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方法文章

将块状水凝胶破碎并加工成颗粒状水凝胶用于生物医学应用

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DOI：

10.3791/63867

⸱

2022年5月17日

 ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute, University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Colorado Boulder

本文内容

摘要

本研究介绍了一种简单、可调且低成本的微凝胶制备方法，该方法基于挤出破碎技术，可将微凝胶加工成可注射的颗粒状水凝胶，并进一步将这些颗粒状水凝胶用作生物医学应用中的挤出式打印墨水。

摘要

颗粒状水凝胶是由水凝胶微粒（即"微凝胶"）堆积而成的聚集体。在生物材料领域，颗粒状水凝胶具有多种优势特性，包括可注射性、微尺度孔隙结构，以及通过混合不同微凝胶群体实现性能调控的能力。目前制备微凝胶的方法通常依赖于水包油乳液技术（如微流控、批量乳化、电喷雾）或光刻技术，这些方法可能对资源和成本要求较高，且与许多水凝胶材料不兼容。本文详细描述了一种简单而高效的方法，通过挤出破碎法制备微凝胶，并进一步将其加工成适用于生物医学应用（例如3D打印油墨）的颗粒状水凝胶。首先，将块状水凝胶（以光交联透明质酸（HA）为例）依次通过一系列直径逐渐减小的针头进行挤出，从而形成破碎的微凝胶。该微凝胶制备技术具有快速、低成本和高度可扩展的优点。文中还介绍了通过离心和真空驱动过滤将微凝胶堆积形成颗粒状水凝胶的方法，并可选择性地进行后续交联以增强水凝胶的稳定性。最后，展示了由破碎微凝胶制备的颗粒状水凝胶作为挤出式打印油墨的应用。尽管本文示例采用光交联HA进行3D打印，但该方法可轻松适配于多种类型的水凝胶及广泛的生物医学应用。

引言

颗粒状水凝胶是通过水凝胶颗粒（即微凝胶）的堆积制备而成，是一类具有多种优异性能的生物材料，在生物医学应用中展现出广阔前景1,2,3。由于其颗粒结构，颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性，因此可被用作挤出式打印（生物）墨水、嵌入式打印的颗粒支撑材料以及可注射治疗剂4,5,6,7,8,9。此外，微凝胶之间的孔隙形成了微尺度孔隙结构，有利于细胞迁移和分子扩散8,10,11。同时，可将多种微凝胶群体组合成单一配方，以增强材料的可调控性和功能多样性8,10,12,13。这些重要特性推动了近年来颗粒状水凝胶研发的迅速发展。

目前有多种方法可用于制备微凝胶以构建颗粒状水凝胶，每种方法均有其优缺点。例如，微凝胶通常通过水包油乳液体系制备，包括使用液滴微流控技术4,11,13,14,15,16,17、批量乳化法7,18,19,20,21,22或电喷法6,23,24,25。这些方法可生成球形微凝胶，其直径具有均一性（微流控法）或呈多分散性（批量乳化法、电喷法）。然而，这些水包油乳液制备方法存在一些局限性，包括可能产量较低、需要低黏度的水凝胶前体溶液，以及设备搭建成本高、资源消耗大。此外，这些方案可能需使用苛刻的油相和表面活性剂，必须通过额外的洗涤步骤将其从微凝胶中去除，从而增加工艺复杂性，并且在许多实验室中难以实现无菌条件下的转化，限制了其在生物医学应用中的推广。(光刻)技术可在无需水包油乳液的情况下使用，通过模具或光掩模控制水凝胶前体溶液的固化过程来制备微凝胶1,26,27。与微流控技术类似，这些方法的生产通量也可能受限，当需要大量制备时，这成为一个主要挑战。

作为这些方法的替代，已采用对整体水凝胶进行机械破碎来制备尺寸不规则的微凝胶19,28,29,30,31,32。例如，可先预先形成整体水凝胶，再使其通过筛网或滤网以产生破碎的微凝胶，该过程甚至已在含有细胞的微凝胶丝中实现33,34。整体水凝胶也可通过机械破坏的方式加工成微凝胶，所用技术包括使用研钵和研杵研磨，或使用商用搅拌机处理35,36,37。此外，也有研究在水凝胶形成过程中施加机械搅动以制备破碎微凝胶（即流体凝胶）31。

