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方法文章

利用交流介电泳分离非转移性（MCF-7）与非肿瘤性（MCF-10A）乳腺癌细胞的微流控芯片装置

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DOI：

10.3791/63850

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2022年8月11日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Foundation University Islamabad, 2College of Medical Technology, The Islamic University Najaf, 3Faculty of Mechanical Engineering, University of Tabriz, 4Department of Engineering Mathematics, University of Bristol, 5School of Life Sciences, University of Warwick

本文内容

摘要

乳腺癌细胞与非肿瘤性乳腺上皮细胞具有不同的介电特性。人们推测，基于这种介电特性的差异，可将这两类细胞分离开来，用于免疫治疗。为验证这一设想，我们对一种用于分选 MCF-7 和 MCF-10A 细胞的微流控装置进行了建模。

摘要

介电泳装置能够基于样本中癌细胞在外加电场作用下的极化原理，以无标记、低成本、稳定且准确的方式实现对癌细胞的检测与操控。本文展示了如何利用微流控平台，通过流体动力介电泳（HDEP）从细胞混合物中实现非转移性乳腺癌细胞（MCF-7）与非肿瘤乳腺上皮细胞（MCF-10A）的高通量连续分选。在HDEP微流控芯片中，通过在两个并排布置、间距为微米级的电极之间建立电场，非肿瘤乳腺上皮细胞（MCF-10A）会因表现出负介电泳效应而在主通道内被推离，而非转移性乳腺癌细胞由于其电导率高于膜电导率，在细胞培养基中悬浮时则不受影响，沿原路径流动。为验证该原理，研究人员针对不同培养基电导率进行了仿真，并研究了细胞分选行为。通过参数化研究，确定合适的细胞混合物电导率为0.4 S/m。在保持培养基电导率恒定的条件下，通过调节电场频率，确定了0.8 MHz的适当交流频率可实现最高的分选效率。采用本文所述方法，在选定合适的细胞混合物悬浮介质电导率和施加的交流电频率后，即可实现最高的分选效率。

引言

在乳腺组织内部及周围形成的恶性肿瘤是全球女性乳腺癌的常见病因，造成严重的健康问题1。在转移发生之前，乳腺肿瘤若能在早期被发现，可通过手术治疗；但如果被忽视，则可能扩散至肺部、脑部和骨骼，对患者生命造成严重威胁。晚期阶段的治疗手段，如放疗和化学疗法，往往伴随严重的副作用2。近期研究表明，乳腺癌的早期诊断可使死亡率降低60%3。因此，开发个性化的早期检测方法至关重要。为此，来自不同科学与技术领域的研究人员已利用微流控技术开发用于乳腺癌早期诊断的装置4。这些方法包括细胞亲和微色谱、磁激活微细胞分选器、基于尺寸的癌细胞捕获与分离，以及芯片上的介电泳（DEP）技术5,6。文献报道的这些微流控技术能够实现对细胞的精确操控、实时监测以及对明确定义样本的分选，因而在许多诊断和治疗应用中发挥着中间关键步骤的作用5。将这些分选机制与微流控系统整合，可实现对目标细胞灵活且可靠的操控7,8,9,10。此类整合的主要优势之一在于能够处理纳升至微升级别的流体样本，并可调控样本流体的电学特性。通过调节微流控装置内悬浮液的电导率，可依据细胞的大小及其介电性质的差异实现细胞分选11,12。

在这些技术中，芯片式介电泳动（DEP）通常更受青睐，因为它是一种无需标记的细胞分选技术，可利用生物样本的电学特性进行操作。已有文献报道，DEP可用于操控DNA13、RNA14、蛋白质15、细菌16、血细胞17、循环肿瘤细胞（CTCs）18以及干细胞19等生物样本。利用DEP对生物样本进行分选的微流控装置在文献中已有广泛报道20。已有研究报道了基于储液池的DEP微流控（rDEP）装置，用于分选活酵母细胞与非活酵母细胞，并可保护细胞免受电化学反应的不利影响21,22。Piacentini等人报道了一种带锯齿结构的微流控细胞分选器，可将红细胞与血小板分离，分选效率达97%23。已有研究报道采用非对称孔道和嵌入式电极的芯片式DEP装置，用于分选活细胞与非活细胞24。Valero和Demierre等人通过在通道两侧引入两组微电极阵列，对锯齿结构微流控细胞分选器进行了改进25,26，从而有助于将细胞聚焦于通道中心。Zeynep等人提出了一种基于DEP的微流控装置，用于从白细胞中分离并富集MCF7乳腺癌细胞27。他们报道在1 MHz频率和10–12 Vpp的施加电压下，从白细胞中提取MCF7细胞的效率介于74%–98%之间。补充表1对基于DEP的微流控分选装置在设计、电极构型及操作参数（施加频率和电压）方面进行了定性与定量比较。

