需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中应用的分子与免疫学技术

2.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63853

⸱

2022年5月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本文的目的是描述KitV558Δ/+ 小鼠模型，以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。

摘要

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人类肉瘤，通常由KIT受体中的单一突变驱动。在多种肿瘤类型中，研究人员已开发出大量小鼠模型，用于探索下一代癌症治疗方法。然而，在GIST研究中，大多数体内研究仍采用异种移植小鼠模型，而这类模型具有固有的局限性。本文介绍一种具有完整免疫系统的、经基因工程改造的胃肠道间质瘤小鼠模型，该模型携带KitV558Δ/+突变。在此模型中，导致大多数GIST发生的癌基因突变型KIT由其内源性启动子驱动，从而产生的GIST在组织学形态和免疫细胞浸润特征上均模拟了人类GIST的表现。此外，该模型已成功用于靶向分子治疗和免疫治疗的研究。本文详细描述了KitV558Δ/+小鼠品系的繁育与维持方法，并详述了从KitV558Δ/+小鼠中处理和获取胃肠道间质瘤、引流肠系膜淋巴结及邻近盲肠组织的流程，以及用于分子和免疫学分析的样本制备方法。

引言

胃肠道间质瘤（GIST）是人类最常见的肉瘤，在美国每年约有6000例发病1。GIST似乎起源于被称为 Cajal 间质细胞的胃肠道起搏细胞，通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA中的单一突变驱动2。手术是GIST治疗的主要手段，可能实现治愈；但对于晚期疾病患者，可采用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）伊马替尼进行治疗。自20多年前问世以来，伊马替尼彻底改变了GIST的治疗模式，使晚期疾病的患者生存期从1年提高至5年以上3,4,5。然而，由于KIT基因获得性突变的存在，伊马替尼极少能够实现治愈，因此该肿瘤亟需新的治疗方法。

小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。目前已有多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型被建立并用于胃肠道间质瘤（GIST）的研究6,7。然而，免疫缺陷小鼠并不能完全模拟人类GIST，因为GIST的免疫特征会因其致癌突变类型的不同而有所差异，且调控胃肠道肿瘤微环境可增强酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的效果8,9。KitV558Δ/+ 小鼠在Kit基因第11号外显子上具有杂合性种系缺失，该区域编码跨膜近膜区，是人类GIST中最常发生突变的位点10。KitV558Δ/+ 小鼠以100%的外显率发展出单一的盲肠GIST，其肿瘤在组织学特征、分子信号通路、免疫细胞浸润以及对治疗的反应方面均与人类GIST高度相似8,11,12,13。本文中，我们描述了KitV558Δ/+ 小鼠的繁育、治疗以及样本的分离与处理方法，可用于GIST相关的分子与免疫学研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有小鼠均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，并在宾夕法尼亚大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准的情况下，于宾夕法尼亚大学的无病原体环境中饲养。安乐死操作遵循宾夕法尼亚大学实验动物资源部的标准操作程序进行。

1. KitV558Δ/+ 小鼠繁育

  1. 回交 试剂盒V558Δ/+ 将小鼠在 C57BL/6J 背景上回交超过 10 代，使用 C57BL/6J 小鼠。为此，将雄性 试剂盒V558Δ/+ 小鼠 以1:2的比例与雌性C57BL/6J小鼠配比。
    注意：纯合的 试剂盒V558Δ/V558Δ 基因型在子宫内致死。可以繁殖雌性 试剂盒V558Δ/+ 与雄性C57BL/6J小鼠交配时，其产仔数约为野生型雌性C57BL/6J小鼠的一半。此外，雌性 试剂盒V558Δ/+ 小鼠 4月龄后产仔数有限。
  2. 通过断趾法在7-14日龄对仔鼠进行基因型鉴定，以确认目标基因的存在 试剂盒V558Δ/+ 基因型鉴定。使用以下引物和报告探针进行基因分型：上游引物：TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA；报告探针1：CCTCGACAACCTTCCA；下游引物：TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT；报告探针2：TCTCCTCGACCTTCCA。