本文所述方法在这些机械破碎技术的基础上进行了拓展，提出了一种利用挤出破碎法制备微凝胶的简单方法，并以光交联透明质酸（HA）水凝胶为例进行说明。挤出破碎法仅需使用注射器和针头，即可低成本、高通量且易于放大地制备破碎微凝胶，适用于多种类型的水凝胶19,32。此外，本文还介绍了将这些破碎微凝胶组装成颗粒状水凝胶的方法，可通过离心（低密度填充）或真空驱动过滤（高密度填充）实现。最后，探讨了此类破碎颗粒状水凝胶作为挤出式打印墨水的应用。本实验方案的目标是介绍一系列简便的方法，这些方法可适用于多种水凝胶体系，几乎任何对颗粒状水凝胶感兴趣的研究实验室均可实施。

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方案

1. 使用光交联法在注射器内制备块状水凝胶

注意：使用光交联在注射器内制备块状水凝胶的概述见图1。本方案采用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）通过光介导的巯基-烯烃反应制备块状水凝胶。NorHA合成的详细步骤在其他文献中有描述38。然而，本方案可广泛适用于任何可光交联的水凝胶。更多信息请参见讨论部分。

  1. 预先确定块体水凝胶配方中聚合物、交联剂和引发剂的所需浓度。本方案中，水凝胶前体溶液包含 NorHA（2 wt.%，约 25% 双环戊二烯修饰度）、二硫苏糖醇（DTT，6 mM）和 Irgacure D-2959（I2959，0.05 wt.%）。确保将组分（1 mL）完全溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于微量离心管内。
    注意：配制水凝胶前体溶液时，可向其中加入高分子量 FITC-葡聚糖（2 MDa，0.1 wt.%），以便后续通过荧光显微镜观察本方案中制备的微凝胶。
  2. 用上述水凝胶前体溶液填充一支 3 mL 注射器。
    1. 从空的 3 mL 注射器后端取下活塞，并在注射器筒前端安装一个封帽。
    2. 使用 1,000 µL 移液器将水凝胶前体溶液转移至带封帽的注射器筒内。
    3. 一手握住装有水凝胶前体溶液的注射器筒，使封帽端朝下、筒体开放端朝上；另一手将注射器活塞插入注射器筒后端开口中。轻轻推入活塞，直至完全密封注射器筒后端开口。
    4. 小心保持活塞与注射器筒连接，确保注射器筒后端已被活塞密封，然后将注射器翻转，使活塞朝下、封帽端朝上。取下封帽，缓慢推动活塞进入注射器筒，直至排出所有空气（仅保留水凝胶前体溶液）。
    5. 重新安装封帽至注射器上。确保水凝胶前体溶液已通过封帽密封于 3 mL 注射器内。
  3. 在 3 mL 注射器内形成块体水凝胶。
    1. 开启紫外灯前，应采取适当的个人防护装备（PPE）和安全措施，包括佩戴防紫外线护目镜，并对紫外灯区域进行遮蔽，以保护他人免受紫外光照射。
    2. 使用辐射计将紫外点光源固化仪校准至光强 10 mW/cm2。
      注意：紫外光穿过注射器筒时会发生衰减。在制备前，应使用辐射计测定光衰减百分比，并相应调整点光源系统的输出光强，以补偿该衰减。
    3. 将装有水凝胶前体溶液的 3 mL 注射器置于紫外点光源固化仪下，照射一定时间以实现完全光交联。对于本方案所述体系，NorHA 水凝胶前体溶液在 10 mW/cm2 光强下照射 5 分钟，根据先前研究39，该时间和光强足以通过光交联振荡剪切流变学时间扫描确认实现完全交联。
      注意：为确保注射器内水凝胶完全光交联，可在光交联过程中间翻转注射器一次。
    4. 关闭紫外灯并取出注射器。确认水凝胶已在注射器内完成光交联。可通过回拉活塞观察水凝胶是否以整体固态移动，而非呈黏性液体流动来判断。

