从肉鸡雏鸡胚胎中分离出前脂肪细胞

肥胖对成人和儿童都是一种全球健康威胁。超重或肥胖的儿童肥胖的可能性大约是成年的五倍，使他们患心血管疾病、糖尿病和许多其他合并症的风险显著增加。大约13.4%的美国2-5岁儿童患有肥胖^症1，这表明积累多余身体脂肪的倾向可以在生命早期启动。由于非常不同的原因，过量脂肪组织的积累是肉鸡（肉型）鸡关注的问题。现代肉鸡非常高效，但仍然积累的脂质比生理上必需的多^2，3.这种趋势在孵化后不久就开始了，并通过将其从肌肉生长中分配出来，有效地浪费了饲料，这是最昂贵的生产成分。因此，对于儿童和肉鸡，尽管出于非常不同的原因，但需要了解影响脂肪组织发育的因素，并确定在生命早期限制脂肪扩张的方法。

脂肪细胞形成于前脂肪细胞，脂肪组织来源的干细胞，经过分化以发展成熟的脂质储存脂肪细胞。因此， 体外 前脂肪细胞是肥胖研究的宝贵实验模型。这些从脂肪库的基质血管部分分离出来的细胞，可以提供对控制脂肪细胞分化和新陈代谢的分子途径的基本理解^4，5。雏鸡胚胎是发育研究中一种有利的实验模型，因为按照所需的时间表培养卵子使实验操作更容易，因为它可以在没有母亲牺牲的情况下获得胚胎，以观察胚胎的一系列发育阶段。此外，相对于较大的动物模型，不需要复杂的外科手术和漫长的时间来获得胚胎。因此，雏鸡胚胎提供了从脂肪组织发育的最早阶段获得前脂肪细胞的机会。皮下脂肪组织在胚胎第12天（E12）左右的雏鸡中变得可见，作为位于大腿周围的明确定义的库。该库富含高度增殖的前脂肪细胞，这些前脂肪细胞在发育线索下积极经历分化以形成成熟的脂肪细胞^6，7。脂肪分化的过程在鸡和人类之间是可比的。因此，从雏鸡胚胎中分离出的前脂肪细胞可以作为与人类和家禽相关的研究的两用模型。然而，随着细胞生长成成熟的脂肪细胞，前脂肪细胞的产量随着年龄的增长而下降⁵。

本方案优化了在肉鸡雏鸡胚胎中脂肪细胞分化和脂肪细胞肥大处于峰值的阶段（E16-E18）期间从脂肪组织中分离前脂肪细胞⁸。该过程可以评估发育 中的胚胎在卵中暴露的因素（例如母鸡饮食）对脂肪细胞发育和 离体脂肪电位的影响。它还可以测试各种操作（例如，缺氧、营养物质添加、药理激动剂和拮抗剂）对脂肪细胞祖细胞的脂肪生成或各种'组，代谢组，甲基组）的影响。作为脂肪形成最早阶段的表示，使用该方案获得的细胞是与家禽和人类相关的研究的宝贵模型。

所有动物程序均由田纳西大学机构动物护理和使用委员会批准。新鲜受精的商业肉鸡蛋（Cobb 500）是从当地的孵化场获得的。将卵在38°C下以60%的相对湿度孵育，直到胚胎第16-18天解剖（E16-E18）。从皮下（股骨）库收集脂肪组织。

