本研究介绍了一种简单、可调且低成本的微凝胶制备方法，该方法基于挤出破碎技术，可将微凝胶加工成可注射的颗粒状水凝胶，并进一步将这些颗粒状水凝胶用作生物医学应用中的挤出式打印墨水。
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本文内容
摘要
摘要
颗粒状水凝胶是由水凝胶微粒（即"微凝胶"）堆积而成的聚集体。在生物材料领域，颗粒状水凝胶具有多种优势特性，包括可注射性、微尺度孔隙结构，以及通过混合不同微凝胶群体实现性能调控的能力。目前制备微凝胶的方法通常依赖于水包油乳液技术（如微流控、批量乳化、电喷雾）或光刻技术，这些方法可能对资源和成本要求较高，且与许多水凝胶材料不兼容。本文详细描述了一种简单而高效的方法，通过挤出破碎法制备微凝胶，并进一步将其加工成适用于生物医学应用（例如3D打印油墨）的颗粒状水凝胶。首先，将块状水凝胶（以光交联透明质酸（HA）为例）依次通过一系列直径逐渐减小的针头进行挤出，从而形成破碎的微凝胶。该微凝胶制备技术具有快速、低成本和高度可扩展的优点。文中还介绍了通过离心和真空驱动过滤将微凝胶堆积形成颗粒状水凝胶的方法，并可选择性地进行后续交联以增强水凝胶的稳定性。最后，展示了由破碎微凝胶制备的颗粒状水凝胶作为挤出式打印油墨的应用。尽管本文示例采用光交联HA进行3D打印，但该方法可轻松适配于多种类型的水凝胶及广泛的生物医学应用。
引言
颗粒状水凝胶是通过水凝胶颗粒（即微凝胶）的堆积制备而成，是一类具有多种优异性能的生物材料，在生物医学应用中展现出广阔前景1,2,3。由于其颗粒结构，颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性，因此可被用作挤出式打印（生物）墨水、嵌入式打印的颗粒支撑材料以及可注射治疗剂4,5,6,7,8,9。此外，微凝胶之间的孔隙形成了微尺度孔隙结构，有利于细胞迁移和分子扩散8,10,11。同时，可将多种微凝胶群体组合成单一配方，以增强材料的可调控性和功能多样性8,10....
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方案
1. 使用光交联法在注射器内制备块状水凝胶
注意：使用光交联在注射器内制备块状水凝胶的概述见图1。本方案采用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）通过光介导的巯基-烯烃反应制备块状水凝胶。NorHA合成的详细步骤在其他文献中有描述38。然而，本方案可广泛适用于任何可光交联的水凝胶。更多信息请参见讨论部分。
- 预先确定块体水凝胶配方中聚合物、交联剂和引发剂的所需浓度。本方案中，水凝胶前体溶液包含 NorHA（2 wt.%，约 25% 双环戊二烯修饰度）、二硫苏糖醇（DTT，6 mM）和 Irgacure D-2959（I2959，0.05 wt.%）。确保将组分（1 mL）完全溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于微量离心管内。
注意：配制水凝胶前体溶液时，可向其中加入高分子量 FITC-葡聚糖（2 MDa，0.1 wt.%），以便后续通过荧光显微镜观察本方案中制备的微凝胶。 - 用上述水凝胶前体溶液填充一支 3 mL 注射器。
- 从空的 3 mL 注射器后端取下活塞，并在注射器筒前端安装一个封帽。
- 使用 1,000 µL 移液器将水凝胶前体溶液转移至带封帽的注射器筒内。
- 一手握住装有水凝胶前体溶液的注射器筒，使封帽端朝下、筒体....