色谱过程示意图；注射器过滤；蛋白质纯化；荧光分析。
图1：在注射器内通过光交联制备块状水凝胶的示意图。 该图展示了（A）从注射器中取出活塞，（B）将针头帽固定到注射器筒上，（C）将水凝胶前体加入注射器筒内，（D）将活塞重新插入注射器，（E）排出多余空气并固定针头帽，以及（F）在注射器内进行块状水凝胶的光交联。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 使用挤出破碎法制备微凝胶

注意：使用挤出破碎法制备微凝胶的示意图见图2。

  1. 从一个空的 3 mL 注射器后部取下活塞。将一个尖端帽固定到鲁尔锁上。
  2. 从含有光交联块状水凝胶的注射器上取下尖端帽。将水凝胶注射器的顶部与空注射器筒的开口对齐。
  3. 将块状水凝胶通过注射器开口（不连接针头）挤入空注射器的筒内。将现已为空的注射器（先前含有水凝胶）正确弃置于相应的废液流中。
  4. 握住含有挤出水凝胶的注射器，使尖端帽朝下，筒的开口朝上。使用 1,000 µL 移液器，向注射器筒内加入 1.5 mL 的 PBS。
  5. 将注射器活塞与筒的开口对齐，轻轻推入活塞，刚好形成密封。将注射器倒置，使活塞朝下，尖端帽朝上，注意握住活塞和注射器筒，防止水凝胶或 PBS 泄漏。反复倒置数次，使破碎的水凝胶与所加 PBS 充分混合。
  6. 握住注射器，使尖端帽朝上，活塞朝下。取下尖端帽。非常轻柔地向上推动活塞，以排出注射器内部的任何空气。
    注意：3 mL 注射器的后部可能存在一个凹槽，需要额外施力才能推动活塞。请非常小心地将活塞推过该凹槽。任何突然或过大的力量都可能导致活塞移动过快，从而可能将破碎的水凝胶悬浮液挤出。
  7. 通过一系列针头挤出破碎的水凝胶悬浮液，以制备破碎的微凝胶。
    1. 将一个钝头 18 G 针头固定到含有破碎水凝胶和 PBS 的注射器顶部。从一个新的 3 mL 注射器上取下活塞，并将一个尖端帽固定到空注射器筒上。
    2. 将破碎的水凝胶悬浮液通过 18 G 针头挤入空注射器筒的后部。将用过的空注射器和针头弃置于适当的锐器废物流中。
    3. 握住含有破碎水凝胶悬浮液的注射器，使尖端帽朝下，筒的开口朝上。将注射器活塞与筒的开口对齐，仅轻微推入活塞，以形成密封。
    4. 将注射器倒置，使活塞朝下，尖端帽朝上，注意握住活塞和注射器筒，防止水凝胶或 PBS 泄漏。
    5. 握住注射器，使尖端帽朝上，活塞朝下。取下尖端帽。非常轻柔地向上推动活塞，以排出注射器内部的任何空气。参见上述注意事项，关于轻柔推动注射器活塞以防止水凝胶材料意外挤出。
    6. 使用 23 G、27 G 和 30 G 针头重复步骤 2.7.1–2.7.5。在最后的挤出步骤（使用 30 G 针头）中，将破碎的水凝胶悬浮液挤入微量离心管中。对于本文所述的体积，最终破碎的水凝胶悬浮液体积约为 2.5 mL，需使用两个 1.5 mL 微量离心管（体积均分）。
      注意：挤出破碎的水凝胶悬浮液通过针头时不应需要过度施力。为确保最佳安全操作，建议在化学通风橱内进行所有挤出破碎步骤，以防挤出过程中注射器过度加压。此外，该过程也可在生物安全柜或层流罩中轻松完成，以在制备过程中保持无菌状态。详见“讨论”部分中的其他故障排除建议。
  8. 清洗并分离破碎的水凝胶悬浮液。
    注意：清洗破碎的微凝胶有助于去除任何未反应的聚合物和交联剂。此外，离心有助于将微凝胶从悬浮液中分离，形成沉淀。
    1. 使用微量离心机，以 5,000 x g 离心 5 分钟，使破碎的微凝胶悬浮液沉淀。
    2. 使用移液器移除上清液。向每个含有破碎微凝胶的微量离心管中加入 1 mL PBS，并涡旋 5–10 秒。
    3. 重复离心和 PBS 清洗 3 次。