1. 隔离和培养的准备

1. 准备培养罩和仪器。
   1. 在开始解剖之前，请在层流罩中设置一个工作区。通过用70%乙醇拭子对工作区域和所有仪器进行消毒。使用无菌材料执行所有程序。
      注意:在将容器和仪器放回细胞培养罩之前，始终用70%乙醇擦拭容器和器械。建议在罩中放置一个台式器械灭菌器，以便仪器可以很容易地在胚胎之间灭菌。
      注意:使用器械灭菌器时，请适当冷却热器械，以防止烧伤和组织损伤。建议最小冷却时间为 3 分钟。使用前用70%乙醇拭子。
   2. 在烟罩中组装以下仪器和容器:直镊子（120 mm），镊子（110 mm），两对弯曲镊子（100 mm），两对直剪刀（140 mm），弯曲手术剪刀（115 mm），组织过滤器（250 μm尼龙网），细胞过滤器（40 μm尼龙网），锥形离心管（15 mL和50 mL），培养皿（60 mm和100 mm）， 小烧杯（100 mL），70%乙醇喷雾和无菌纱布，纸巾和台式刮水器（见 材料表）。
2. 按照以下步骤准备酶溶液、收集培养基和培养基。
   注意:提前准备溶液并储存在4°C直至使用。在收集组织之前，需要将培养基放在冰上。此步骤中使用的所有试剂均列在 材料表中。
   1. 通过补充DMEM / F12（Dulbecco的改性鹰培养基含有2.50mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES缓冲液）与2.5μg/ mL的两性霉素B和1x青霉素/链霉素（P / S），100 U / mL，制备用于脂肪组织和制备酶溶液的培养基。储存在4°C直至使用。
      注意:当储存在4°C时，该培养基保持稳定1年。
   2. 通过将甜菜碱稀释至20%（v / v）在1x PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH值为7.4，不含钙，镁或酚红）中用2.5μg/ mL两性霉素B稀释灭菌溶液，储存在4°C直至使用。
      注意:该溶液在4°C下储存时稳定2年。
   3. 通过将1型胶原酶（1mg / mL）溶解在DMEM / F12中，用2.5μg/ mL两性霉素B和1x P / S（步骤1.2.1）制备酶溶液。制作新鲜的胶原酶溶液，并在解剖期间将其保持在冰上。使用前约10分钟，通过在水浴中孵育该溶液在37°C以启动其酶活性来预热。
      注意:每100毫克脂肪组织需要约1毫升胶原酶溶液（1毫克/毫升）。
   4. 通过在DMEM / F12培养基中补充1x P / S和10%FBS来制备用于电镀和繁殖的生长培养基。储存在4°C直至使用。
      注意:当溶液在4°C下储存时，溶液稳定1年。
   5. 通过向1x PBS补充2.5μg/ mL两性霉素B来制备洗涤溶液，将溶液调节至所需的pH 7.4。储存在4°C直至使用。
      注意:该溶液在4°C下储存时稳定2年。

