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用于无细胞重组的重组Septin复合物的纯化与质量控制

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DOI：

10.3791/63871

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2022年6月23日

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1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Institut Curie, Université PSL, Sorbonne Université

本文内容

摘要

体外重建细胞骨架蛋白是理解这些蛋白基本功能特性的关键工具。本文介绍了一种纯化重组septin复合物并评估其质量的实验方案，septin复合物在细胞分裂和迁移中发挥核心作用。

摘要

Septins 是一组保守的真核生物 GTP 结合蛋白家族，能够通过异源寡聚复合物形成细胞骨架丝状结构及更高阶的结构。它们与其他细胞骨架组分及细胞膜相互作用，参与细胞迁移和细胞分裂等重要细胞功能。由于 Septins 具有复杂的多种相互作用、数量众多的 Septin 基因（人类中有 13 个），以及能够以不同亚基组成形成异源寡聚复合物的能力，无细胞重建成为理解 Septin 生物学基础的关键策略。本文首先描述了一种利用两步亲和层析方法纯化异源寡聚形式重组 Septins 的技术。接着，详细介绍了用于检测 Septin 复合物纯度和完整性的质量控制流程。该流程结合了天然和变性凝胶电泳、负染电子显微镜以及干涉散射显微镜技术。最后，阐述了利用负染电子显微镜和荧光显微镜检测 Septin 复合物聚合能力的操作步骤。结果表明，可以成功制备高质量的人源 Septin 六聚体和八聚体，其中包含 Septin_9 的不同亚型，以及果蝇（Drosophila）Septin 六聚体。

引言

细胞骨架传统上被描述为由微丝、微管和中间纤维组成的三组分系统1，但近年来，septin 已被公认为细胞骨架的第四种组分1。Septin 是一类在真核生物中保守的 GTP 结合蛋白家族2。Septin 参与多种细胞功能，包括细胞分裂3、细胞间黏附4、细胞运动5、形态发生6、细胞感染7以及细胞极性的建立与维持8。尽管 septin 具有重要功能，但其在这些过程中所起作用的机制仍不清楚。

根据蛋白质序列的相似性，septin 蛋白家族被划分为若干亚组（依据分类方法不同，分为四个或七个亚组）2。不同亚家族的成员可形成回文结构的异源寡聚复合物，这些复合物是丝状结构的基本组成单元，并进一步组装成更高级的结构，如束状、环状和网状结构1,9,10,11,12。由于存在不同的剪接变体，分子复杂性进一步增加，例如人类 SEPT9，已有研究证实其不同剪接变体具有特定功能13,14,15。此外，异源寡聚体的长度因物种和细胞类型而异。例如，Caenorhabditis elegans 的 septin 形成四聚体16，Drosophila melanogaster 的 septin 形成六聚体17（图 1A），Saccharomyces cerevisiae 的 septin 形成八聚体18，而人类 septin 则可形成六聚体和八聚体19（图 1A）。同一亚家族中的 septin 亚型、剪接变体以及翻译后修饰的 septin 在复合物中可能相互替代，且不同大小的异源寡聚体可在细胞中共存或单独存在，这些因素使得解析不同异源寡聚复合物的细胞功能变得困难12。

septin的另一个有趣特性是其能够与细胞内的多种结合伴侣相互作用。在间期和细胞分裂过程中，septin可结合质膜以及膜性细胞器20,21,22。在分裂细胞中，septin在胞质分裂期间与anillin23,24,25以及肌动蛋白和肌球蛋白协同作用26,27。在胞质分裂的晚期阶段，septin似乎可调控运输所需的内体分选复合物（ESCRT）系统，从而参与中体的断离过程28。此外，也有证据表明，在间期细胞中，septin定位于肌动蛋白皮层和肌动蛋白应力纤维上29,30,31。在特定类型的细胞中，septin还可结合并调控微管细胞骨架32,33。

上述所有特性使得 septin 成为一个非常有趣但同时也具有挑战性的蛋白质体系。septin 亚基数量众多（人类有 13 个基因，不包括剪接变体2），且同一亚家族内的亚基可能相互替代，形成不同大小的异源寡聚体，这使得通过基因操作来推断特定 septin 的细胞功能变得十分困难。此外，septin 存在多种相互作用，因此解释常用研究工具（如靶向细胞骨架或膜组分的药物34）所产生的效应也极具挑战性。

克服这一状况的方法是将细胞研究与补充实验相结合 体外 （无细胞）重组肌动蛋白结合蛋白 septin 体外 重组使得能够分离出具有特定亚基组成和长度的单一类型 Septin 异源寡聚体18,35,36,37该复合物随后可在受控环境中进行研究，既可单独研究以揭示 septins 的基本结构和理化性质38,39,40，或与所需的伙伴分子（如模型生物膜）结合使用11,41,42，肌动蛋白丝10,27或微管32,36 以解析其相互作用的本质。

因此，一种能够高效纯化不同 Septin 复合物的可靠方法对 Septin 研究至关重要。然而，即使使用相同的实验方案，不同的纯化过程也可能获得在活性/功能甚至完整性上存在差异的蛋白质。对于酶等 commercially available 蛋白质，其功能性和酶活性均经过严格验证43。对 Septin 等细胞骨架或结构蛋白实施严谨的质量控制可能具有挑战性，但这是确保不同实验室间实验结果具有可比性的关键。