使用注射器进行逐步液-液萃取过程；相分离方法示意图。
图 2：通过挤出破碎法制备微凝胶的流程示意图。 该图展示了（A）将块状水凝胶挤入空注射器筒中并加入 PBS，（B）在装有破碎水凝胶的注射器中插入活塞，（C）连接18 G针头并将破碎后的水凝胶悬浮液挤入另一空注射器筒中，以及（D）依次使用23 G、27 G和30 G针头重复挤出破碎步骤，最终挤出时将破碎后的水凝胶悬浮液收集至微量离心管中。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用 ImageJ 表征碎片化微凝胶

注意：使用 ImageJ 对碎片化微凝胶进行表征的总体流程如图3所示，图中还包括一批碎片化微凝胶中尺寸分布和形状的代表性结果。在成像前，微凝胶应进行荧光标记。例如，可在水凝胶整体破碎前，将高分子量的FITC-葡聚糖（2 MDa）包埋于块体水凝胶中，以制备荧光素标记的微凝胶。

  1. 结合 20 µL 破碎微凝胶悬浮液的 180 µL 加入 PBS 制成稀释的碎片化微凝胶悬液。涡旋振荡以充分混匀。
  2. 转移 50 µL 将稀释的碎片化微凝胶悬液滴加到玻璃显微镜载玻片上。
  3. 使用落射荧光显微镜以4倍或10倍放大倍数获取荧光标记微凝胶的图像。
    注意：微凝胶悬浮液的浓度应足够稀，以确保相邻微凝胶彼此不接触，同时又足够浓，使视场中可见数十个微凝胶。可根据实际情况调整微凝胶悬浮液的稀释度以达到此状态。
  4. 使用 ImageJ 分析碎片化的微凝胶颗粒。有关使用该方法的更多详细信息 分析颗粒 ImageJ 中的功能可在所提供的链接中找到 材料表.
    1. 在 ImageJ 中打开悬浮微凝胶的图像。
    2. 选择 分析 > 设置测量, 检查 面积，形状描述符，以及 费雷特直径. 点击 好的.
    3. 选择 图像 > 类型 > 8位.
    4. 选择 图像 > 调节 > 阈值调整阈值，使微凝胶被红色遮罩覆盖，而背景保持黑色。点击 应用.
      注意：如果有微凝胶轻微重叠，请使用 铅笔工具 绘制一条细的（<5像素）的黑线将微凝胶在黑白图像中分隔开来。
    5. 选择 分析 > 分析颗粒设置 大小 像素2) 从 50 到无穷大以降低背景噪声。设置 圆形度 至 0.00-1.00。选择 显示大纲 从下拉菜单中。检查 显示结果, 排除边缘区域，以及 包含孔洞. 保持其余复选框未勾选。点击 好的.
    6. 结果展示窗口将打开，包含所识别出的每个微凝胶的面积、形态描述符和费雷特直径信息。将结果复制并粘贴到电子表格中。
    7. 测定每个颗粒的当量圆直径。
      1. 获取图像比例尺 µm/pixe根据比例尺或仪器信息，创建一个电子表格列，将每个微凝胶的面积从像素转换为实际单位2 到 µm2.
      2. 使用该区域 µm2 以确定微凝胶的等效圆直径 µm （即取面积除以 π 后的平方根，再乘以 2）。
    8. 使用 µm/pixel 用于将每个微凝胶的Feret直径（即颗粒边界上任意两点之间的最长距离）转换为单位 µm.
    9. 每个微凝胶的圆形度（"Circ."）、长宽比（"AR"）、圆整度（"Round"）和实心度值可直接从 ImageJ 获取使用。
    10. 根据需要分析微凝胶群体，考虑其直径（等效圆直径和费雷特直径）、圆形度、长宽比、圆整度和实心度的分布情况。

显微镜图像分析；荧光检测；颗粒表征；箱形图数据分析。
图 3：使用 ImageJ 表征碎片化微凝胶颗粒的流程概述。该图展示了（A）制备碎片化微凝胶颗粒的稀释悬浮液，并利用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对悬浮状态下的微凝胶进行成像（比例尺 = 500 µm）；（B）在 ImageJ 中将图像转换为二值图像并分析颗粒（计数、形态描述符等）；以及（C）代表性分析结果。误差线表示最小值和最大值，内四分位范围已标出。图中显示了 n = 100 个微凝胶的群体数量。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 将碎片化微凝胶组装成颗粒状水凝胶