2. KitV558Δ/+ 小鼠处理

  1. 在治疗前对KitV558Δ/+小鼠进行年龄和性别匹配。使用年龄和性别相匹配的小鼠进行分组，因为雌性KitV558Δ/+小鼠的肿瘤体积大于雄性小鼠。在小鼠8至12周龄时开始治疗，此时肿瘤已稳定形成（图1）。
  2. 通过口服或腹腔（i.p.）注射给予酪氨酸激酶抑制剂；KitV558Δ/+肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感。可将伊马替尼以600 mg/L的浓度加入饮水中给予，或以45 mg/kg的剂量进行每日两次腹腔注射。在步骤3所示的肿瘤分离后，使用电子天平测量肿瘤重量减少情况，结果显示伊马替尼治疗1周后肿瘤重量减少约50%，4周后减少约80%（图2）。

3. KitV558Δ/+ 小鼠器官采集

  1. 以每分钟60%腔室体积的流速通过CO2麻醉法处死小鼠。呼吸停止后，将小鼠留在腔室内至少2分钟，随后行颈椎脱位以确认死亡。
  2. 所有器械均需灭菌，操作全程佩戴手套，并维持无菌操作区域。用70%乙醇对皮肤进行消毒。使用剪刀做一条2 cm长的正中垂直切口，进入腹腔。锐性分离任何腹腔内粘连组织。
  3. 为取出引流肠系膜淋巴结，请按以下步骤操作。
    1. 识别盲肠并将其肠系膜向上提起。在接近结肠系膜根部约一半位置处，识别肠系膜淋巴结，并进行锐性解剖分离。该淋巴结呈乳白色，大小约为0.5 cm × 0.5 cm。
    2. 根据需要，将淋巴结组织分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。对于单细胞悬液，将淋巴结组织置于20 mL无血清培养基（RPMI）中，并置于冰上保存。
  4. 为分离胃肠道间质瘤（GIST）和盲肠，请按以下步骤操作。
    1. 在KitV558Δ/+小鼠中，盲肠大部分被GIST所取代。小心地从肿瘤基底部分离回盲肠交界处。为采集盲肠，需在肿瘤基底部近端2 cm处再次切断结肠。
    2. 在50%-60%的KitV558Δ/+小鼠中，肿瘤头部包含一层盲肠组织帽状结构，通常含有浆液性液体，但极少数情况下可能含有脓液（图3）。应锐性解剖分离该帽状组织与肿瘤组织。
    3. 根据需要，将肿瘤组织和/或盲肠分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。对于单细胞悬液，将肿瘤组织或盲肠置于含2% FCS的HBSS中，液体量以覆盖样本为宜，并置于冰上保存。

4. 胃肠间质瘤组织的 Western 印迹分析

  1. 配制含有 50 mM TrisHCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% 非变性去垢剂、2 mM Na3VO4、1 mM PMSF、10 mM NaF 和 20 μl/ml 蛋白酶抑制剂混合物的组织裂解缓冲液。
  2. 通过将 1800 mL 去离子水、2 mL Tween 20 和 200 mL 10x Tris-缓冲盐溶液 (TBS) 混合，配制含 1% Tween 20 的 1x Tris-缓冲盐溶液 (TBST)。
  3. 将步骤 3.4.3 中的组织在 FACS 管中用 5 mL/g 组织裂解缓冲液重悬，并在冰上使用机械匀浆器以 15,000 rpm 匀浆两次，每次 15 秒。将裂解物在冰上孵育 30 分钟。
  4. 将裂解物转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以最大转速离心 20 分钟。将上清液转移至新的微量离心管中。
  5. 将裂解物上样于 4% 至 15% 的梯度凝胶进行电泳，然后转移至硝酸纤维素膜，操作方法如文献14所述。
  6. 用 1x TBS 洗涤膜一次，每次 5 分钟，然后在 5% 脱脂奶粉中封闭 1 小时。再次用 1x TBS 洗涤膜一次，每次 10 分钟。
  7. 将膜与以 1:1000 比例溶于 5% BSA 中的一抗在 4 °C 下孵育过夜。用 1x TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。随后将膜与以 1:2500 比例溶于 2.5% 脱脂奶粉中的二抗在室温下孵育 1 小时。
  8. 用 1x TBS 洗涤膜一次，每次 5 分钟。加入足量 HRP 底物覆盖膜，通常为 200–500 μL，并使用数字成像系统检测和定量化学发光信号。