最近，研究人员尝试在微流控芯片内测量乳腺上皮细胞（MCF-10A）与非转移性乳腺癌细胞（MCF-7）介电行为的差异28,29。Jithin 等人还利用开放式同轴探针技术，在200 MHz至13.6 GHz频率范围内表征了不同癌细胞系的介电响应30。MCF-7与MCF-10A细胞系在介电响应上的差异可用于在运行过程中实现细胞分离，并有望推动个性化早期诊断设备的开发。

本文利用交流介电泳技术，模拟实现了对非转移性乳腺癌细胞（MCF-7）和非肿瘤乳腺上皮细胞（MCF-10A）的可控分选。电场变化区域影响微流控芯片内部的分选过程。所提出的技术易于实现，并可将分选方法集成到多种微流控芯片结构中。通过计算流体动力学（CFD）模拟，研究了在细胞悬浮液介质电导率变化条件下对非转移性乳腺癌细胞与非肿瘤乳腺上皮细胞的分离效果。模拟结果表明，在保持电导率恒定的情况下，通过调节施加电场的频率，可实现对癌细胞与健康细胞分离过程的控制。

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方案

注意：本方案使用多物理场仿真软件 COMSOL，通过交流介电泳技术模拟对非转移性乳腺癌细胞（MCF-7）和非肿瘤性乳腺上皮细胞（MCF-10A）的可控分选。

1. 芯片设计与参数选择

  1. 打开多物理场仿真软件并选择 空白模型. 右键单击 全球定义 并选择 参数. 导入所提供的参数 表1 作为文本文件导入全局定义，或逐项输入数值。
  2. 选择 添加组分 从主页选项卡中添加一个 二维组分右键单击几何体，然后通过双击文件导入模型文件。
  3. 选择一种空白材料，并使用该材料的属性 表1.
  4. 选择 添加物理学 从“主页”选项卡中输入 AC/DC。在 AC/DC 节点下，选择“电流” 物理学 在电场与电流的子节点下。
  5. 右键单击 电流 并选择 当前保护状况, 绝缘，以及 电势 用于绝缘通道壁并为电极分配电势的子节点。
  6. 选择 添加物理学 从“主页”选项卡中，然后在 流体流动 节点，选择 蠕动流体物理 在子节点下 单相流. 右键单击 单相流 并利用将芯片边界渲染为墙壁 壁 子节点
  7. 右键单击 单相流 并添加两个入口子节点和一个出口子节点。
  8. 使用入口子节点分配入口，并使用法向入口 流速 作为 边界条件使用出口子节点来指定出口。
  9. 选择 添加物理学 从“主页”选项卡中，然后在 流体流动 节点，选择 粒子示踪流体力学 在子节点下 示踪粒子追踪.
  10. 右键单击 粒子示踪 节点并添加以下子节点：壁面、双粒子属性子节点、两个入口子节点、一个出口子节点、两个介电泳力子节点和一个拖曳力子节点。
    1. 设置 颗粒特性 对于MCF-7和MCF-10A细胞，使用 颗粒性质 子节点。从参数中选择粒子属性 全球定义 部分
    2. 加入 拖曳力 用于将介电泳力分配给两种类型的细胞的子节点。
    3. 添加 颗粒性质 在此情况下，从参数部分添加壳层子节点以模拟哺乳动物细胞。
  11. 从主页选项卡中选择 添加网格 并选择 细网筛选择 构建网格 从主页选项卡构建网格。
  12. 从主页选项卡中，点击 添加研究 添加三个研究步骤。 研究步骤1 用于模拟频率响应；使用一个 频域 子节点
    1. 为模拟蠕动流，选择一个 稳态研究 节点。添加两个与时间相关的步骤，以模拟存在介电泳力和不存在介电泳力的条件。
    2. 对于无介电泳条件，选择 物理学与变量选择，勾选标题为 修改模型配置 用于研究步骤，并禁用 介电电泳步骤对于介电泳条件，请勿禁用。保存文件并按下 计算 运行模拟所需。
      注意：用于分离非转移性乳腺癌细胞（MCF-7）和非肿瘤乳腺上皮细胞（MCF-10A）的微流控芯片设计有两个独立的进样口，分别用于细胞混合物流和流体动力聚焦流，其宽度分别为 20 µm 和 40 µm，如图所示 补充图1 和 补充图2.
    3. 分配频率（f0）在 频域 子节点和电压使用 电势 平面电极的子节点（295 µm 宽度）沿分选室顶侧壁放置。在出口处，使用“冻结”壁面条件以可视化已分选的颗粒。

