从肉鸡胚胎中分离前脂肪细胞

摘要

本实验方案描述了一种从肉鸡胚胎脂肪组织中分离前脂肪细胞的简单方法。该方法能够高效地分离前脂肪细胞，并实现其原代培养和成脂分化。通过油红O染色以及脂质/DNA染色，检测了经分化培养基诱导后分离细胞的成脂能力。

摘要

原代前脂肪细胞是研究调控脂肪细胞分化和代谢的分子通路的重要实验体系。利用鸡胚可以分离到脂肪组织发育最早阶段的前脂肪细胞。该原代细胞可用于鉴定影响前脂肪细胞增殖及脂肪生成分化的因子，因而成为研究儿童肥胖以及家禽体内多余脂肪沉积调控的宝贵模型。在肉鸡中，出生后脂肪组织的快速生长将饲料资源无效地分配至脂肪而非肌肉生长，造成饲料浪费。因此，深入理解脂肪组织发育的最初阶段，可能为调控这一趋势提供线索，并有助于在生命早期限制脂肪组织的扩张。本研究旨在建立一种高效的方法，用于从商业肉用鸡（肉鸡型）胚胎发育中的脂肪组织分离前脂肪细胞，并进行原代培养及脂肪生成分化。该方法已优化至可获得高活力（约98%）且具有更强分化为成熟脂肪细胞能力的细胞。这种简便的胚胎前脂肪细胞分离、培养与分化方法，为生命早期脂肪生长与发育的功能性研究提供了有力支持。

引言

肥胖是对成人和儿童的全球性健康威胁。超重或肥胖的儿童在成年后肥胖的可能性约为正常儿童的五倍，这使其患心血管疾病、糖尿病及多种共病的风险显著增加。约有13.4%的2至5岁美国儿童患有肥胖症¹，表明体内脂肪过度积聚的倾向可能在生命早期就已形成。出于完全不同的原因，过多脂肪组织的积聚也是肉鸡（肉用型鸡）养殖中的一个关注问题。现代肉鸡的生产效率极高，但仍会积累超过生理需要的脂质^2,3。这种趋势从雏鸡出壳后不久即开始，导致饲料——生产过程中最昂贵的部分——被无效地用于脂肪沉积而非肌肉生长。因此，尽管原因截然不同，但对于儿童和肉鸡而言，均有必要深入了解影响脂肪组织发育的因素，并探索在生命早期限制脂肪组织扩张的方法。

脂肪细胞由前脂肪细胞分化而来，前脂肪细胞是脂肪组织来源的干细胞，可分化为成熟的、储存脂质的脂肪细胞。因此，前脂肪细胞 体外 是肥胖研究中重要的实验模型。这些细胞分离自脂肪组织的基质血管组分，有助于深入理解调控脂肪细胞分化和代谢的分子通路。^4,5鸡胚是发育研究中理想的实验模型，因为通过按需培养鸡蛋可更方便地进行实验操作，无需牺牲母体即可获取处于不同发育阶段的胚胎。此外，与其他较大的....

方案

所有动物实验程序均经田纳西大学机构动物护理和使用委员会批准。新鲜受精的商品代肉鸡蛋（Cobb 500）取自当地孵化场。鸡蛋在38 °C、相对湿度60%的条件下孵化，直至胚胎发育第16至18天（E16-E18）进行解剖。脂肪组织采集自皮下（股部）脂肪库。

1. 分离与培养的准备工作

1. 准备培养罩和仪器。
   1. 开始解剖前，在层流罩内设置工作区域。用70%乙醇擦拭工作区域及所有仪器以进行消毒。所有操作均需使用无菌材料。
      注意：每次将容器和仪器放回细胞培养罩前，务必用70%乙醇擦拭。建议在罩内放置台式仪器灭菌器，以便在处理不同胚胎之间快速对器械进行灭菌。
      警告：使用仪器灭菌器时，应充分冷却高温器械，以防烫伤和组织损伤。建议至少冷却3分钟。使用前用70%乙醇擦拭。
   2. 在罩内准备好以下仪器和器皿：直头镊子（120 mm）、小镊子（110 mm）、两对弯头镊子（100 mm）、两对直剪刀（140 mm）、弯头手术剪刀（115 mm）、组织筛（250 µm 尼龙网）、细胞筛（40 µm 尼龙网）、锥形离心管（15 mL 和 50 mL）、培养皿（60 mm 和 100 mm）、小烧杯（100 mL）、70%乙醇喷雾器、无菌纱布、纸巾和台面清洁布（参见材料表）。
2. 按照以下步骤配制酶解液、....

