分子和免疫技术在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中

Summary

本手稿的目的是描述 试剂盒^V558Δ/+小鼠模型以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。

Abstract

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人肉瘤，通常由KIT受体中的单个突变驱动。在各种肿瘤类型中，已经开发了许多小鼠模型，以研究下一代癌症疗法。然而，在GIST中，大多数 体内 研究使用具有固有局限性的异种移植小鼠模型。在这里，我们描述了一种免疫功能正常的，基因工程化的胃肠道间质瘤小鼠模型，该模型含有 Kit^{V558Δ / +} 突变。在这个模型中，突变的KIT是负责大多数GIST的癌基因，由其内源性启动子驱动，导致GIST模仿人类GIST中的组织学外观和免疫浸润。此外，该模型已成功用于研究靶向分子和免疫疗法。在这里，我们描述了 Kit^V558Δ/+ 小鼠群落的繁殖和维护。此外，本文详细介绍了 Kit^V558Δ/+ 小鼠中GIST，引流肠系膜淋巴结和邻近盲肠的治疗和获取，以及用于分子和免疫学分析的样品制备。

Introduction

GIST是人类最常见的肉瘤，在美国发病率约为6，000例¹。GIST似乎起源于称为Cajal间质细胞的胃肠道起搏器细胞，通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA²中的单个突变驱动。手术是 GIST 的主要治疗方法，可以治愈，但晚期疾病患者可以使用酪氨酸激酶抑制剂 （TKI） 伊马替尼进行治疗。自20多年前推出以来，伊马替尼已经改变了GIST的治疗模式，将晚期疾病的生存率从1年提高到5年以上^3，4，5。不幸的是，由于获得性KIT突变，伊马替尼很少能治愈，因此需要新的治疗方法来治疗这种肿瘤。

小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。GIST^6，7中已经开发并研究了多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型。然而，免疫缺陷小鼠不能完全代表人类GIST，因为GISTs根据其致癌突变具有不同的免疫谱，并且改变胃肠道肿瘤微环境可改善TKI治疗的效果^8，9。Kit^V558Δ/+小鼠在 Kit 外显子 11 中具有杂合子种系缺失，该基因系对并列膜结构域进行编码，这是人类 GIST¹⁰ 中最常见的突变位点。Kit^V558Δ/+小鼠发展出具有100%外显率的单个盲肠GIST，并且肿瘤具有与人类GIST⁸，^11，12，13相似的组织学，分子信号传导，免疫浸润和对治疗的反应。在这里，我们描述了Kit^{V558Δ / +}小鼠中的育种，处理以及标本分离和处理，用于GIST中的分子和免疫学研究。

Protocol

根据NIH指南和宾夕法尼亚大学IACUC的批准，所有小鼠都住在宾夕法尼亚大学的无病原体条件下。安乐死是按照宾夕法尼亚大学实验动物资源标准操作程序进行的。

1. 试剂盒^V558Δ/+ 小鼠育种

1. 使用 ^{C57BL/6J 鼠标将套件 V558Δ/+} 鼠标反向交叉 10 次以上，放到 C57BL/6J 背景上。为此，将雄性 试剂盒^{V558Δ / +} 小鼠与雌性C57BL / 6J小鼠以1:2的比例繁殖。
   注意:纯合 试剂盒^{V558Δ/ V558Δ} 基因型在子宫内是致命的。可以将雌性 Kit^{V558Δ / +} 小鼠与雄性C57BL / 6J小鼠繁殖，但窝大小约为雌性野生型C57BL / 6J小鼠的一半。此外，雌性 Kit^V558Δ/+ 小鼠在4个月大后产生有限的窝。
2. 通过脚趾剪裁对7-14天的幼崽进行基因分型，以确认 是否存在Kit^V558Δ/+ 基因型。使用前瞻引物:《中共中央》;记者1:中科院;反向引物:TTGCGTC和记者2:用于基因分型的TCTC。

2. 套件^V558Δ/+ 小鼠治疗

1. 治疗前，年龄和性别与 试剂盒^V558Δ/+小鼠相匹配。在队列中使用年龄和性别匹配的小鼠，因为来自雌性 Kit^{V558Δ / +} 小鼠的肿瘤比雄性小鼠大。在8-12周龄时治疗小鼠，此时肿瘤建立（图1）。
2. 给予酪氨酸激酶抑制剂口服或腹膜内（IP）注射; 试剂盒^V558Δ/+ 肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感。在饮用水中以600mg / L的剂量提供伊马替尼，或注射45mg / kg，每日两次。如步骤3所示，在解剖肿瘤后使用数字秤测量肿瘤重量减轻，在用伊马替尼治疗后1周约为50%，在4周时约为80%（图2）。