5. GIST 组织的免疫组织化学

  1. 将步骤 3.3.2 或 3.4.3 中的组织在 4 °C 条件下用 4% 多聚甲醛固定过夜。将组织保存在 70% 乙醇中，直至准备进行后续处理。按照文献15,16所述方法，将组织包埋并切成 5 μm 厚的切片，贴附于玻璃载片上。
  2. 使用基础免疫检测试剂盒完成免疫组织化学检测，具体方法如前所述17。

6. 肠系膜淋巴结单细胞悬液的制备

  1. 将步骤 3.3.2 中的含淋巴结样本的 RPMI 培养基倒入 100 μm 滤膜上。将滤膜转移至新的 50 mL 离心管中，用 3 mL 塑料注射器的钝端研磨淋巴结。用 20 mL RPMI 培养基冲洗滤膜。
  2. 在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟，收集滤过液。吸除上清液。 
  3. 将沉淀重悬于 20 mL 含 1% FBS 的 PBS（磁珠缓冲液）中，然后倒入 40 μm 滤膜。收集滤过的细胞悬液。使用血细胞计数板进行细胞计数。
  4. 在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟，收集滤过液。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于磁珠缓冲液中，调整浓度至 6 × 107 个细胞/mL，用于流式细胞术。

7. 胃肠间质瘤的单细胞悬液制备

  1. 通过将 250 mg 胶原酶 IV、一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂和 100 µL DNase I 加入 50 mL HBSS 中来配制胶原酶缓冲液。室温下旋转 10 分钟，直至完全溶解。
  2. 将 GIST 组织置于无菌培养皿中，加入 2.5 mL 胶原酶缓冲液。使用无菌手术刀和剪刀将肿瘤组织切碎至细小碎片。用大孔径移液管将肿瘤组织和胶原酶缓冲液吸入 50 mL 离心管中。
  3. 在 37 °C、100 rpm 条件下于摇床中孵育 30 分钟。加入 2 mL FBS 终止反应。
  4. 将含有 GIST 样本的胶原酶溶液通过 100 μm 滤膜过滤，并用 3 mL 塑料注射器的钝端轻轻研磨肿瘤组织，滤液收集至 50 mL 离心管中。用 20 mL HBSS 冲洗滤膜。将滤液在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。
  5. 将沉淀物重悬于 20 mL 磁珠缓冲液中，再通过 40 μm 滤膜过滤。收集滤液，使用血细胞计数板进行细胞计数。将滤液在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于磁珠缓冲液中，调整浓度至 6 × 107 个细胞/mL，用于流式细胞术。

8. 盲肠单细胞悬液的制备

  1. 按照步骤 7.1 制备胶原酶缓冲液。用剪刀将盲肠纵向切开，暴露内层黏膜。切成 0.5 cm 的小段，放入含有 5 mL 含 2% 胎牛血清（FBS）的 HBSS 的 50 mL 离心管中。剧烈振荡 30 秒，450 × g 离心 20 秒，然后吸除上清液。
  2. 加入 5 mL 含 2 mM EDTA 的 HBSS。在 37 °C、100 rpm 条件下于摇床中孵育 15 分钟。450 × g 离心 20 秒，吸除上清液。
  3. 加入 5 mL HBSS。剧烈振荡 30 秒，450 × g 离心 20 秒，然后吸除上清液。重复此步骤一次。
  4. 加入 5 mL 胶原酶缓冲液。在 37 °C、100 rpm 条件下于摇床中孵育 30 分钟，每 10 分钟剧烈振荡一次。加入 2 mL 胎牛血清（FBS）终止反应。
  5. 将含有盲肠组织的胶原酶溶液倒入 100 μm 滤网，用 3 mL 塑料注射器的钝端研磨组织。用 20 mL HBSS 冲洗滤网，收集滤过液。
  6. 将滤过液在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。将沉淀重悬于 20 mL 磁珠缓冲液中，过 40 μm 滤网。收集滤过液，并用血细胞计数板进行细胞计数。
  7. 将滤过液在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。将细胞沉淀重悬于磁珠缓冲液中，调整浓度至 6 × 107 个细胞/mL，用于流式细胞术。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

KitV558Δ/+ 小鼠模型可用于在免疫功能健全的小鼠模型中研究治疗手段。KitV558Δ/+ 小鼠由于进行性肠梗阻，平均寿命为8个月(图4)。KitV558Δ/+ 小鼠的肿瘤表达胃肠道间质瘤（GIST）的经典标志物，包括酪氨酸激酶KIT和跨膜通道蛋白DOG1(图5)，以及转录因子ETV1（未显示）。可检测这些肿瘤中KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT(图6)，或其免疫微环境，后者与人类GIST高度相似8,11...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