本文介绍了一种在大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中通过同时表达含有单顺反子或双顺反子结构的两个载体（表1），以纯化高质量异源寡聚体形式重组septin蛋白的可靠方法。该方法采用两步亲和层析策略，用于捕获同时包含his6标签septin和Strep-II标签septin的septin异源寡聚体（图1B，C）。此方案最初由Iv等人10报道，已被用于纯化果蝇（Drosophila）septin六聚体11,27,35、人源septin六聚体10，以及多种包含不同天然（亚型1、3和5）10,32或突变型SEPT9亚型32的人源septin八聚体。此外，本文还描述了一系列用于评估纯化后septin质量的技术。首先，通过变性电泳和透射电子显微镜（TEM）检测septin亚基的完整性及正确的化学计量比。随后，利用天然电泳和基于干涉散射显微技术（iSCAT）的质量光度法，检测是否存在具有正确分子质量的异源寡聚体，并检查是否存在提示复合物不稳定的单体或较小寡聚体。最后一步是通过荧光显微镜和TEM评估septin的聚合活性。

使用 HisTrap 和 StrepTrap 进行蛋白质纯化的流程；蛋白质结合与洗脱示意图。
图 1：纯化策略。（A）人类（左）和果蝇（Drosophila，右）细胞中存在的 septin 异源寡聚体示意图。数字表示来自指定组的 septin 亚基，P 表示 Peanut。人类 SEPT9 可为其任意同工型。septin 亚基具有不对称形状，并通过两种不同的界面纵向相连：NC:NC 界面和 G:G 界面，在图中人类六聚体上方分别以 NC 和 G 表示。（B,C）两步层析策略的示意图，其中（B）为人类 septin 六聚体，（C）为八聚体。H 表示 his 标签，S 表示 Strep-II 标签。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 分离纯化异源寡聚体肌动蛋白样蛋白

  1. 细菌细胞的共转化与表达载体的使用
    1. 选择一种 pnEA 和一种 pnCS 质粒44的组合用于表达。根据目标 septin 异源寡聚体的亚基组成10,35以及是否需要荧光标记来选择合适的组合。
      注：此处使用 C 末端标记的单体超折叠绿色荧光蛋白（msfGFP）标记的 SEPT2（用于人源 septin）或 msfGFP 或单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）标记的 DSep2（用于Drosophila septin）（表 1）。
    2. 将每种质粒各 1 μL（约 1 ng/μL）加入 100 μL 感受态 BL21 Escherichia coli 细胞中，冰上孵育 20 分钟。
    3. 将细胞置于 42 °C 水浴中 40 秒，然后立即转移到冰上孵育 3 分钟。
    4. 向细胞悬液中加入 0.9 mL 溶菌肉汤（LB）培养基，37 °C 培养 1 小时。取 100 μL 细胞涂布于含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 100 μg/mL 链霉素的温热 LB-琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
  2. 细菌预培养
    1. 在 250 mL 锥形瓶中加入 100 mL 含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 100 μg/mL 链霉素的丰富培养基（TB）或 LB 培养基。
    2. 用无菌接种环从 LB-琼脂平板上挑取单个菌落，并转移至步骤 1.2.1 中的新鲜培养基中。
    3. 在 37 °C 摇床培养箱中孵育，过夜或至少 6 小时。
      注：可通过将细菌悬液与甘油按 1:1 混合制备该培养物的甘油保存液，并于 −80 °C 保存。此保存液可用于步骤 1.2.2，替代新鲜转化的菌落。
  3. 细菌培养与蛋白表达诱导
    1. 将 100 mL 已培养的菌液转移至 5 L 含 50 μg/mL 氨苄青霉素和 50 μg/mL 链霉素的 TB 或 LB 培养基中。
    2. 在摇床培养箱中 37 °C 培养，直至其在 600 nm 波长下的光密度（OD）达到未标记 septin 的 2–3 范围，或 msfGFP/mEGFP 标记 septin 的 0.6–0.8 范围，随后加入终浓度为 0.5 mM 的 IPTG 以诱导蛋白表达。标记 septin 的较低 OD 值是为了避免在后续较长表达时间内进入死亡期（详见下一步）。
    3. 表达未标记 septin 异源寡聚体的细胞在 37 °C 继续孵育 3 小时；表达 msfGFP 标记异源寡聚体的细胞则在 17 °C 过夜孵育。