注意：本文提供了两种通过微凝胶碎片制备颗粒状水凝胶的方法，分别使用离心法和过滤法。方法的选择取决于所需的微凝胶堆积密度（即，过滤法可使颗粒更紧密堆积）以及是否包含生物组分（即，离心法可保留颗粒间的组分，而在过滤过程中这些组分可能会丢失）。先前的研究40已详细描述了通过离心或真空驱动过滤所形成的颗粒状水凝胶在力学性能、孔隙率等方面的比较结果。

  1. 方法一：通过离心使微凝胶碎片聚集形成颗粒水凝胶。
    1. 在最后一次洗涤步骤中移除 PBS 上清液后，向每个微量离心管中加入 1 mL PBS，并重新悬浮微凝胶。
    2. 在 18,000 x g 条件下离心 5 分钟，使微凝胶碎片悬浮液沉淀。
      注意：如需获得堆积密度较低的颗粒水凝胶，可使用较低的离心速度进行微凝胶的聚集。
    3. 移除 PBS 上清液。
    4. 取一支新的 3 mL 注射器，取出活塞。使用金属刮勺将微量离心管中的微凝胶碎片颗粒水凝胶舀出，并转移至空注射器筒的后部。可使用移液枪吸头辅助将颗粒水凝胶转移至注射器中。将活塞重新插入注射器。此时已将微凝胶碎片颗粒水凝胶装入注射器，可直接使用。
  2. 方法二：通过真空驱动过滤使微凝胶碎片聚集。图 4 展示了真空驱动过滤聚集过程的示意图。
    1. 组装并测试真空驱动过滤装置。
      1. 将布氏漏斗固定在抽滤瓶中，将滤器适配器置于漏斗与瓶口之间。
      2. 使用管路将抽滤瓶连接至真空源。
      3. 在布氏漏斗杯中放置一张膜滤器（0.22 µm）。
      4. 打开旋钮阀，启动真空源。通过移液约 0.5 mL PBS 至膜滤器上测试连接是否正常，观察 PBS 是否完全通过滤膜并收集于抽滤瓶底部。
    2. 开启真空源，并确保系统密封良好。涡旋震荡微凝胶碎片悬浮液，使微凝胶均匀悬浮于 PBS 中。
    3. 使用 1,000 µL 移液枪将微凝胶碎片悬浮液转移至膜滤器（0.22 µm）上。转移全部悬浮液后，等待约 30 秒，使真空将 PBS 从微凝胶碎片悬浮液中抽出。随后关闭真空源。
      注意：微凝胶碎片悬浮液在膜滤器上受真空抽滤的时间可根据需要调整。详见“讨论”部分中的说明及故障排除建议。
    4. 取一支新的 3 mL 注射器，取出活塞。使用金属刮勺将滤器上的微凝胶碎片颗粒水凝胶刮下，并转移至空注射器筒的后部。可使用移液枪吸头辅助将颗粒水凝胶转移至注射器中。将活塞重新插入注射器。将微凝胶碎片颗粒水凝胶装入注射器，即可使用。

真空过滤过程示意图；实验室装置中的样品应用与过滤；分步方法。
图 4：通过真空驱动过滤使微凝胶堵塞，以制备紧密堆积的碎片化颗粒水凝胶的示意图。 该图展示了（A）将膜滤器放置在真空过滤装置上，（B）使用移液器将碎片化微凝胶悬浮液转移至滤膜上，（C）启动真空抽滤并等待微凝胶发生堵塞，形成颗粒状水凝胶，（D）关闭真空，使用金属刮刀将碎片化的颗粒水凝胶取出，以及（E）使用金属刮刀将颗粒水凝胶转移至注射器中。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 使用颗粒状水凝胶油墨进行挤出式打印

注意：挤出打印过程的概述如图所示 图5，包括使用经真空驱动过滤使碎片化颗粒水凝胶致密化后打印星形结构的代表性示例。打印流程包括配制油墨、设计打印图案，随后根据预设图案进行油墨打印41如有需要，可在挤出后通过光交联稳定打印的颗粒水凝胶结构：在微凝胶碎片悬浮液发生阻塞前，加入过量DTT（5 mM）和I2959（0.05 wt.%），随后进行光照交联。这将导致微凝胶之间形成光交联的共价键，从而实现颗粒水凝胶结构的永久稳定。