结果

原代前脂肪细胞在形态上类似于成纤维细胞，呈不规则的星状，具有一个中央细胞核（图2A-C）。这些细胞可迅速贴附于组织培养塑料表面，并在贴壁后很快开始增殖。当培养基中含有脂肪酸时，它们会快速分化并积累脂滴（图3D）。本研究所述分离实验中报告的细胞活力（基于染料排斥法测定为98%）具有代表性。尽管这些细胞具有较强的耐受性，但在分离过程中操作过于剧烈会导致细胞损伤（图3E），从而产生贴壁能力差且无法增殖的细胞。尽管已采取措施防止微生物污染，但仍可能发生非无菌材料的转移（图3F）。由于其增殖速度快，鸡胚前脂肪细胞对培养基中葡萄糖的消耗速率较高。为维持其能量供应，应每48小时更换一次培养基。

此处展示的代表性结果说明了鸡胚前脂肪细胞的成脂潜能。在成脂条件下，这些细胞可迅速积累并形成脂滴，且随.......

讨论

尽管已有多种详细描述的方案报道了前脂肪细胞的分离方法^14,15,16,17，但胚胎来源的前脂肪细胞分离方法已得到优化，可用于肉鸡雏鸡早期脂肪生长与发育的功能分析。本方案可获得高活力且具有强分化潜能的胚胎脂肪细胞前体细胞。此外，本前脂肪细胞分离流程不仅适用于胚胎，也可用于出壳后雏鸡。然而，该方法已针对E16期胚胎进行优化，而出壳后雏鸡的细胞得率显著较低（表1），这可能是由于雏鸡快速生长过程中结缔组织相对含量增加所致。

细胞分离是否成功，最终需通过观察贴壁细胞的形态和数量来评估（图3A）。当组织片段消化时间过长时，尤其是组织解离时间超过1.5小时时，可能会观察到细胞数量减少或细胞受损（图3E

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 移液器	Eppendorf	Z683825	单通道移液器，100 - 1000 µL
1 mL 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-402
100% 异丙醇	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL 锥形瓶	Pyrex	4980-25
37% 甲醛	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6 孔板	Falcon	353046	组织培养处理
96 孔检测板	Costar	3632
96 孔板，黑色底	Costar	3603	组织培养处理
AdipoRed	Lonza	PT-7009
两性霉素 B	Gibco	15290026
台面擦拭纸（Kimtechwiper）	Kimberly-Clark	34155
聚维酮碘	Up & Up	NDC 1167300334	20% 工作液
细胞计数器	Corning	6749
细胞筛，40 µm	SPL	93040
离心机	Eppendorf	5702
鸡血清	Gibco	16110082
锥形离心管，15 mL	VWR	10025-690
锥形离心管，50 mL	Falcon	352098
冻存管	Nunc	343958
弯头镊子，100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
弯头手术剪，115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
蒸馏水	Millipore	SYNSV0000	按需取用
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
乙醇	Decon Labs	2701	70% 工作液
胎牛血清（FBS）	Gibco	10437028
荧光显微镜	EVOS	M7000
荧光酶标仪	Biotek	Synergy H1
铝箔	Reynolds		Reynolds Wrap 加厚型铝箔，125 平方英尺
冻存盒	Thermo Scientific	5100-0001
明胶	Millipore	4055	2% 工作液
血细胞计数板（计数室）	Corning	480200	深度 0.1 mm
培养箱	Fisher Scientific	6845
器械灭菌器	VWR	B1205
亚油酸-油酸-白蛋白	Sigma	L9655	1x 工作液
显微镜	Evos	AMEX1000
多通道移液器	Thermo Scientific	4661070	12 通道移液器，30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
油红 O	Sigma	O-0625
旋转摇床	IKA	KS130BS1
纸巾	Tork	RK8002
封口膜	Parafilm M	PM996
青霉素/链霉素（P/S）	Gibco	15140122	1x 工作液
培养皿，100 mm	Falcon	351029
培养皿，60 mm	Falcon	351007
板式摇床	VWR	200
红细胞裂解缓冲液	Roche	11814389001
试剂储液槽	VWR	89094-680
小烧杯，100 mL	Pyrex	1000-100
分光光度酶标仪	Biotek	Synergy H1
无菌纱布	McKesson	762703
直头镊子，120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
直头剪刀，140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 培养瓶	Corning	430639	组织培养处理
组织培养用培养箱	Thermo Scientific	50144906
组织筛，250 µm	Pierce	87791
台盼蓝染液	Gibco	15250061
胰蛋白酶	Gibco	15400054	0.1% 工作液
镊子，110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
I 型胶原酶	Gibco	17100017
水浴锅	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman 1 号滤纸	Whatman	1001-110