      注：未标记复合物采用较短表达时间，得益于更丰富的 TB 培养基，可防止蛋白降解；而标记复合物采用较长表达时间并结合较低温度，以确保 msfGFP 标签的正确折叠。
  4. 细菌裂解与裂解液澄清
    注：从本步骤开始，在整个纯化过程中，始终将含蛋白的溶液置于冰上或 4 °C 环境中，以防止蛋白发生蛋白水解降解或活性丧失。
    1. 在 4 °C 条件下以 4,000 × g 离心 20 分钟收集培养的细胞，弃去上清液。
      1. 可选：在此步骤中将沉淀快速冷冻，并于 −80 °C 保存最多 6 个月。若选择此方式，继续操作前需在冰上充分解冻沉淀。
    2. 将沉淀溶解于 100 mL 裂解缓冲液（表 2）中并裂解细胞。从以下两种方法中任选其一：
      1. 使用探头式超声仪进行超声处理，共 7 个循环，每个循环 30 秒开启、59 秒关闭，振幅设为 30%（注意：参数设置依赖于具体超声仪型号）。
      2. 使用法国压菌器（French press）至少压碎细胞 3 次。
    3. 在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟澄清细胞裂解液，保留上清液。建议在此离心过程中同步开始步骤 1.5.1。
    4. 可选：按照第 2 节所述方法取样进行变性电泳分析。
  5. His 标签蛋白的亲和层析
    注：本步骤利用镍柱获得含人源 SEPT2 或 Drosophila Sep1 的复合物（图 1B）。
    1. 使用 septin 缓冲液（表 2）对预装镍-Sepharose 高性能层析柱进行平衡。
    2. 以 1 mL/min 流速将澄清后的上清液上样至层析柱，并用至少三倍柱体积的 septin 缓冲液洗涤结合的蛋白。
    3. 以 1 mL/min 流速用 50% HisTrap 洗脱缓冲液（表 2）洗脱 septin 复合物，同时收集 0.5 mL 的组分，使咪唑终浓度达到 250 mM。
    4. 根据快速蛋白液相色谱（FPLC）系统在线监测的洗脱液在 280 nm 处的光吸收值，或纯化后使用微量分光光度计检测结果，挑选含有 septin 复合物的组分。
      注：咪唑在 280 nm 处有光吸收，这可能解释了为何在 septin 洗脱后蛋白峰未能恢复至零吸收（图 2A）。
  6. Strep-II 标签蛋白的亲和层析
    注：本步骤利用 Strep-Tactin 柱获得含人源 SEPT7（六聚体）、人源 SEPT9（八聚体）或 Drosophila peanut 的复合物（图 1B）。该层析柱基于改良的生物素-链霉亲和素系统：蛋白被修饰的生物素（Strep-II 标签）标记，而层析柱含有工程化的链霉亲和素（Strep-Tactin）。尽管源自生物素-链霉亲和素系统，但 Strep-Tactin-Strep-II 标签系统与生物素-链霉亲和素系统之间无交叉干扰。该系统的设计旨在避免在使用生物素和链霉亲和素的重组实验中产生干扰。
    1. 使用 septin 缓冲液（表 2）对预装 StrepTactin Sepharose 高性能层析柱进行平衡。以 1 mL/min 流速将来自镍柱的含 septin 组分上样，并用至少三倍柱体积的 septin 缓冲液洗涤结合的蛋白。
    2. 以 1 mL/min 流速用 100% StrepTrap 洗脱缓冲液（表 2）洗脱 septin 复合物，同时收集 0.5 mL 的组分，使脱硫生物素（desthiobiotin）终浓度达到 2.5 mM。
      注：StrepTrap 洗脱缓冲液中的脱硫生物素必须新鲜配制。
    3. 根据 FPLC 系统在线监测的洗脱液在 280 nm 处的光吸收值，或纯化后使用微量分光光度计检测结果，挑选含有 septin 复合物的组分。
      注：通常在此时对柱洗涤液和 septin 组分取样进行变性电泳分析。两种层析柱的顺序可互换而不影响结果，即步骤 1.4 得到的澄清裂解液可先进行 Strep-Tactin 亲和层析，再进行镍亲和层析。
  7. 透析与保存
    1. 为从最终保存液中去除脱硫生物素，将 septin 复合物在 4 °C 条件下使用 30 kDa 截留分子量（MWCO）透析膜，按约 1:300 的样品与缓冲液体积比，对添加了 1 mM DTT 的 septin 缓冲液（表 2）进行透析，透析过夜或至少 4 小时。
    2. 可选：使用 30 kDa MWCO 离心浓缩柱将 septin 浓缩至所需浓度。目标浓度为 5–7 μM，该浓度通过测定溶液在 280 nm 处的光吸收值，并结合 ProtParam 计算的理论消光系数确定（表 3）。
    3. 将蛋白复合物分装为所需体积的等份，快速冷冻后于 −80 °C 保存。
      注：建议蛋白保存时间不超过 6 个月。此外，若蛋白保存时间超过推荐期限，建议定期进行质量控制实验。