  1. 墨水配方
    1. 在规划过程中，需考虑所用墨水的特性。为表征墨水，应对碎裂水凝胶进行流变学分析，以指导打印设计过程。有关颗粒状水凝胶流变学表征的方法已在其他文献中描述，可适用于本研究40。
    2. 根据流变学分析结果，选择打印平台及一系列初始打印参数。
      注意：由于颗粒状水凝胶墨水整体具有高黏度和剪切稀化特性，通常采用基于螺杆的挤出式打印机。
  2. 打印设计
    注意：本实验使用 Repetier Host 软件（下文简称 3D 打印软件）进行 3D 打印操作（步骤 5.2–5.3）。
    1. 通过计算机辅助设计（CAD）软件创建打印设计。用户可从零开始创建新设计，或修改现有设计，例如来自患者组织扫描图像或其他用户的设计。有关创建 CAD 设计的更多信息，请参阅以下参考文献41,42,43。
    2. 为将 CAD 模型转换为 G 代码，需确保 CAD 文件保存为“.stl”格式（补充文件 1），并通过顶部面板的加载按钮或菜单栏中的 文件 > 加载 选项上传至 3D 打印软件。该 G 代码定义了墨水沉积的打印路径。补充文件中已提供一个空心圆柱体的示例 .stl 文件。
    3. 将 STL 文件上传至 3D 打印软件后，进入 切片 面板，并选择 Slic3r 作为切片工具。在此处，可根据墨水表征结果和期望的打印效果调整喷嘴直径、层高、打印速度和挤出速率等参数。在本方案中，使用 18 G 针头（内径 838 µm），层高设为 1 mm，打印速度设为 8 mm/s，流速设为 9 µL/s，以上参数基于先前优化结果39。可根据颗粒状水凝胶墨水性质的差异，将各参数数值调整 ±20%。
      注意：需注意，这些设置和打印设计可能需要通过反复实验进行调整，具体取决于墨水配方的变更、期望的打印分辨率或所使用的打印平台。有关这些参数以及新型墨水配方下打印参数表征的更多信息，请参阅其他参考文献40,44,45,46。
  3. 使用碎裂颗粒状水凝胶进行挤出打印
    1. 关于如何将碎裂颗粒状水凝胶装入注射器，请参见步骤 4.2.4，以及 图 4 和 图 5。
    2. 取下针头帽，并更换为所需针头。
    3. 将注射器装入所选的打印平台。本实验中使用自行构建的基于螺杆的挤出式打印机。
      注意：有关构建定制生物打印机的信息，请参阅其他参考文献44,47。
    4. 将规划阶段准备好的 G 代码文件载入 3D 打印软件。进入 打印预览 面板并点击 打印。
    5. 一旦打印沉积完成，立即用紫外光照射碎裂颗粒状水凝胶结构，以实现光交联和稳定化。
    6. 交联完成后，用 PBS 洗涤样品三次以进行后续处理。

3D生物打印过程：注射器准备、计算机设计、挤出装置设置、生物材料结果。
图5：使用碎片化颗粒水凝胶进行挤出式打印的示意图。 该图展示了（A）使用刮刀将碎片化颗粒水凝胶转移至注射器筒内，（B）安装钝头针头（图示为18 G）并将样品推至顶部，（C）与计算机软件连接以进行打印的示意图，以及（D）利用碎片化颗粒水凝胶完成星形结构的打印。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

这些方案的代表性结果如图3和图6所示。挤出破碎法产生的微凝胶呈锯齿状多边形，直径范围为10–300 µm（图3）。此外，圆形度范围为0.2（非圆形）至近1（完美圆形），长径比范围为1–3（图3）。这些参数描述了破碎过程所形成的不规则且边缘锯齿状的微凝胶形态。

通过离心或真空驱动过滤紧密堆积后，所形成的颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性，如先前的研究39所述。此外，这种破碎的颗粒状水凝胶作为可注射水凝胶，表现出高形状保真度和机械完整性，如图6中挤出打印出的高度为2 cm的空心圆柱体所示。采用这些简单且经济高效的方法制备的破碎颗粒状水凝胶，适用于多种生物医学应用，包括可注射治疗剂和3D打印油墨。