2. 数学模型与计算分析

  1. 通过建立计算流体动力学（CFD）研究，验证在微流控装置内分离非转移性乳腺癌细胞与非肿瘤乳腺上皮细胞的操作参数。
    注意：多物理场仿真软件（交流/直流，微流控，以及 颗粒追踪 模块）被用于此目的。控制方程及理论背景在文中已详细给出。 补充文件 1通过使用文献中报道的非转移性乳腺癌细胞（MCF7）和非肿瘤性乳腺上皮细胞（MCF-10A）的介电特性对模型进行了验证31,32，总结如下 表1.
  2. 通过细胞混合入口以1:1的比例引入非转移性乳腺癌（MCF7）和非肿瘤乳腺上皮（MCF-10A）细胞系，进行CFD模拟。
    1. 首先，进行网格独立性研究，以优化模拟的网格尺寸33.
      注意：为确定操作参数的最佳解决方案，进行了网格独立性研究。选取了五组不同网格尺寸，以量化实现解收敛所需的最优单元尺寸。观察发现，当定义网格的单元总数为635（较粗网格）时，如图所示 补充图 3A，分选效率最低，部分MCF7细胞流向底部出口，如图所示 补充图 3B当网格尺寸增加至精细时，定义该网格的单元数量也增加至2,288。在此情况下，分选效率达到最高，MCF7和MCF-10A细胞均向各自对应的出口移动。进一步模拟了更精细的网格，此时定义网格的单元数量增加至3,188。然而，分选效率在此之后未再发生变化。因此，我们可以有把握地认为，在本研究中，精细网格尺寸的效果最佳。
    2. 求解两组计算流体动力学（CFD）研究。
    3. 对于第一组，右键单击 研究 1 并加入 参数扫描 子节点。按下 + 添加流体介质电导率“σ”的符号m以流体介质电导率 σ 作为扫描变量，进行参数扫描研究m 电导率范围为 0.01 S/m 至 2.5 S/m，保持施加频率 f (Hz) 恒定在 800 kHz。
    4. 对于第二组，进行 参数扫描 通过在保持流体介质电导率 σ 不变的情况下，将施加的交流频率从 100 kHz 调整至 100 MHz，进行研究m，每种情况下均固定为 0.4 S/m。该 σm 该值是根据首次CFD研究的结果选定的，因为在该值下观察到MCF-7与MCF-10A之间的分离程度最大。
    5. 介电泳力（DEP）的强度，FDEP (-)，作用于导电介质中电介质球形颗粒的力由公式1T给出34:
      FDEP 静电平衡方程图，ΣF=0，包含介电常数和电场变量。  [1]
      在介电泳力子节点下使用公式1。在公式1中， r 显示粒子半径，其中 FDEP 被施加；K (-) 称为 Clausius-Mossotti 因子； εm (－) 表示介质的介电常数；E（V/m）为电场的均方根值。
    6. 在介电泳力子节点下，对球形粒子使用公式2。
      断裂力学的数学公式；K 应力强度因子；方程分析     [2]
      在公式 2 中， 静力平衡方程 ΣFx=0，示意图，用于物理概念教学。 (-) 表示施加介电泳力的粒子的复介电常数； 静力学平衡方程 ΣFx=0 示意图；用于阐释物理学研究中的力平衡原理。 (-) 表示包围颗粒的流体的复介电常数。复介电常数 静力平衡方程 ΣFx=0，示意图，用于物理概念教学 和 静力平衡方程 ΣFx=0 示意图；用于阐释物理学研究中的力平衡原理。 定义如下35:
    7. 在介电泳力子节点下，对球形颗粒使用公式3：
      复数介电常数方程，符号强调电模量，物理公式分析。     [3]
      在公式 3 中，εp (-) 表示粒子复介电常数的实部；εm (-) 表示粒子周围流体的复介电常数的实部；σp (S/m) 表示粒子电导率；σm (S/m) 表示粒子周围介质的电导率；ω (Hz) 为施加电场的频率。
      注意：Re(K) 的符号决定了 F 的极性DEP若 Re(K) 的符号为负，则粒子受到负向介电泳力（nDEP）；反之，若 Re(K) 的符号为正，则表示粒子受到正向介电泳力（pDEP）。对于 Clausius-Mossotti 因子（K），其取值范围在 -1 到 1 之间。
  3. 使用修正后的公式3来模拟哺乳动物细胞等结构更复杂且具有多层结构的生物细胞。
    K (数学符号 ξₚ, ξₘ；在高级研究的方程或科学方法中具有相关性。) = 静力平衡公式，Σε'eq−ε'm/Σε'eq−2ε'm，用于力学分析     [4]
    在公式 4 中， 显示研究背景下静态平衡概念的平衡方程图 ξ_eq。 (-) 同时包含细胞质的复介电常数， 静态平衡；公式：ξ'cyto. (-)，以及细胞膜的复介电常数 静力平衡方程：ε'mem 符号。 （-），具体如下所示：36
  4. 使用公式 5 求解“静态平衡方程 ξ_eq，用于力学平衡分析的符号。":
    静力平衡公式；物理学与工程学计算中使用的方程。     [5]
    在公式5中， R细胞 （米）和 R膜 (m) 分别表示细胞质和细胞膜的半径。
  5. 然后，使用公式4绘制癌细胞和健康细胞的克劳修斯-莫索提因子实部 Re(K) 随外加电场的变化关系。计算克劳修斯-莫索提因子的实部 Re(K)，以量化粒子所受的介电泳力（DEP）。
  6. 右键单击 结果 节点，添加 颗粒评估 子节点，在表达式部分输入 fpt.deff1.K 绘制粒子1的CM因子 fpt.deff2.K 用于颗粒2。
    注意：正文中列出的所有实验步骤均可在实验视频中查看（视频 1).