2. Septin 异源寡聚体纯度与完整性的质量控制

注意：异源寡聚体质量控制包含一系列生化与成像技术，可用于检测溶液中存在秋蛋白复合物的质量与完整性。

  1. 通过变性电泳检测 septin 异源寡聚体是否由正确组分形成
    1. 混合10 μ所选组分的 L 与 10 μL 2× SDS上样缓冲液，上样至预制的4%–15% TGX凝胶中，并用Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液充满电泳系统。
    2. 以200 V电压电泳35分钟，然后染色凝胶（材料表）以可视化结果。各个septin蛋白及septin异源寡聚复合物的分子量可参见 表3.
    3. 在反相对比度图像中，测量每条含有纯化 septin 的泳道内各条带的相对强度。通过计算每个条带周围等尺寸矩形区域的平均强度，以及同一条带区域内无条带的等尺寸矩形区域的平均强度来实现。然后，将每个条带的强度除以无条带区域的强度，对数值进行归一化处理。
      注意：如果信号强度已饱和（例如，在对比度反转的8位图像中数值为255），则跳过该泳道。
  2. 集成平均的天然尺寸分布 通过 天然电泳
    1. 提前一天准备800 mL阳极缓冲液和200 mL浅蓝色阴极缓冲液，并将其储存在冰箱中。配制阳极缓冲液时，将40 mL 20x电泳缓冲液用760 mL I级去离子水（I-water）稀释。配制浅蓝色阴极缓冲液时，将10 mL 20x电泳缓冲液和1 mL 20x阴极添加剂用189 mL I-water稀释。电泳缓冲液和阴极添加剂随试剂盒提供（材料表).
    2. 准备 10 μ将约 500 ng 的 septin 与所需量的上样缓冲液（2.5）混合，制备样品的 L μ此处为 L，由于使用了 4x 上样缓冲液；参见 材料表) 并加入足够的去离子水使总体积达到 10 μL.
    3. 将样品上样至凝胶，并用冰冻的阳极和阴极缓冲液填充系统。
    4. 以不因电流降低而停止的电源在150 V电压下电泳约115分钟，并对凝胶进行染色（材料表）以可视化结果。基于序列计算得到的单个蛋白质和复合物的分子量可参见 表3.
  3. 通过干涉散射显微术的光度质量测定法进行单分子质量分布分析
    1. 用 #1.5 盖玻片，在超声波清洗器中依次用去离子水超声清洗 5 分钟，异丙醇中超声清洗 5 分钟，最后再用去离子水超声清洗 5 分钟。
    2. 用氮气流轻轻吹干两张载玻片，并放置一个 7 μ在一张载玻片中央滴加一滴 0.01% 多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液。然后将另一张载玻片的中心置于 PLL 液滴上，使两张载玻片呈正交方向放置，以便后续分离。孵育 30 秒。
      1. 用去离子水浸洗1次，并直接用去离子水流冲洗2次。然后，用氮气吹干两张载玻片。这些载玻片可在室温干燥条件下保存约6周。
        注意：标记经 PLL 处理的载玻片一侧 以正确开展实验。
    3. 实验前，裁取一块 2 × 2、3 × 2 或 3 × 3 的垫片（分别可形成每片载玻片上 4、6 或 9 个成像腔室），将其粘贴至经 PLL 处理的玻璃载玻片区域，注意避免载玻片和垫片接触任何不洁表面。将载玻片置于轻型擦拭纸上，用移液器吸头按压垫片，使其在保护塑料膜仍保留于垫片上的情况下牢固粘附。
    4. 预热的septin缓冲液（表2）至室温，并在手中解冻蛋白质（之后将其置于冰上）。
      注意：iSCAT 会显示某些去垢剂和小分子的信号，这些信号与蛋白质信号相似45DTT 是这类小分子之一，因此本实验不使用 DTT。储存的 Septin 中仅带有微量的 DTT。
    5. 将带有垫圈的载玻片放置于含有19的商用质量光度系统中 μ使用 septin 缓冲液，并利用自动对焦功能调整显微镜。根据制造商的说明，检查所获得的焦距是否正确。此处使用该系统配备的标准 100 倍物镜。
    6. 创建或加载一个项目文件夹以存储数据 文件 > 新建项目或文件 > 加载项目.
    7. 移液器 1 μ样品的L加到19 μ使用 septin 缓冲液液滴（步骤 2.3.5）进行聚焦和混合，操作时避免触碰任何物体以尽量减少载玻片的移动。随后，单击以录制一段包含 6,000 帧的视频 记录.
      1. 为获得准确分析结果，需记录以下样品：septin 缓冲液、用于校准信号与质量比的蛋白质质量标准品（若近期已完成校准且环境条件未发生变化，则可省略此样品），以及用不含 DTT 的 septin 缓冲液稀释的 250 nM septin 复合物（终浓度约为 12.5 nM）。
    8. 使用制造商的软件分析视频，以获得蛋白质质量分布。按如下方式检查数据质量。
      1. 如果不同大小的septin异源寡聚体峰重叠过于严重或检测到的事件过多（>3,500 个事件对应一段 6,000 帧的视频，其常规视场为 128 像素 × 34 像素，跨度为 10.8 μm × 2.9 μm），降低最终的septin浓度并再次测量。
      2. 如果测得的单分子计数不足（对于常规视野下的6,000帧视频，至少需要2,500–3,500个计数），则提高septin浓度并重新测量。
  4. 通过负染色透射电子显微镜直接成像观察隔蛋白复合物
    1. 将样品用 septin 缓冲液稀释至浓度约为 50 nM，并配制染色液（2% 甲酸铀或乙酸铀的重水溶液）。
      注意：甲酸铀酰必须新鲜配制。
    2. 移液器 4 μ将稀释后的 Septins 加到放电处理的电子显微镜载网上，孵育 30 秒。
    3. 用滤纸吸去大部分蛋白溶液，然后用 septin 缓冲液洗涤载网 2 次，再用 I-water 洗涤 1 次，以去除未牢固吸附的 septin。
    4. 用2%醋酸铀或甲酸铀的I型水溶液染色1分钟，用滤纸吸去染色液，将载网晾置数分钟使其自然干燥。
    5. 使用正确校准的透射电子显微镜对载网进行扫描，寻找染色增强的区域，并在这些选定区域内采集约100张图像。
    6. 以至少 50,000 倍的放大倍数采集图像，以获得约 2 nm 的像素尺寸 Å/像素，且欠焦量在−1范围内变化 μm 至 −2 μm. 使用200 kV的加速电压。优先采用自动化程序采集数据，具体操作取决于可用的采集软件。
    7. 使用专用软件进行二维图像处理
      1. 使用专用软件至少截取 2,000 个颗粒46.
      2. 反复进行二维比对与分类，直至分类结果不再进一步改善为止。首次比对与分类步骤应采用无参照方法，以避免分类过程中引入任何偏差。
      3. 使用首次无参考分类获得的平均结果作为新的参考，进行额外一轮分类。重复此过程直至不再有进一步改善。确保每一类基于50至100个选取的颗粒，且各个亚基清晰可见。可使用不同的软件工具（Spider、Eman 或 Relion）。46,47,48.

