP 1,000 U/mL	Pfizer	NDC 0069-0137-01
直头虹膜显微剪	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.5253
异氟烷 USP	Patterson Veterinary	NDC 14043070406
盐酸氯胺酮 100 mg/mL	Henry Schein	NDC 6745710810
盐酸利多卡因 2%	Aspen Veterinary	07-892-4325
McKesson General Medical 6 英寸 Q-TIPS 2STER 木柄 100 支/包	Fisher Scientific	NC0650323	无菌棉签
显微剪，直角和弯曲尖端	Braintree Scientific	SC-MS 154
持针器	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.BSL158	已移除锁定机制
生理盐水	Baxter Infusion supplies
PowerLab 工作站	AD Instruments, Denver, CO		数据采集系统
氢氧化钠/盐酸			将溶液调节至 pH 7.4
Sprague Dawley 大鼠			雄性，8–16 周龄，<400 g 体重
手术显微镜	Leika	型号 M525 F40
Surgicel	Ethicon		可吸收止血剂
温度探头 Therma 防水型 T 型高精度热电偶测温仪	Thermoworks	THS-232-107
高精度尖头镊子	Excelta	17-456-109
维库溴铵	Sigma-Aldrich	PHR1627	用 PBS 稀释至 100 mg/mL
Ventelite	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
赛拉嗪 100 mg/mL	Pivetal Anased	NDC 04606675002