诱导眼表炎症和受累组织收集

摘要

眼表炎症会损害眼表组织并损害眼睛的重要功能。本协议描述了一种在睑板腺功能障碍（MGD）的小鼠模型中诱导眼部炎症和收集受损组织的方法。

摘要

眼表疾病包括一系列干扰角膜、结膜和相关眼表腺网络的功能和结构的疾病。睑板腺（MG）分泌脂质，形成覆盖层，防止泪膜水部分蒸发。中性粒细胞和细胞外DNA陷阱在过敏性眼病小鼠模型中填充MG和眼表。聚集的中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）形成由细胞外染色质组成的网状基质，可阻塞MG出口并调节MG功能障碍。本文提出了一种诱导眼表炎症和MG功能障碍的方法。详细描述了收集与眼表相关的器官的程序，例如角膜，结膜和眼睑。使用处理每个器官的既定技术，还显示了MG功能障碍的主要形态学和组织病理学特征。眼渗出物提供了评估眼表炎症状态的机会。这些程序能够在临床前水平上研究局部和全身抗炎干预。

引言

每眨眼一下，就会补充分散在角膜上的光滑泪膜。眼表上皮有助于泪膜在眼表的分布和正确定向。粘蛋白由角膜和结膜上皮细胞提供，以帮助定位泪膜的水部分，这些泪膜来自眼睛表面的泪腺。最后，MG分泌脂质，形成覆盖层，防止泪膜¹，^2，3的水性部分蒸发。以这种方式，所有眼器官的协调功能保护眼表免受病原体入侵或伤害，并支持水晶般清晰的视力，而没有任何疼痛或不适。

在健康的眼表，眼流分泌物或眼部风湿可清除灰尘、死去的上皮细胞、细菌、粘液和免疫细胞。聚集的中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）配制由细胞外染色质组成的网状基质，并将这些成分掺入眼风湿中。AggNETs通过促炎细胞因子和趋化因子的蛋白水解降解来解决炎症⁴。然而，当它们变得功能失调时，这些异常的 aggNET 会驱动疾病的发病机制，例如 COVID-19⁵、胆结石⁶ 和唾液石症⁷ 中的血管闭塞。同样，眼表上的aggNETs起着保护作用，有助于解决高度暴露表面的炎症⁸。眼表过度形成或缺乏 aggNET 都会损害泪膜稳定性和/或导致角膜伤口、瘙痒性结膜炎和干眼症。例如，MG的梗阻是干眼症的主要原因⁹。众所周知，AggNETs会堵塞MG导管的脂质分泌流并导致睑板腺功能障碍（MGD）。aggNETs对MG孔的充血导致缺乏脂肪液包裹眼表和逆行封堵液，导致腺体功能障碍和腺泡损伤。这种功能障碍会导致泪膜蒸发、眼睑边缘纤维化、眼睛发炎以及对 MG^10，11 的有害损害。

多年来，已经开发了几种动物模型来模仿人类MGD的病理过程。例如，1岁的C57BL / 6小鼠帮助研究了与年龄相关的对干眼病（DED）和MGD的影响，反映了50岁及以上患者的眼部疾病病理学¹²，^13，14。此外，兔子是研究药物干预效果的适当模型。因此，通过局部给予肾上腺素或全身引入13-顺式维甲酸（异维A酸）¹⁵，¹⁶，^17，18，19在兔中诱导MGD已有报道。

尽管这些动物模型足以确定导致MGD病理生理学的不同因素，但它们的使用受到限制。例如，与年龄相关的MGD的小鼠模型仅适用于破译老年人的元素，因此，兔子似乎是最适合研究眼表疾病的动物模型，因为它们能够研究多种病理生理机制。然而，由于缺乏全面的分析工具来检测眼表的蛋白质，并且由于兔基因组的许多部分没有注释，它们仅限于研究^20，21。

此外，这些用于研究干眼病发病机制的动物模型没有提供足够的细节来分析引发眼表炎症的疾病的免疫学臂。因此，由Reyes等人开发的MGD小鼠模型显示小鼠过敏性眼病与人类MGD之间存在关联，并强调了导致阻塞性MGD²¹的免疫病因。该模型将过敏性眼病与TH17反应相关联，TH17反应将中性粒细胞募集到结膜和眼睑，导致MGD和慢性眼部炎症²¹。在该小鼠模型中诱导MGD和眼部炎症是研究由持续免疫反应驱动的局部炎症发展过程中上游事件的宝贵工具²¹。目前的方案描述了伴有阻塞性MGD的眼表炎症。在该方法中，对小鼠进行免疫接种，并在2周后用免疫原在眼表上激发7天。此外，还描述了在急性炎症期间分离眼渗出物和相关眼器官的步骤以及角膜、结膜和眼睑的解剖。