3. 通过聚合分析进行Septin功能质量控制

注意：功能质量控制包含一系列成像技术，可用于检测已聚合的 septin 复合物。以下将未标记的 septin 称为“暗”septin，用于聚合未标记 septin 的缓冲液称为“暗”septin 聚合缓冲液（SPB）。

  1. 通过荧光显微镜进行 Septin 束成像
    1. 制备 5x fluoSPB（表 2）以及含有 90% 暗标记 Septin 和 10% msfGFP-Septin 的 Septin 混合液，其浓度为 Septin 缓冲液 + 1 mM DTT 中目标终浓度的六倍。该检测的典型浓度为 300 nM，因此该混合液的浓度为 1,800 nM。
    2. 按以下特定顺序混合：I-水（加至最终所需体积）、20% 5xfluoSPB（终稀释倍数为 1:5）、0.05 μM PCD 和 16.67% Septin 混合液（终稀释倍数为 1:6），以启动 Septin 聚合。对于 10 μL 体系，混合 6.23 μL I-水、2 μL 5xfluoSPB、0.1 μL PCD（储存浓度为 5 μM）和 1.67 μL Septin 混合液。将该混合物在室温下孵育至少 30 分钟。
    3. 将样品加入经 fluoSPB（表 2）清洗过的成像室，并对 Septin 束进行成像。如先前研究所述10,32，PLL-PEG 钝化的流动通道适用于本实验。
  2. 通过负染透射电子显微镜进行 Septin 束成像
    1. 制备 5x darkSPB（表 2）以及含有 100% 暗标记 Septin 的 Septin 混合液，其浓度为 Septin 缓冲液 + 1 mM DTT 中目标终浓度的六倍。该检测的典型浓度为 300 nM，因此该混合液的浓度为 1,800 nM。
    2. 按以下特定顺序混合：I-水（加至最终所需体积）、20% 5x darkSPB 和 16.67% Septin 混合液，以启动 Septin 复合物的聚合。对于 5 μL 体系，混合 3.16 μL I-水、1 μL 5x darkSPB 和 0.83 μL Septin 混合液。将该混合物在室温下孵育至少 30 分钟。
    3. 取 3–5 μL 样品加入经电离放电处理的电子显微镜载网上，孵育 1 分钟。然后通过滤纸吸去液体并滴加 darkSPB（表 2）缓冲液，用 darkSPB 洗涤 2 次，再用 I-水洗涤 1 次，随后加入 2% 醋酸铀溶液孵育约 30 秒，吸去染液，并将样品在空气中干燥数分钟。
    4. 在 120 kV 电压下，以 5,000× 至 60,000× 的放大倍数和 1–2 μm 的欠焦量对 Septin 束进行成像。

结果

如方案中所述，5 L的 E. coli 共转化了两种表达septin质粒的细胞进行培养，并通过添加IPTG诱导septin的表达。3小时后，离心收集细胞，重悬于裂解缓冲液中，经超声破碎裂解。裂解液随后通过离心澄清，将澄清的上清液上样至HisTrap柱（图2A）。第一次纯化后，收集含septin的组分并上样至StrepTrap柱（图2B）。这通常可获得约 3-5 mL 的 ~1 μM septin复合物。在合并含septin的组分之前，可采用变性凝胶电泳检测septin亚基的完整性，以及形成该复合物的不同septin亚基之间的等摩尔化学计量比。图3A）。如果凝胶显示出对应于分子量的强度相似的条带（表3) 各个septin亚基后，可继续进行该实验方案。若未获得，则建议重新开始该实验方案。以包含SEPT9_i1的人源septin八聚体为例， 图3A 清晰显示对应于SEPT9_i1、SEPT6、SEPT7和SEPT2的条带（从上至下顺序），其强度相似；标准化强度的99%置信区间分别为：SEPT2为1.128 ± 0.048，SEPT6为1.092 ± 0.034，SEPT7为1.108 ± 0.040，SEPT9为1.067 ± 0.029。若SEPT2标记了msfGFP，其条带将上移至紧邻SEPT9_i1下方。根据所使用的电泳系统以及SEPT7是否带有C末端TEV-Strep标签（该标签会使SEPT7迁移速度慢于无标签形式），由于SEPT7与SEPT6分子量相近，其条带有时会发生合并。下一步是合并各组分，并在含DTT的septin缓冲液中进行透析。透析后，若浓度过低（<2 μM）或实验需要更高浓度时，可按照方案中所述增加浓缩步骤。低于 1 μM 通常表明 Septin 蛋白的功能质量较差。最终 Septin 复合物浓度在 3.5 μM 和 7 μM 对大多数情况效果良好 体外 检测。当浓缩后的体积达到0.5–1 mL时，通常可获得这些浓度。

HisTrap 和 StrepTrap 层析图谱示意图；蛋白质纯化，洗脱的 septin 复合物。
图 2：纯化人源暗态 septin 八聚体_9i1 的层析图谱示例。（A）HisTrap 柱层析图谱。在 septin 洗脱峰之后，吸光度未回到零，可能是由于缓冲液中含有咪唑。收集的组分从洗脱峰起始处开始，至吸光度在约 250 mL 处趋于稳定为止。（B）StrepTrap 柱层析图谱。收集的组分从洗脱峰起始处开始，至吸光度在 50 mL 处恢复至约 0 为止。请点击此处查看该图的放大版本。