2. 脂肪组织收集和消化

1. 对胚胎实施安乐死。
   1. 在胚胎第16天，从孵化器中取出卵。微生物污染的主要潜在来源是鸡蛋的表面;因此，在开裂之前，用浸泡在70%乙醇中的无菌纱布拭拭鸡蛋。擦拭后，将鸡蛋垂直放置，尖头向下放在衬有纸巾的小烧杯（100毫升）上，以缓冲玻璃上的鸡蛋。
   2. 使用镊子的手柄，通过敲击鸡蛋的钝端来打破鸡蛋。小心地取出蛋壳，以产生一个足够大的开口以取出胚胎（步骤2.1.3）。轻轻撕开白色壳膜以暴露胚胎（图1A）。使用无菌镊子小心地刺穿羊膜（图1B）。
      注意:羊膜囊是一种透明膜，里面装满了包裹胚胎的羊水。
   3. 通过使用直镊子轻轻抓住胚胎的颈部，将胚胎从卵子中取出。切断卵黄囊以将其与胚胎断开连接，然后将胚胎转移到100毫米培养皿中。
   4. 立即使用手术剪刀和镊子斩首。
2. 进行脂肪组织收集。
   1. 用70%乙醇拭子胚胎体，并用无菌纱布轻轻擦洗皮肤表面以去除羽毛，因为它们会干扰消化后后续步骤的过滤。使用台式雨刷器防止皮肤和羽毛接触收集的组织。
   2. 切掉双腿和腹部区域之间的皮肤，露出一对股骨脂肪库。
   3. 用一只手用弯曲的镊子将皮肤固定在腿部周围。用另一只手轻轻地去除股骨皮下脂肪，使用弯曲的镊子轻轻地将库从腿部拉开。
      注意:粘附在腿部脂肪垫上的结缔组织相对较少，并且整个脂肪垫应该仅使用镊子即可一块地移除。这可以通过向后握住镊子来促进，以便弯曲的部分（而不是末端）夹住脂肪垫以进行移除。
      1. 如有必要，用弯曲的剪刀将脂肪垫切开。根据需要用其他脂肪垫和其他胚胎重复上述步骤。
         注意:在E16处，可以从大多数胚胎中获得总共80mg的皮下脂肪（图1C）。这通常产生约1 x 10⁶ 个细胞，足以接种一个T-25烧瓶。在此步骤中，从几个胚胎中称量脂肪垫以评估起始材料的数量可能是有用的，因为脂肪垫的重量可能因特定的肉鸡品系而异，并且由于无法控制的因素，例如育种鸡年龄和饮食。常规从五个卵子中收集皮下脂肪，以确保足够的细胞产量以接种在多个烧瓶中。
   4. 将组织转移到15 mL管中的约5mL收集培养基中，并对剩余的卵子重复解剖。
   5. 通过将收集的脂肪垫转移到含有灭菌溶液的60毫米培养皿中并旋转培养皿几次来短暂冲洗。
   6. 通过将脂肪垫转移到含有1x PBS的60毫米培养皿中来冲洗灭菌溶液。轻轻旋转。重复此步骤，将转移到含有1x PBS的第二个60毫米培养皿中。
3. 按照以下步骤进行酶消化和前脂肪细胞分离。
   1. 将脂肪组织转移到每100mg组织中含有约1mL预热酶溶液的15mL管中。将一把长而直的剪刀浸入管中，并将溶液中的脂肪组织切碎成尽可能小的碎片（〜1mm³）（图2A）。
      注意:如果组织未被彻底切碎，细胞产率将降低。
   2. 将切碎的组织和酶溶液转移到25mL高压灭菌的烧瓶中。用石蜡膜包裹烧瓶。置于培养箱内的轨道振荡器上，在消化步骤中在37°C下摇动。
      注意:或者，使用摇晃水浴。无论采用哪种方法，速度都应足以防止组织碎片沉降到烧瓶底部，但速度不得超过快到将碎片推到烧瓶顶部并粘在玻璃上，或者液体积聚在石蜡膜盖上。
   3. 约30分钟后，将1 mL移液器吸头的末端切成直径约3mm。上下移液组织混合物几次，以帮助从脂肪组织中释放细胞。将烧瓶放回培养箱/水浴中，然后继续摇晃。
   4. 再过15分钟后，检查烧瓶的消化完整性。从振荡器中取出烧瓶后，将在流体层的顶部形成一层白色细胞。如果组织碎片仍然存在，则从另一个移液器尖端切开末端，轻轻地上下移液混合物，然后继续摇动15分钟。
      注意:完全消化的组织/胶原酶混合物看起来像乳白色的食糜。通常，组织在轻轻摇晃1小时后充分消化。如果此时仍有许多片段，则可能表明所使用的胶原酶存在问题。恒定振荡可提高产量;然而，长时间暴露于酶和物理压力也可能损害细胞。
   5. 消化后，轻轻上下移液以充分混合。通过移液将250μm组织过滤器过滤到15 mL管中，以除去任何未消化的组织和碎片。
      1. 通过移液用4 mL生长培养基冲洗烧瓶以除去可能粘附在玻璃上的细胞，并过滤到相同的15 mL管中。通过移液冲洗过滤器，用额外的生长培养基冲洗任何被捕获的细胞，总体积可达14 mL。
   6. 通过在室温下以300× g 离心5分钟（50mL管7分钟）沉淀细胞级分。
      注意:在返回细胞培养罩之前，始终用70%乙醇拭拭管。
   7. 吸出上清液。注意不要移开细胞沉淀。通过上下移液，将沉淀轻轻地重悬于1mL红细胞裂解缓冲液（参见 材料表），并在室温下孵育5分钟。当红细胞裂解时，溶液将变成红色（图2B）。
      注意:使用前将红细胞裂解缓冲液置于室温下。鸡有核红细胞⁹，它们与前脂肪细胞一起附着在组织培养皿上。红细胞裂解缓冲液用于裂解这些细胞，以防止它们干扰准确的细胞计数。
   8. 向含有细胞的管中加入5 mL生长培养基以稀释裂解缓冲液，并通过上下移液轻轻混合。使用移液管，将40μm细胞过滤器过滤到新的50 mL管中，然后用额外的5 mL生长培养基冲洗过滤器。
   9. 通过在室温下以300× g 离心7分钟来沉淀细胞，小心地吸出上清液并通过上下移液将剩余的细胞沉淀重悬于1mL生长培养基中。
      1. 使用血细胞计数器，细胞计数器和台盼蓝染色剂计数细胞并确定细胞活力。取10μL样品，通过移液与10μL台盼蓝混合。将10μL混合物装载到血细胞计数器上并测量¹⁰。
         注意:如果在初始旋转后不容易看到足够的细胞沉淀，则可以将离心速度提高到600 x g 。