KitV558Δ/+ 小鼠模型是胃肠道间质瘤（GIST）分子与免疫学分析中的有力研究工具。尽管繁育策略仅需单次杂交，但在分析肿瘤反应的实验中使用KitV558Δ/+小鼠队列仍需大规模繁育。为确保肿瘤重量相近，小鼠需匹配年龄和性别，且在肿瘤形成的8周龄前约有10%的小鼠死亡。若采用CT或MRI等先进成像技术对单个小鼠的肿瘤体积进行追踪，则可采用较简化的繁育策略。尽管如此，KitV558Δ/+小鼠已成功与其他基因敲除或可诱导小鼠模型杂交，揭示了重要的免疫与分子机制12。

肿瘤细胞来自 试剂盒V558Δ/+ 小鼠可通过KIT（CD117）柱层析分选或流式细胞术轻松分离18分离的肿瘤细胞来自 试剂盒V558Δ/+ 小鼠可以培育 体外12...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

KitV558Δ/+ 小鼠经基因工程改造，由 Peter Besmer 博士提供10。本研究得到美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01 CA102613 和 T32 CA251063。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 微米滤膜EMSCO1194-2360
1× 红细胞裂解缓冲液Life Technologies00-4333-57
3 mL 注射器赛默飞世尔科技/BD生物科学14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白胶，10 孔，30 µl伯乐（Bio-Rad）4561083
4% 甲醛溶液赛默飞世尔科技AAJ19943K2
40 微米滤器EMSCO1194-2340
5M NaClSigma AldrichS6546
70 微米滤膜EMSCO1194-2350
AKT抗体（C67E7）细胞信号传导4691
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室
胶原酶IVSigma AldrichC5138
完全型无EDTA蛋白酶抑制剂Thomas ScientificC852A34
Countess II 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技
一次性手术刀赛默飞世尔科技/Exel国际14-840-00
Dnase IThomas ScientificC756V81
Dog1抗体abcamab64085
EDTASigma AldrichE9884
ERK 抗体（p44/42）细胞信号传导9102
FBSThomas ScientificC788U23
FIJI 软件FIJIhttps://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 匀浆器赛默飞世尔科技15-340-169
HBSS宾夕法尼亚大学细胞中心
甲磺酸伊马替尼Selleck ChemicalsS1026
KIT 抗体（D13A2）细胞信号传导3074
KitV558Δ/+ 基因分型Transnetyx
微型离心管（1.5 mL）赛默飞世尔科技05-408-129
Mouse on Mouse免疫检测基础试剂盒Vector LaboratoriesBMK-2202
硝酸纤维素膜，预裁，0.45 µmRio-Rad1620145
脱脂奶粉赛默飞世尔科技NC9121673
Nonidet P 40 替代品Sigma Aldrich74385
p-AKT 抗体（S473）细胞信号传导4060
p-ERK 抗体（p44/42）细胞信号传导9101
p-KIT 抗体（Y719）细胞信号传导3391
PMSF蛋白酶抑制剂赛默飞世尔科技36978
蛋白酶K赛默飞世尔科技BP170050
圆底聚苯乙烯流式管（FACS管）Falcon/赛默飞世尔科技14-959-2A
RPMI宾夕法尼亚大学细胞中心
氟化钠（NaF）Sigma Aldrich201154
原钒酸钠（Na3VO4）Sigma AldrichS6508
SuperSignal West Dura 延长作用时间底物赛默飞世尔科技34076
TBS缓冲液（10倍浓缩）宾夕法尼亚大学细胞中心
组织培养皿（100 mm²）赛默飞世尔科技/Falcon08-772E
TrisHCl赛默飞世尔科技BP1757500
Tween 20Rio-Rad1706531
 vivaCT 80 平台Scanco Medical

参考文献

  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
  3. Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
  4. Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
  5. Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
  6. Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
  7. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).
  8. Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
  9. Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
  10. Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
  11. Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
  12. Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
  13. Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
  14. General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
  16. Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
  17. Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
  18. Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
  19. Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

基因工程小鼠免疫功能健全小鼠模型Kit基因突变肿瘤微环境流式细胞术单细胞悬液蛋白质分离酪氨酸激酶抑制剂肿瘤解离
在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中应用的分子与免疫学技术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。