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讨论

本文描述了利用挤出破碎法制备微凝胶颗粒，并通过离心或真空驱动过滤进行堆积以形成颗粒状水凝胶的方法。与其他微凝胶制备方法（如微流控技术、批量乳化法、电喷雾法、光刻技术）相比，挤出破碎法具有制备速度快、成本低、易于放大，并且适用于多种水凝胶体系的优点。此外，该方案重复性高，批次间差异极小，这一点已在先前的研究中得到表征39。

本方案采用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA），通过光介导的硫醇-烯反应制备块状水凝胶。NorHA 的合成详细步骤在其他文献中有描述38。然而，若能在注射器筒内形成块状水凝胶，则本文所述方法可适用于多种水凝胶化学体系来制备碎片化微凝胶。了解块状水凝胶的力学性能（例如压缩模量）也很重要。本方案中使用的块状水凝胶其整体压缩模量约为 30 kPa39。压缩模量更高的块状水凝胶在碎片化步骤中需要更大的挤出力，可能导致堵塞加剧或注射器过压；因此建议使用压缩模量低于 80 kPa 的水凝胶。此外，压缩模量低于 10 kPa 的块状水凝...

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披露

作者没有相互竞争的经济利益。

致谢

本工作由美国国家科学基金会通过宾夕法尼亚大学MRSEC项目（DMR-1720530）和研究生研究奖学金（授予V.G.M.和M.E.P.）以及美国国立卫生研究院（R01AR077362，授予J.A.B.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 塑料锥形离心管Corning430766
30 G NT 高级系列分配吸头Jensen GlobalJG30-0.5HPX此处列出的目录编号适用于 30 G、0.5" 针头。提供多种规格。
BD 带鲁尔锁扣头的一次性注射器（3 mL）Fisher Scientific14-823-435此处列出的目录编号适用于 3 mL 注射器。提供多种规格（14-823-XXX）。
黑色文件夹多家供应商
用于注射器和分配设备的一次性探针针头（18 G，0.5"）Grainger5FVH5此处列出的目录编号适用于 18 G、0.5" 针头。提供多种规格。
用于注射器和分配设备的一次性探针针头（23 G，0.5"）Grainger5FVJ3
用于注射器和分配设备的一次性探针针头（27 G，1.5"）Grainger5FVL0
杜尔贝科磷酸盐缓冲液Fisher Scientific14190-250此处列出的目录编号适用于每箱 10 瓶，每瓶 500 mL 的包装。
Durapore 膜滤器，0.22 µmMilliporeGVWP04700
落射荧光或共聚焦显微镜多家供应商用于观察微凝胶和颗粒状水凝胶
Eppendorf 带卡扣盖的微量离心安全锁管Fisher Scientific05-402-25
挤出式打印机定制设备可使用其他挤出式打印机，例如市售的 BIOX。
滤器接头Fisher Scientific05-888-107此处列出的目录编号适用于多种尺寸的套装。提供多种规格（05-888-XXX）。
抽滤瓶多家供应商
异硫氰酸荧光素-葡聚糖（2 MDa）Sigma-Aldrich52471
玻璃显微镜载玻片多家供应商
ImageJ美国国立卫生研究院"分析颗粒" 信息链接：https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
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微量离心机多家供应商转速可达 18,000 × g
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OmniCure S2000 点式紫外光固化系统Excelitas TechnologiesS2000如需要，可使用不同的光照系统来制备块状水凝胶。
带固定穿孔板的瓷质布氏漏斗Fisher ScientificFB966C此处列出的目录编号适用于直径为 56 mm 的穿孔板。提供多种规格。
辐射计多家供应商
Repetier HostHot-World GmbH & Co. KG3D 打印软件
螺杆式挤出打印机多家供应商本研究使用了经过定制改装的 3D FDM 打印机（Velleman K8200）。存在多种替代方案。
Solidworks/CAD 软件Dassault Systèmes SolidWorks Corporation可使用其他程序，例如 Blender 或 TinkerCAD。
连接抽滤瓶与真空管线的管路多家供应商
紫外光防护眼镜（即安全护目镜）多家供应商

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