为了继续进行质量控制，按照方案所述进行了天然电泳（图3B）。在凝胶中，可观察到一条对应于完整异源寡聚体的主条带，通常还有一条对应于二聚体的次要条带。人源六聚体位于242 kDa标记条带稍上方，而八聚体则位于480 kDa条带之上，均高于其计算的分子质量。这些条带的位置已通过真核细胞提取物的蛋白质印迹分析得到验证32。使用msfGFP标记可使每个SEPT2蛋白与一个msfGFP蛋白偶联，导致每个肌动蛋白相关蛋白（septin）复合物的分子量增加53.4 kDa（即每个msfGFP分子增加26.7 kDa）。然而，在天然电泳凝胶上，msfGFP标记的复合物表观分子量与未标记复合物无法区分。

验证 septin 复合物是否完整的另一种互补技术是通过 iSCAT 显微镜进行的质量光度测定法。iSCAT 通过干涉效应监测分子落在玻璃载片上时产生的光散射信号，其中参考光通常为激光在玻璃载片底部的反射光。随后采用背景扣除方法以增强颗粒的对比度。由于该校正作用，信号会呈现正值或负值，具体取决于颗粒是落在玻璃表面还是远离其表面49。所检测到的信号与蛋白质的分子量成正比50。因此，通过使用已知分子量标准品进行信号-质量校准，可确定样品蛋白质的分子量。图3C 展示了含 SEPT9_i1 的人源 septin 八聚体的一个示例。大多数检测到的单个颗粒（约50%）的分子量与完整八聚体（含 SEPT9_i1，423 kDa）的预期值相符（图3C）。此外还存在分子量介于150–300 kDa之间的颗粒，但未观察到明显峰，表明可能存在丰度较低的其他 septin 物种。类似地，对于带有 mEGFP 标签的Drosophila 六聚体，大多数检测到的单颗粒分子量与完整六聚体的预期值（361 kDa）一致（图3D）。在241 kDa处出现的另一个明显峰表明存在稳定的四聚体，其包含两个花生蛋白、一个 DSep1 和一个 mEGFP-DSep2。最后，人源和果蝇的 septin 复合物均在约80 kDa处出现一个峰，可能为单体与二聚体的混合物，也可能因痕量 DTT 或其他可聚集的小分子而被放大，从而在图谱正侧呈现峰信号45。

凝胶电泳、蛋白质质量分布、显微镜；septin纯化、质谱分析。
图3：寡聚体质量控制结果示例。 （A）变性凝胶电泳示例，显示从暗色人源septin八聚体_9i1纯化洗脱峰中不同组分的分离结果。（B）不同septin复合物的天然电泳示例。（C,D）12.5 nM septin复合物的质量光度测定直方图结果示例：（C）暗色人源septin八聚体_9i1 和（D）DSep1-msfGFP Drosophila septin六聚体。曲线为高斯拟合。（E）在septin缓冲液中25 nM暗色人源septin八聚体_9i1的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺 = 200 nm。（F）SEPT2-msfGFP人源septin八聚体_9i1的分类平均图像。msfGFP标签在两端表现为模糊的密度区域。比例尺 = 10 nm。图（E）和（F）版权属于The Company of Biologists，已获许可改编自Iv等人的研究10。请点击此处查看该图的放大版本。

由于天然凝胶电泳和iSCAT仅能提供群体平均信息，因此通过透射电子显微镜对单个septin寡聚体进行图像分类平均，以直接观察来验证复合物的完整性和纯度。在septin缓冲液中septin复合物的透射电镜图像中，可观察到长度为24 nm（六聚体）或32 nm（八聚体）的棒状结构。含有SEPT9_i1的人源septin八聚体示例如图3E所示。对这些寡聚体进行分类平均后，每个亚基均可被观察并计数，如带有msfGFP标签、含SEPT9_i1的人源八聚体在图3F中所示。若寡聚体带有荧光标记，则可在棒状结构末端观察到对应于SEPT2-msfGFP的额外密度区域（图3F）。

上述技术的结合证明，使用所述方案可以纯化具有正确化学计量比和高纯度的八聚体（或六聚体）。最后一步质量控制是检测 septin 复合物在聚合能力方面的功能。在低盐浓度条件下（<150 mM KCl，使用所述缓冲液9），如果 septin 未与其他蛋白质或带负电荷的脂膜共存，则会自组装成束状结构9。通过将 septin 保存在高盐浓度（300 mM KCl）的储存缓冲液中，可抑制其聚合。随后，将 septin 异源寡聚体以1:6的体积比稀释至相同成分但不含KCl的缓冲液中，使终浓度达到50 mM KCl。进行荧光成像时，该缓冲液需添加抗氧清除系统以防止光漂白，并加入闪烁抑制剂。在TIRF显微镜下，可在较浅的TIRF激发场（约100 nm；图4A、B）中观察到微小的蛋白质簇。在共聚焦显微镜下，则可见较大的丝状结构簇悬浮于溶液中较高位置（图4C）。最后，通过透射电子显微镜（TEM）可观察到较小的 septin 束状结构（图4D），对应于TIRF观察到的簇状结构，以及较大的束状结构（图4E），对应于共聚焦显微镜下观察到的结构。图4D、E的插图显示，这两类结构均由长而细的平行排列的丝状物组成，末端呈锥形。综合荧光成像与TEM图像结果表明，纯化的 septin 复合物能够聚合形成丝状结构，并进一步自组装成束状结构。