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结果

研究基于介电泳有效分离非转移性乳腺癌（MCF-7）细胞与非肿瘤乳腺上皮（MCF-10A）细胞的最佳操作参数
为了在介电泳过程中成功分离具有不同介电特性的非转移性乳腺癌（MCF-7）细胞和非肿瘤乳腺上皮（MCF-10A）细胞，应保持施加频率恒定，使两者的K因子存在差异37,38。通过使用公式4，量化了非转移性乳腺癌细胞和非肿瘤乳腺上皮细胞在施加电场下的介电响应，并计算了两种细胞系的“K”因子随施加频率变化的关系。如图1所示的结果是在固定非转移性乳腺癌细胞和非肿瘤乳腺上皮细胞所有介电参数的前提下，通过改变细胞悬浮液介质电导率σm的三个不同取值，并调节外加电场频率而获得的。

如图1所示，在每种情况下，K值均在-1至1的范围内，与先前的研究结果一致39

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讨论

已有文献报道微流控装置可用于细胞培养、捕获和分选47,52,53。在洁净室中制备此类装置成本较高，因此必须通过计算流体动力学（CFD）模拟来量化所提出微流控装置的输出性能与效率。本研究提出了一种基于交流介电电泳的微流控装置的设计，并对其进行了模拟，旨在根据非转移性乳腺癌细胞（MCF-7）与非肿瘤乳腺上皮细胞（MCF-10A）介电特性的差异，实现两者的连续分离23。

通过施加交流电场来操作该设备 通过 一组嵌入单个微流控分选通道内的双微电极，用于根据MCF-7和MCF-10A细胞的介电特性对其进行分离。该装置的分离效率通过计算模拟，针对不同培养基电导率值及一系列施加的交流频率进行了评估。结果表明，最佳施加交流频率和培养基电导率值分别为0.8 MHz 和 0.4 S/m。施加 1.5 V 的低电压p-p ...

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披露

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

本研究由巴基斯坦高等教育委员会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
COMSOLCOMSOL多物理场仿真软件

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MCF 7 MCF 10A
利用交流介电泳分离非转移性（MCF-7）与非肿瘤性（MCF-10A）乳腺癌细胞的微流控芯片装置
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