3. 试剂盒^V558Δ/+ 小鼠器官采集

1. 通过CO₂ 麻醉以每分钟60%的腔室体积的流速对小鼠实施安乐死。呼吸停止后将小鼠留在腔室中至少2分钟，然后进行宫颈脱位以确认死亡。
2. 对所有器械进行消毒，在整个过程中戴上手套，并保持无菌区域。用70%乙醇准备皮肤。用剪刀做一个2厘米的中线垂直切口，然后进入腹腔。锐利地裂开任何腹腔内粘连。
3. 要切除引流肠系膜淋巴结，请按照以下步骤操作。
   1. 识别盲肠并更好地抬起其肠系膜。大约在结肠肠系膜底部的中间，识别肠系膜淋巴结并急剧解剖。淋巴结是灰白色的，大小约为0.5厘米x 0.5厘米。
   2. 根据需要将淋巴结组织分成三部分，以进行蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。对于单细胞悬浮液，将淋巴结组织置于20 mL血清游离培养基（RPMI）中并保持在冰上。
4. 要隔离GIST和盲肠，请按照以下步骤操作。
   1. 试剂盒^V558Δ/+小鼠中的盲肠大多被GIST取代。小心地将回肠结肠连接处与肿瘤的底部分开。要收集盲肠，再次将结肠分开，在肿瘤底部的近端2厘米处。
   2. 在50%-60%的 Kit^{V558Δ / +} 小鼠中，肿瘤的头部含有盲肠组织的盖子，其通常含有浆液，但可能很少含有脓液（图3）。尖锐地解剖帽状组织，使其远离肿瘤组织。
   3. 根据需要将肿瘤组织和/或盲肠分成三部分，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。对于单细胞悬浮液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，足以覆盖样品并保持在冰上。

4. GIST组织的蛋白质印迹分析

1. 制备含有50mM三氢盐酸盐（pH 7.5），150mM氯化钠，5mM EDTA，1%非变性洗涤剂，2mM Na₃VO₄，1 mM PMSF，10mM NaF和20μl/ ml蛋白酶抑制剂混合物的组织裂解缓冲液。
2. 通过混合1800 mL去离子水，2 mL吐温20和200 mL 10x三进制缓冲盐水（TBS），制备1x Tris缓冲盐水溶液和1%吐温20（TBST）。
3. 将步骤3.4.3中的组织重悬于FACS管中，在5mL / g组织裂解缓冲液中，并用机械均质机以15，000rpm在冰上匀浆两次。在冰上孵育裂解物30分钟。
4. 将裂解物转移到1.5 mL微量离心管中。在4°C下以最大速度离心20分钟。 将上清液转移到新的微量离心管中。
5. 电泳在4%至15%梯度凝胶上裂解物，然后转移到硝酸纤维素膜上，如¹⁴中所述。
6. 在1x TBS中洗涤一次膜5分钟，然后在5%牛奶中阻断膜1小时。再次，在1x TBS中洗涤一次膜10分钟。
7. 将膜在一抗中以1:1000在4°C下以5%BSA稀释过夜。在1x TBST中洗涤膜3x，每次10分钟。将具有稀释的1:2500的二抗的印迹在室温下在2.5%牛奶中孵育1小时。
8. 在1x TBS中洗涤一次膜5分钟。加入足够的HRP底物以覆盖膜，通常为200-500μL，并使用数字成像仪检测和量化化学发光。

5. GIST组织的免疫组化

1. 将步骤3.3.2或3.4.3中的组织固定在4%多聚甲醛中，在4°C下过夜。将组织储存在70%的EtOH中，直到准备好进行处理。将厚度为 5 μm 的块嵌入和切片到载玻片上，如^15，16 所述。
2. 使用碱性免疫检测试剂盒完成免疫组化检测，如前^述17所述。

6. 肠系膜淋巴结单细胞悬液

1. 将RPMI培养基与步骤3.3.2中的淋巴结标本倒在100μm过滤器上。将过滤器移至新的50 mL锥形和麦芽浆淋巴结，并用3 mL塑料注射器的软端。用 20 mL RPMI 培养基清洗过滤器。
2. 在4°C下以450× g 离心滤液5分钟。吸出上清液。
3. 将沉淀重悬于PBS（珠状缓冲液）中的20 mL 1%FBS中，并倒在40μm过滤器上。收集细胞滤液。使用血细胞计数器计数细胞。
4. 在4°C下以450× g 离心滤液5分钟。吸出上清液。以6 x 10⁷ 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。

7. GIST的单细胞悬浮液

1. 通过添加250mg胶原酶IV，一片无EDTA蛋白酶抑制剂和100μLDNase I至50mL HBSS来制备胶原酶缓冲液。在室温下旋转10分钟直至溶解。
2. 将GIST放入无菌皿中，加入2.5 mL胶原酶缓冲液。使用无菌手术刀和剪刀切碎肿瘤，直到肿瘤呈细小碎片状。使用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50 mL管中。
3. 在37°C下以100rpm的振荡培养箱中孵育30分钟。用2 mLFBS进行淬灭反应。
4. 将胶原酶与GIST标本一起倒在100μm过滤器上，并用3mL塑料注射器的软端捣碎肿瘤，并收集在50mL管中。用 20 毫升 HBSS 清洗过滤器。将滤液在450× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液。
5. 将沉淀重悬于20 mL磁珠缓冲液中，并倒入40μm过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。将滤液在450× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液。以6 x 10⁷ 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。