生物分子结构的电子显微镜观察；蛋白质纤维的形态；高分辨率插图。
图 4：聚合能力质量控制结果示例。 （A）在fluoSPB中，300 nM人源septin六聚体（10% msfGFP标记的六聚体）的全内反射荧光（TIRF）图像。（B）在fluoSPB中，含SEPT9_i1的300 nM人源septin八聚体（10% msfGFP标记的octamers9_i1）的TIRF图像。（C）在fluoSPB中，300 nM人源septin八聚体_9i3的Z轴堆栈（跨度约30 μm，步长0.5 μm）共聚焦显微镜最大强度投影图像。（A-C）比例尺 = 10 μm，反相灰度显示。（D,E）人源septin八聚体_9i1在darkSPB中形成的（D）较小和（E）较大束状结构的透射电子显微镜（TEM）图像示例。插图显示了束内可观察到平行排列的清晰纤维区域。比例尺 = 500 nm。图版（C-E）版权归The Company of Biologists所有，经许可改编自Iv等人的研究10。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：质粒列表。 本方案中用于纯化 septin 寡聚体的质粒。所有质粒均已存入 Addgene（第一列）。请点击此处下载该表格。

表2：缓冲液列表。 用于七聚体蛋白寡聚物纯化和质量控制的缓冲液组成。请点击此处下载该表格。

表3：分子量和消光系数。 基于复合物序列（假设为线性融合的septin亚基）、不同septin复合物以及可纯化的独特septin亚基（仅分子量）的序列，利用ProtParam计算得到的分子量（MW）和280 nm波长下的光学消光系数（ε）列表。所用质粒如表1所列。请点击此处下载该表格。

讨论

本文所述方法可实现对预先形成的 septin 异源寡聚体的高效纯化和质量控制。正确应用该方法时需考虑以下几个关键问题。在色谱分离的洗脱步骤中，应使用推荐或更低的流速，以尽量减少 septin 复合物的稀释。此外，为了在最终浓缩步骤中最大化蛋白回收率，应将浓缩柱以特定方向放置，避免溶液直接冲击滤膜（当仅一侧有滤膜时）。若溶液直接接触滤膜，蛋白会更牢固地吸附于其上，显著降低最终得率。还需注意的是，浓缩步骤并非总是必需的。通常仅收集色谱图中峰附近较窄范围内的组分，即可获得足够高的储备浓度（>3,000 nM），适用于多数重建实验（通常在 10–300 nM 范围内进行）。最后，在通过荧光显微镜检测 septin 复合物功能性的质量控制过程中，正确钝化显微镜载玻片表面至关重要，因为 septin 复合物会强烈吸附于玻璃表面。玻璃载玻片的钝化可通过 PLL-PEG 功能化处理，或通过形成中性（100% DOPC）支撑脂双层来实现11,32。

与Iv等人首次描述的原始纯化方案相比10，缓冲液组成有所调整（表2）。MgCl2的浓度从5 mM降低至2 mM，Tris-HCl的浓度和pH值分别从50 mM降至20 mM，pH从8.0降至7.4。这些调整旨在使缓冲条件适用于研究人源septin蛋白与脂双层、肌动蛋白丝以及微管之间的相互作用10,11,32。原因在于，作者在F缓冲液中构建了支撑性脂双层并诱导了肌动蛋白聚合，而F缓冲液的组成除含有ATP外，其余成分与darkSPB完全相同。与原始缓冲液相比，缓冲液的调整并未对纯化所得septin蛋白的质量或稳定性产生任何不利影响。

该纯化方法仍存在若干局限性。首先，不同纯化实验的产量（0.5–1 mL 的 2–5 μM septin 复合物）和功能质量可能存在差异，这可通过纯化后 septin 复合物形成束状结构的能力来评估。因此，持续执行本文所述的质量检测步骤至关重要。严格控制蛋白表达时间以及细菌培养物的光密度有助于减小产量差异。其次，该纯化流程无法区分三聚体与六聚体，或四聚体与八聚体（图1B）。然而，可通过质量控制实验证明，大多数 septin 复合物处于长链寡聚形式。若需要更窄的寡聚体尺寸分布，可在纯化方案的步骤1.6与步骤1.7之间加入尺寸排阻色谱法。但这一可选步骤会显著降低产量，除非确有必要，否则不建议采用。最后，一个更为根本性的局限性源于使用E. coli作为重组 septin 复合物的表达系统。该系统天然无法实现已在动物细胞中报道的翻译后修饰（PTMs），例如磷酸化、乙酰化和SUMO化6,51,52,53。这些翻译后修饰可通过在昆虫或人类细胞中实施类似的纯化策略加以引入。此外，本文仅讨论了 septin 蛋白自身的重组，但细胞研究表明，调控蛋白（如 Borg 家族蛋白54,55和 anillin24,25,56）可能对 septin 的组装与功能产生显著但尚未充分理解的影响，因此最终有必要将其纳入体外（in vitro）研究中。已有文献报道 Borg 蛋白和 anillin 的纯化方案54,57。

此处报道的 Septin 纯化方案提供了一种标准化方法，用于以正确的亚基化学计量比纯化 Septin 寡聚体形式，相较于早期许多方法具有重要意义的改进 体外 依赖单一septin亚基的研究。尽管在某些特定情况下，某些septin能够以单个亚基的形式发挥作用2目前的文献强烈表明，在动物细胞中，septin 主要以复合物形式发挥功能9,58因此，可采用预先形成的异源寡聚体，例如本文及其他研究中所述的异源寡聚体10,11,18,32,35,36,37，对于通过研究Septins的结构和生物物理特性而言至关重要 体外 通过重建来解析其在细胞中的功能。此外，Septin 是一类能够自我组装的蛋白质，具有多种相互作用伙伴，包括细胞膜和细胞骨架，因此在自下而上的合成生物学中具有重要研究价值。59,60,61 以及蛋白质诱导的膜生物物理特性变化（如曲率）的研究42,62,63.