3. 前脂肪细胞的播种和培养

1. 在T-25烧瓶中的4 mL预热生长培养基中接种约1 x 10⁶ 个细胞。如果使用其他类型的培养容器，请遵循相同的电镀密度。放入组织培养箱中，让其附着过夜。
   注意:细胞在38°C培养箱中培养，湿度为5%CO₂。禽细胞¹¹ 生长的最佳温度为38°C，它们在37°C下缓慢生长。
2. 第二天，吸出培养基，并通过移液用1x PBS轻轻洗涤细胞以除去未附着或死细胞。更换为 4 mL 新鲜生长培养基。在显微镜下检查细胞。细胞应呈旋转状，如成纤维细胞（图2A）。
   注意:通常，前脂肪细胞附着得相当快（在几个小时内）。细胞分离的成功或失败可以在此时（24小时后）确认。
3. 每2天更换4mL新鲜生长培养基，并在细胞达到70%-80%汇合时传代培养或冷冻保存细胞（图3C）。

4. 传代和冷冻保存

1. 吸出旧培养基，并通过移液用4 mL 1x PBS轻轻洗涤细胞。吸出PBS，加入2mL 0.1%胰蛋白酶以覆盖T-25烧瓶中的细胞表面（相应地调整其他培养容器的体积），然后在38°C下孵育3-4分钟。
   注意:观察细胞是否从培养板上分离。轻轻敲击培养板以帮助细胞脱离。用胰蛋白酶孵育细胞太久会损害细胞。
2. 加入等体积的预热生长培养基以抑制胰蛋白酶反应。在细胞表面上移液几次，倾斜板以松开剩余的细胞。
3. 将细胞悬浮液转移到15mL管中，并在室温下以300× g 离心5分钟（50mL管7分钟）。吸出上清液。
4. 如果传代培养，则通过上下移液将沉淀重悬于1 mL生长培养基中。按照步骤2.3.9.1所述对细胞进行计数，然后使用步骤3.1中最初使用的相同电镀密度重新电镀。
5. 如果冷冻保存，请为90%汇合度的T-25烧瓶准备4 mL冷冻培养基。
   注意:冷冻培养基由 10% 的 DMSO、30% 的 FBS 和 60% 的 DMEM/F12 组成。
6. 将细胞沉淀重悬于冷冻培养基中，并将1mL冷冻培养基转移到冷冻管中。使用冷冻容器将冷冻管缓慢冷冻至-1°C / min。将容器置于-80°C冰箱中过夜，然后将其转移到液氮中长期储存。
   注意:适当冷冻保存的前脂肪细胞保持其活力至少3年，并且在解冻和接种时通常表现得像新鲜分离的细胞一样。