8. 盲肠单细胞悬浮液

1. 按照步骤7.1制备胶原酶缓冲液。使用剪刀，纵向分开盲肠以暴露内粘膜。切成 0.5 厘米的切片，放入 50 mL 管中，管内含 5 mL HBSS，含 2% FBS。剧烈摇动30秒，以450× g 离心20秒，然后吸出上清液。
2. 加入 5 毫升 HBSS 和 2 米米 EDTA。在37°C的振荡培养箱中以100rpm孵育15分钟。以450 x g 离心20秒。吸出上清液。
3. 加入 5 毫升哈佛商学院。剧烈摇动30秒，以450× g 离心20秒，然后吸出上清液。再次重复。
4. 加入 5 mL 胶原酶缓冲液。在37°C的振荡培养箱中以100rpm孵育30分钟。每 10 分钟用力摇晃一次。用2 mLFBS进行淬灭反应。
5. 将胶原酶与盲肠标本倒在100μm过滤器上，并用3 mL塑料注射器的软端捣碎。用 20 毫升 HBSS 清洗过滤器。收集滤液。
6. 在4°C下以450× g离心滤液5分钟。 吸出上清液。将沉淀重悬于20 mL珠缓冲液中，并倒在40μm过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。
7. 在4°C下以450× g离心滤液5分钟。 吸出上清液。以6 x 10⁷ 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。

Results

Kit^V558Δ/+小鼠模型允许在免疫功能小鼠模型中研究治疗方法。由于进行性肠梗阻，Kit^{V558Δ / +}小鼠的平均寿命为8个月（图4）。来自Kit^{V558Δ / +}小鼠的肿瘤表达GIST的规范标志物，包括酪氨酸激酶KIT和跨膜通道DOG1（图5）以及转录因子ETV1（未显示）。可以研究肿瘤KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT（图6），或与人类GIST^{8，11，12，}

Discussion

试剂盒^V558Δ/+小鼠模型是GIST分子和免疫学分析的强大研究工具。虽然育种策略需要单次杂交，但在分析肿瘤反应的实验中使用Kit^V558Δ/+小鼠队列需要广泛的育种。小鼠的年龄和性别应匹配，以确保相似的肿瘤重量，并且10%的小鼠在肿瘤建立时在8周龄之前死亡。如果使用先进的成像技术（如CT或MRI）来跟踪个体小鼠内的肿瘤体积，则可能采用不太广泛的育种策略。尽管如此，Kit^V558Δ/+小鼠已成功杂交到其他敲除或诱导小鼠模型，揭示了重要的免疫和分子机制¹²。

来自 Kit^V558Δ/+ 小鼠的肿瘤细胞很容易通过KIT（CD117）的柱分选或通过流式细胞术¹⁸分离。从 试剂盒^{V558Δ / +} 小鼠中分离出的肿瘤细胞可以在 体外¹²

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100微米过滤器	EMSCO	1194-2360
1x RBC裂解缓冲液	Life Technologies	00-4333-57
3mL注射器	Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，10 孔，30 &微量;l	Bio-Rad	4561083
4% 多聚甲醛溶液	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 微米过滤器	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 微米过滤器	EMSCO	1194-2350
AKT 抗体 （C67E7）	Cell Signaling	4691
C57BL/6J	杰克逊实验室
胶原酶IV	Sigma Aldrich	C5138
完全迷你无EDTA蛋白酶抑制剂	Thomas Scientific	C852A34
Countess II自动细胞计数器	Thermo Fisher Scientific
一次性手术刀	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 抗体	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK 抗体 （p44/42）	细胞信号传导	9102
	FBS Thomas Scientific	C788U23
斐济软件	斐济		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 匀浆器	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	宾夕法尼亚大学细胞中心
甲磺酸伊马替尼	Selleck Chemicals	S1026
KIT 抗体 （D13A2）	细胞信号传导	3074
KitV558Δ/+ 基因分型	Transnetyx
微量离心管 （1.5mL）	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
小鼠对小鼠免疫检测试剂盒，Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
硝酸纤维素膜，预切，0.45 µm	Rio-Rad	1620145
脱脂奶粉	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 替代品	Sigma Aldrich	74385
p-AKT 抗体 （S473）	细胞信号传导	4060
p-ERK 抗体 （p44/42）	细胞信号传导	9101
p-KIT 抗体 （Y719）	细胞信号传导	3391
PMSF 蛋白酶抑制剂	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
圆底聚苯乙烯检测 （FACS） 试管	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	宾夕法尼亚大学细胞中心
氟化钠 （NaF）	Sigma Aldrich
原钒酸钠 （Na3VO4）	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura 长效底物	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS 缓冲液 （10x）	宾夕法尼亚大学细胞中心
组织培养皿 （100mm2）	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 平台	Scanco medical