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结果
这些方案的代表性结果如图3和图6所示。挤出破碎法产生的微凝胶呈锯齿状多边形，直径范围为10–300 µm（图3）。此外，圆形度范围为0.2（非圆形）至近1（完美圆形），长径比范围为1–3（图3）。这些参数描述了破碎过程所形成的不规则且边缘锯齿状的微凝胶形态。
通过离心或真空驱动过滤紧密堆积后，所形成的颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性，如先前的研究39所述。此外，这种破碎的颗粒状水凝胶作为可注射水凝胶，表现出高形状保真度和机械完整性，如图6中挤出打印出的高度为2 cm的空心圆柱体所示。采用这些简单且经济高效的方法制备的破碎颗粒状水凝胶，适用于多种生物医学应用，包括可注射治疗剂和3D打印油墨。
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讨论
本文描述了利用挤出破碎法制备微凝胶颗粒，并通过离心或真空驱动过滤进行堆积以形成颗粒状水凝胶的方法。与其他微凝胶制备方法（如微流控技术、批量乳化法、电喷雾法、光刻技术）相比，挤出破碎法具有制备速度快、成本低、易于放大，并且适用于多种水凝胶体系的优点。此外，该方案重复性高，批次间差异极小，这一点已在先前的研究中得到表征39。
本方案采用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA），通过光介导的硫醇-烯反应制备块状水凝胶。NorHA 的合成详细步骤在其他文献中有描述38。然而，若能在注射器筒内形成块状水凝胶，则本文所述方法可适用于多种水凝胶化学体系来制备碎片化微凝胶。了解块状水凝胶的力学性能（例如压缩模量）也很重要。本方案中使用的块状水凝胶其整体压缩模量约为 30 kPa39。压缩模量更高的块状水凝胶在碎片化步骤中需要更大的挤出力，可能导致堵塞加剧或注射器过压；因此建议使用压缩模量低于 80 kPa 的水凝胶。此外，压缩模量低于 10 kPa 的块状水凝.......
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披露
作者没有相互竞争的经济利益。
致谢
本工作由美国国家科学基金会通过宾夕法尼亚大学MRSEC项目（DMR-1720530）和研究生研究奖学金（授予V.G.M.和M.E.P.）以及美国国立卫生研究院（R01AR077362，授予J.A.B.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 塑料锥形离心管 | Corning | 430766 | |
| 30 G NT 高级系列分配吸头 | Jensen Global | JG30-0.5HPX | 此处列出的目录编号适用于 30 G、0.5" 针头。提供多种规格。 |
| BD 带鲁尔锁扣头的一次性注射器（3 mL） | Fisher Scientific | 14-823-435 | 此处列出的目录编号适用于 3 mL 注射器。提供多种规格（14-823-XXX）。 |
| 黑色文件夹 | 多家供应商 | ||
| 用于注射器和分配设备的一次性探针针头（18 G，0.5"） | Grainger | 5FVH5 | 此处列出的目录编号适用于 18 G、0.5" 针头。提供多种规格。 |
| 用于注射器和分配设备的一次性探针针头（23 G，0.5"） | Grainger | 5FVJ3 | |
| 用于注射器和分配设备的一次性探针针头（27 G，1.5"） | Grainger | 5FVL0 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | 14190-250 | 此处列出的目录编号适用于每箱 10 瓶，每瓶 500 mL 的包装。 |
| Durapore 膜滤器，0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| 落射荧光或共聚焦显微镜 | 多家供应商 | 用于观察微凝胶和颗粒状水凝胶 | |
| Eppendorf 带卡扣盖的微量离心安全锁管 | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 挤出式打印机 | 定制设备 | 可使用其他挤出式打印机，例如市售的 BIOX。 | |
| 滤器接头 | Fisher Scientific | 05-888-107 | 此处列出的目录编号适用于多种尺寸的套装。提供多种规格（05-888-XXX）。 |
| 抽滤瓶 | 多家供应商 | ||
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖（2 MDa） | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| 玻璃显微镜载玻片 | 多家供应商 | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | "分析颗粒" 信息链接：https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| 笔记本电脑 | 多家供应商 | ||
| 鲁尔锁扣头帽 | Integrated Dispensing Solutions | 9991329 | |
| 用于舀取的金属刮刀 | 多家供应商 | ||
| 微量离心机 | 多家供应商 | 转速可达 18,000 × g | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 可使用其他程序，例如 Google Sheets。 | |
| OmniCure S2000 点式紫外光固化系统 | Excelitas Technologies | S2000 | 如需要，可使用不同的光照系统来制备块状水凝胶。 |
| 带固定穿孔板的瓷质布氏漏斗 | Fisher Scientific | FB966C | 此处列出的目录编号适用于直径为 56 mm 的穿孔板。提供多种规格。 |
| 辐射计 | 多家供应商 | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D 打印软件 | |
| 螺杆式挤出打印机 | 多家供应商 | 本研究使用了经过定制改装的 3D FDM 打印机（Velleman K8200）。存在多种替代方案。 | |
| Solidworks/CAD 软件 | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | 可使用其他程序，例如 Blender 或 TinkerCAD。 | |
| 连接抽滤瓶与真空管线的管路 | 多家供应商 | ||
| 紫外光防护眼镜（即安全护目镜） | 多家供应商 |
参考文献
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 10....
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