本文的目的是描述KitV558Δ/+ 小鼠模型，以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。
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本文内容
摘要
摘要
胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人类肉瘤，通常由KIT受体中的单一突变驱动。在多种肿瘤类型中，研究人员已开发出大量小鼠模型，用于探索下一代癌症治疗方法。然而，在GIST研究中，大多数体内研究仍采用异种移植小鼠模型，而这类模型具有固有的局限性。本文介绍一种具有完整免疫系统的、经基因工程改造的胃肠道间质瘤小鼠模型，该模型携带KitV558Δ/+突变。在此模型中，导致大多数GIST发生的癌基因突变型KIT由其内源性启动子驱动，从而产生的GIST在组织学形态和免疫细胞浸润特征上均模拟了人类GIST的表现。此外，该模型已成功用于靶向分子治疗和免疫治疗的研究。本文详细描述了KitV558Δ/+小鼠品系的繁育与维持方法，并详述了从KitV558Δ/+小鼠中处理和获取胃肠道间质瘤、引流肠系膜淋巴结及邻近盲肠组织的流程，以及用于分子和免疫学分析的样本制备方法。
引言
胃肠道间质瘤（GIST）是人类最常见的肉瘤，在美国每年约有6000例发病1。GIST似乎起源于被称为 Cajal 间质细胞的胃肠道起搏细胞，通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA中的单一突变驱动2。手术是GIST治疗的主要手段，可能实现治愈；但对于晚期疾病患者，可采用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）伊马替尼进行治疗。自20多年前问世以来，伊马替尼彻底改变了GIST的治疗模式，使晚期疾病的患者生存期从1年提高至5年以上3,4,5。然而，由于KIT基因获得性突变的存在，伊马替尼极少能够实现治愈，因此该肿瘤亟需新的治疗方法。
小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。目前已有多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型被建立并用于胃肠道间质瘤（GIST）的研究6,7。然而，免疫缺陷小鼠并不能完全模拟人类GIST，因为GIST的免疫特征会因其致癌突变类型的不同而有所差异，且调控胃肠道肿瘤微环境可增强酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的效果
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方案
所有小鼠均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，并在宾夕法尼亚大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准的情况下，于宾夕法尼亚大学的无病原体环境中饲养。安乐死操作遵循宾夕法尼亚大学实验动物资源部的标准操作程序进行。
1. KitV558Δ/+ 小鼠繁育
- 回交 试剂盒V558Δ/+ 将小鼠在 C57BL/6J 背景上回交超过 10 代，使用 C57BL/6J 小鼠。为此，将雄性 试剂盒V558Δ/+ 小鼠 以1:2的比例与雌性C57BL/6J小鼠配比。
注意：纯合的 试剂盒V558Δ/V558Δ 基因型在子宫内致死。可以繁殖雌性 试剂盒V558Δ/+ 与雄性C57BL/6J小鼠交配时，其产仔数约为野生型雌性C57BL/6J小鼠的一半。此外，雌性 试剂盒V558Δ/+ 小鼠 4月龄后产仔数有限。 - 通过断趾法在7-14日龄对仔鼠进行基因型鉴定，以确认目标基因的存在 试剂盒V558Δ/+ 基因型鉴定。使用以下引物和报告探....
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结果
KitV558Δ/+ 小鼠模型可用于在免疫功能健全的小鼠模型中研究治疗手段。KitV558Δ/+ 小鼠由于进行性肠梗阻，平均寿命为8个月(图4)。KitV558Δ/+ 小鼠的肿瘤表达胃肠道间质瘤（GIST）的经典标志物，包括酪氨酸激酶KIT和跨膜通道蛋白DOG1(图5)，以及转录因子ETV1（未显示）。可检测这些肿瘤中KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT(图6)，或其免疫微环境，后者与人类GIST高度相似8,11.......
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讨论
KitV558Δ/+ 小鼠模型是胃肠道间质瘤（GIST）分子与免疫学分析中的有力研究工具。尽管繁育策略仅需单次杂交，但在分析肿瘤反应的实验中使用KitV558Δ/+小鼠队列仍需大规模繁育。为确保肿瘤重量相近，小鼠需匹配年龄和性别，且在肿瘤形成的8周龄前约有10%的小鼠死亡。若采用CT或MRI等先进成像技术对单个小鼠的肿瘤体积进行追踪，则可采用较简化的繁育策略。尽管如此，KitV558Δ/+小鼠已成功与其他基因敲除或可诱导小鼠模型杂交，揭示了重要的免疫与分子机制12。
肿瘤细胞来自 试剂盒V558Δ/+ 小鼠可通过KIT（CD117）柱层析分选或流式细胞术轻松分离18分离的肿瘤细胞来自 试剂盒V558Δ/+ 小鼠可以培育 体外12.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
KitV558Δ/+ 小鼠经基因工程改造，由 Peter Besmer 博士提供10。本研究得到美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01 CA102613 和 T32 CA251063。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 微米滤膜 | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1× 红细胞裂解缓冲液 | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3 mL 注射器 | 赛默飞世尔科技/BD生物科学 | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白胶，10 孔，30 µl | 伯乐（Bio-Rad） | 4561083 | |
| 4% 甲醛溶液 | 赛默飞世尔科技 | AAJ19943K2 | |
| 40 微米滤器 | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 微米滤膜 | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT抗体（C67E7） | 细胞信号传导 | 4691 | |
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | ||
| 胶原酶IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| 完全型无EDTA蛋白酶抑制剂 | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II 自动细胞计数仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 一次性手术刀 | 赛默飞世尔科技/Exel国际 | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1抗体 | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK 抗体（p44/42） | 细胞信号传导 | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI 软件 | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 匀浆器 | 赛默飞世尔科技 | 15-340-169 | |
| HBSS | 宾夕法尼亚大学细胞中心 | ||
| 甲磺酸伊马替尼 | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT 抗体（D13A2） | 细胞信号传导 | 3074 | |
| KitV558Δ/+ 基因分型 | Transnetyx | ||
| 微型离心管（1.5 mL） | 赛默飞世尔科技 | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse免疫检测基础试剂盒 | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| 硝酸纤维素膜，预裁，0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| 脱脂奶粉 | 赛默飞世尔科技 | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 替代品 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT 抗体（S473） | 细胞信号传导 | 4060 | |
| p-ERK 抗体（p44/42） | 细胞信号传导 | 9101 | |
| p-KIT 抗体（Y719） | 细胞信号传导 | 3391 | |
| PMSF蛋白酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 36978 | |
| 蛋白酶K | 赛默飞世尔科技 | BP170050 | |
| 圆底聚苯乙烯流式管（FACS管） | Falcon/赛默飞世尔科技 | 14-959-2A | |
| RPMI | 宾夕法尼亚大学细胞中心 | ||
| 氟化钠（NaF） | Sigma Aldrich | 201154 | |
| 原钒酸钠（Na3VO4） | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura 延长作用时间底物 | 赛默飞世尔科技 | 34076 | |
| TBS缓冲液（10倍浓缩） | 宾夕法尼亚大学细胞中心 | ||
| 组织培养皿（100 mm²） | 赛默飞世尔科技/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCl | 赛默飞世尔科技 | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 平台 | Scanco Medical |
参考文献
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P.
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