5. 脂肪分化

注意:2%明胶包被板可用于增强细胞粘附力。

1. 在蒸馏水中制备2%（w / v）明胶溶液（参见 材料表）。在121°C，15 psi下高压灭菌30分钟以灭菌。用5-10μL明胶溶液/ cm² （即100-200μg/ cm²）涂布培养表面。轻轻旋转以均匀地涂覆表面。
2. 检查板是否均匀地铺展明胶溶液，因为某些区域最初可能保持未涂布。让明胶包被的板在室温下保持至少1小时。从孔中除去整个体积的明胶溶液。
   注意:这将在孔/培养皿的底部留下薄的明胶涂层。明胶溶液可以重复使用多次（至少10次），而不会改变细胞粘附和生长。在接种细胞之前，让明胶包被的培养皿在组织培养罩中保留至少30分钟。
3. 通过用脂肪酸补充生长培养基，诱导鸡前脂肪细胞发生脂肪分化。为了制备脂肪分化培养基（ADM），用10%鸡血清，1x亚油酸 - 油酸 - 白蛋白（9.4μg/ mL）和1x P / S补充DMEM / F12（见 材料表）。使用前使 ADM 清新保暖。
   注意:鸡前脂肪细胞通常通过用脂肪酸而不是通常用于其他物种脂肪细胞的激素混合物来诱导脂肪分化¹²。
4. 当细胞达到~90%汇合度时，通过用脂肪分化培养基替换生长培养基来诱导分化。维持该培养基中的细胞，每2天更换一次。基于脂质液滴的形成，在显微镜（20x）下目视评估分化，脂质液滴在诱导分化后48小时内变得容易可见。

6. 评估脂肪生成

1. 按照以下步骤执行油红O染色。
   1. 将细胞接种在六孔板中，并以〜90%的汇合度诱导脂肪分化。
   2. 通过将油红O储备溶液的六份与四份蒸馏水在50 mL管中混合来制备油红O的工作溶液。通过上下移液轻轻混合，在室温下静置10分钟，然后将溶液缓慢倒入50mL管中，通过漏斗内的1级滤纸（参见 材料表）过滤。
      注意:油红O储备溶液是通过将0.7g油红O（见 材料表）溶解在高压灭菌瓶中的200 mL 100%异丙醇中制成的。搅拌均匀，静置20分钟。储存在4°C，远离光线直至使用。这是稳定的1年。工作溶液可以使用3 h;但是，建议在2小时内使用它。
   3. 取出培养基，用移液管用 2 mL 预热的 1x PBS 轻轻洗涤孔两次。通过移液完全去除PBS。用2 mL 10%缓冲福尔马林固定细胞，并用石蜡膜包裹板。在染色前在室温下放置至少1小时和最多2天。
      注意:要制作1 L 10%缓冲福尔马林溶液，混合100毫升37%甲醛，4.09克NaH₂PO₄，6.5克Na₂HPO₄ （见 物料表）和900毫升蒸馏水。不要将福尔马林直接移液到细胞上。轻轻地分配在靠近孔底的侧壁上。
   4. 取出福尔马林，用2 mL蒸馏水轻轻清洗孔。用2毫升60%异丙醇代替。5分钟后，除去异丙醇，让孔完全干燥约10分钟。在室温下执行所有染色步骤。
   5. 向细胞中加入1mL油红O工作溶液，并在室温下孵育10-20分钟，通过移液取出污渍，然后浸入自来水洗涤五次，直到没有看到多余的污渍。最终冲洗后，在可视化染色和在显微镜下收集图像之前，向细胞中加入1mL水。
   6. 为了量化每个培养皿的脂质积累，通过加入1-2 mL的100%异丙醇从细胞中除去水并提取油红O染料，该异丙醇足以完全覆盖六孔板孔中的细胞。在室温下在平板振荡器上轻轻摇动10分钟。
   7. 将200μL提取物转移到96孔测定板的孔中。使用分光光度计读板器定量染色的相对量，以测量495nm处的吸光度。
2. 对细胞内脂质液滴和细胞核进行染色测定。
   1. 将细胞板置于黑底96孔板中并诱导脂肪分化，如步骤5.3中所述。
   2. 为了染色细胞，在每孔1x PBS中加入200μL含有荧光脂质染色剂和荧光DNA染色剂（参见 材料表）的染色溶液。在计算所需染色剂的总体积后，使用箔包裹的试管每mL预热的1x PBS加入两滴DNA染色剂和25μL脂质染色剂，以保护溶液免受光照。在室温下孵育20分钟，避光。
   3. 使用荧光板读数器读取荧光（参见 材料表）。使用红色滤光片检测脂质染料（激发:485 nm/发射:572 nm），并通过蓝色/青色滤光片检测DNA染色剂（激发:359 nm/发射:450 nm）。
      注意:染色也可以可视化，并在荧光显微镜下捕获图像。
   4. 将脂质染色强度归一化为DNA染色强度，以量化相对于细胞数¹³的脂质积累。