披露

作者声明不存在竞争性或经济利益冲突。

致谢

感谢 Cecilia de Agrela Pinto、Tomás de Garay 和 Katharina Häußermann 在质量光度法（iSCAT）实验中的协助；感谢 Arjen Jakobi 和 Wiel Evers 在透射电子显微镜（TEM）方面的帮助；感谢 Lucia Baldauf 在全内反射荧光显微镜（TIRF）方面的协助；感谢 Pascal Verdier-Pinard 在天然电泳实验方面的建议； 感谢 Agata Szuba 和 Marjolein Vinkenoog 在建立果蝇 septin 纯化流程中的帮助，以及感谢法国居里研究所细胞与组织成像平台（PICT-IBiSA）的支持，该平台是法国国家科研基础设施法国生物成像（France-BioImaging，ANR10-INBS-04）的成员。 本研究获得了荷兰科学研究组织（NWO/OCW）通过“合成细胞构建”（BaSyC-Building a Synthetic Cell）重力计划（编号 024.003.019）的资助， 以及法国国家科研署（ANR）的资助（项目编号 ANR-17-CE13-0014：“SEPTIMORF”；ANR-13-JSV8-0002-01：“SEPTIME”；和 ANR-20-CE11-0014-01：“SEPTSCORT”）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
488nm 激光组合器 iLAS2GatacaTIRF 显微镜
488nm Sapphire 激光线Coherent共聚焦显微镜
4k X 4k F416 CMOS 相机TVIPS用于 JEM-1400plus
4x 非变性 PAGE 样品缓冲液Thermo Fisher ScientificBN2003
6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（TROLOX）Sigma-Aldrich238813用于防止荧光闪烁
AKTA pure 25 M1GE Healthcare1680311
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9518-25G
碳膜 Type-B，300 目 EM 载网Ted Pella01813-F
碳膜 Type-B，300 目 EM 载网Electron Microscopy SciencesCF300-Cu
盖玻片 #1.5HThorlabsCG15KH
CSU-X1-M1 共聚焦单元Yokogawa共聚焦显微镜
脱硫生物素Sigma-AldrichD1411-1G
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-AldrichD9779
脱氧核糖核酸酶（DNAse）Sigma-Aldrich10104159001
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
Eclipse Ti2-ENikon Instruments共聚焦显微镜
无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物Roche481761
HisTrap HP，5 mLGE Healthcare29-0588-3
iLAS2 方位角 TIRF 照明系统 GatacaTIRF 显微镜
咪唑Sigma-Aldrich1202-1KG
InstantBlue 蛋白凝胶染色剂Westburg Life SciencesEP ab119211
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Thermo Fisher Scientific10849040
iXon Ultra 888 EMCCD 相机Andor共聚焦显微镜
iXon Ultra 897 EM-CCD AndorTIRF 显微镜
JEM-1400plusJOEL中国台湾代尔夫特理工大学透射电子显微镜
kappa-酪蛋白 Sigma-AldrichC0406
LB 肉汤Sigma-AldrichL3022-6X1KG
溶菌酶Sigma-Aldrich62971-10G-F
氯化镁Sigma-AldrichM8266-100G
硫酸镁Sigma-Aldrich746452-1KG
甲基纤维素Sigma-Aldrich8074844
MilliQ 系统（Integral 10）Merck-Millipore纯水分配器
Mini Protean TGX 凝胶BIORAD4561086
NativeMark 未染色蛋白标准品InvitrogenLC0725用于 iSCAT 和非变性凝胶
NativePAGE 4-16% 凝胶Thermo Fisher ScientificBN1002BOX
NativePAGE 运行缓冲液试剂盒Thermo Fisher ScientificBN2007
Nikon Ti2-E Nikon InstrumentsTIRF 显微镜
1 号 Menzel 盖玻片Thermo Fisher Scientific11961988
Parafilm Sigma-AldrichP7668
Plan Apo ×100/1.45 NA 油浸物镜Nikon Instruments共聚焦显微镜
PMSFSigma-Aldrich10837091001
聚(L-赖氨酸)-接枝-生物素化聚乙二醇（PLL-PEG）SuSoSCHF560.00
0.01% 聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichP4832用于 iSCAT 玻片
氯化钾Sigma-AldrichP9541-1KG
非变性凝胶电泳电源CONSORTS/N 71638
POWERPAC UNIVERSALBIORAD042BR31206
原儿茶酸 3,4-双加氧酶（PCD）Sigma-AldrichP8279-25UN除氧系统 - 酶
原儿茶酸（PCA）Sigma-Aldrich03930590-50MG除氧系统 - 试剂
Q500 超声破碎仪QsonicaQ500-110
Quemesa 相机Olympus用于 Tecnai Spirit
Refeyn OneMPRefeyn
样品缓冲液，Laemmli 2x 浓缩液Sigma-AldrichS3401-10vl
硅胶垫圈Sigma-AldrichGBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer 透析盒，30k 截留分子量，3mLThermo Fisher Scientific66381
壮观霉素Sigma-AldrichPHR1441-1G
StrepTrap HP，1 mLGE Healthcare28-9075-46
Tecnai Spirit 显微镜Thermo Scientific, FEI居里研究所透射电子显微镜
优质肉汤Sigma-AldrichT0918-1KG
Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液BIORAD1610772
Tris-HClSigma-AldrichT5941-1KG
超声波清洗器BransonCPX2800H-E
Vivaspin 6，30,000 截留分子量 PESSartoriusVS0622

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