原代前脂肪细胞在形态上类似于成纤维细胞，具有不规则的星形形状和中央核（图2A-C）。细胞容易粘附在组织培养塑料上，并在附着后不久开始增殖。当在培养基中提供脂肪酸时，它们迅速分化并积累脂质液滴（图3D）。此处代表的分离物中报告的生存能力（98%，基于染料排除）是典型的。虽然细胞相当健壮，但在分离过程中进行积极的处理会导致细胞损伤（图3E），产生附着不良且无法增殖的细胞。尽管采用了防止微生物污染的程序，但可能会发生非无菌材料的转移（图3F）。由于它们的快速生长速度，雏鸡胚胎前脂肪细胞以高速率消耗培养基中的葡萄糖。培养基应每48小时更换一次，以保持其能量供应。

这里介绍的代表性结果说明了雏鸡胚胎前脂肪细胞的致脂潜力。这些细胞在脂肪生成条件下迅速积累以形成脂质液滴，并且积累随着时间的推移而进展（图4和图5）。已经提出了两种方法，可用于更好地可视化和量化这些细胞中的脂质积累程度，这是脂肪生成的直接反映。用油红O染色脂质是一种低成本的方法，用于可视化和量化脂质液滴的积累（图4）。光学显微镜用于收集图像，染色的细胞可以放在台面上，直到收集图像。每个细胞培养皿中的脂质积累可以通过提取染色物并使用分光光度计读取495nm处的吸光度来描述。使用所选脂质和DNA染色剂的组合，可以量化相对于细胞数的脂质积累，这补偿了可能在培养中持续存在的非脂肪细胞（图5）。如果在几个时间点采取措施（图5B-C），这种组合使得可以评估脂肪生成和增殖，例如响应添加的激素或肽。

图1:脂肪组织集合 （A）在打破蛋壳时，白色的壳膜显露出来。（B）用无菌镊子刺穿羊膜。（C）从E16可以获得总共约80mg的股骨皮下脂肪。 请点击此处查看此图的大图。

图2:用于酶消化和消化后细胞沉淀的组织片段（A）酶溶液中切碎的脂肪组织（〜1mm3）。（B）箭头表示红细胞裂解后的细胞沉淀。请点击此处查看此图的大图。

图3:分离的原代前脂肪细胞的细胞形态学比较（A）分离后24小时的前脂肪细胞。（B）分离后48小时的前脂肪细胞。（C）分离后72小时具有80%汇合性的前脂肪细胞。（D）前脂肪细胞在48小时后诱导第4通道，血脂滴可见。插图表示脂质液滴的放大图像。（E）受损细胞的代表性图像。（F） 箭头表示受污染文化中的黑色游泳点。比例尺 = 100 μm.请点击此处查看此图的大图。

图4:通过油红O染色评估脂质积累 （A）24小时，48小时和72小时 后E16前脂肪细胞的油红O染色的代表性图像。比例尺= 100μm.（B）通过洗脱油红O染色测量的脂质液滴的定量。值表示为±平均值， SD.a，b，c P <0.05，由单向方差分析与后Tukey的HSD检验。 请点击此处查看此图的大图。

图5:通过脂质染色/DNA染色评估脂肪细胞分化 （A）脂质染色（红色）和E16前脂肪细胞（蓝色）染色的代表性图像在24小时，48小时和72小时后 离体分化。（B）进行脂质染色（激发:485nm/发射:572nm）以评估分化前脂肪细胞中的脂质积累。（C）进行DNA染色（激发:359nm /发射:450nm）以评估细胞数量的变化。（D）脂质与DNA染色的比例。脂质积累归一化为DNA含量。值表示为±平均值，SD. a，b，c P < 0.05，通过单向方差分析与后 Tukey 的 HSD 检验。 请点击此处查看此图的大图。

表1:从胚胎和孵化后雏鸡中分离出的细胞的平均细胞数和活力。
值表示为±平均值，SD. a，b P < 0.05，由单向方差分析与后 Tukey 的 HSD 检验表示。

作者没有什么可透露的。