方案

所有涉及动物的程序均根据动物福利机构指南进行，并经埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）动物福利委员会批准（许可证号:55.2.2-2532-2-1217）。本研究使用年龄为7-9周的雌性C57Bl / 6小鼠。从商业来源获得小鼠（见 材料表），并以12小时昼夜循环保存在特定的无病原体条件下。

1.诱导小鼠眼表炎症

1. 进行免疫接种的免疫原准备。
   1. 在免疫当天新鲜制备免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg / mL）和百日咳毒素（100 μg/ mL）混合在盐水中，并将佐剂氢氧化铝（40 mg / mL）（见 材料表）按1:1的比例混合。
      注意:在层流安全柜中进行百日咳毒素的打开、重建和免疫原制备。穿防护服，避免与皮肤接触。
   2. 将免疫原和佐剂混合物在室温下孵育 30 分钟，然后将 100 μL 加载到 1 mL 注射器中。
   3. 在非麻醉小鼠中腹膜内注射免疫原溶液。
      1. 轻轻握住鼠标的尾巴，同时抓住笼子网格。用拇指和食指牢牢握住背部和颈部区域的皮肤，将无名指和小指之间的尾巴和下肢固定在手掌上。
      2. 保持固定鼠标的头部朝下。
      3. 在下腹腔的右象限或左象限中注入100μL制备的免疫原溶液。
2. 免疫接种后 2 周进行眼表激发试验。
   1. 用异氟醚（2.5%）麻醉小鼠。
   2. 双眼每只眼睛涂抹 5 μL OVA （50 mg/mL） 或生理盐水 （0.9 % NaCl），等待滴剂被眼睛吸收。这需要~5分钟。
   3. 每天重复该过程 1 次，持续 7 天。
      注意:局部给药可以以相同的方式进行。

2.眼渗出物的收集

1. 通过在激发后立即向眼睛施用 50 μL 无菌盐水来恢复在挑战阶段形成的眼分泌物。
2. 为了获得单细胞悬浮液，用含有辅因子钙（5mM）的重组MNase（2 x 10⁶ 凝胶U / mL，参见 材料表）在37°C下处理收集的眼分泌物20分钟。
3. 在室温下以400× g 离心7分钟。
4. 分离上清液并根据制造商的说明使用多重ELISA测量细胞因子和趋化因子（参见 材料表）。
   注意:获得的上清液可用于蛋白质分析，沉淀可用于功能测定，例如免疫表型，吞噬作用，脱颗粒和基因表达。

3.眼表组织切除

1. 按照以下步骤解剖眼睑和眼球。
   1. 通过CO₂ 窒息和颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
   2. 将鼠标放在平坦的表面上。
   3. 用浸有70%乙醇的拭子对眼睛周围的眼眶区域进行消毒。
   4. 在耳朵和眶后窦之间，沿着鳞状骨上方的表面垂直切开一个切口，将切口沿上颌骨水平延伸至下眼睑下方，沿额骨在上眼睑上方水平延伸。这在眼睛周围形成一个切口（图1）。
   5. 使用弯曲的镊子小心地将解剖的组织固定在眼睛周围，然后将组织和眼球拉出。
   6. 将切除的器官放入无菌PBS中。
   7. 使用手术刀和体视显微镜下修剪切除的上眼睑周围多余的面部肌肉组织。
2. 按照以下步骤收集结膜。
   1. 将上眼睑放在立体显微镜下的干燥培养皿上。
   2. 使用细镊子和手术刀，非常轻柔地从眼睑内表面剥离白色粘液层。
3. 接下来，按照以下步骤解剖角膜。
   1. 将眼球放在干冰顶部的新干培养皿上3分钟。
   2. 将培养皿以稳定的位置放在工作台表面上。
   3. 用细而锋利的剪刀在角膜缘旁边的角膜边缘做一个小切口。
   4. 用手术刀在眼球周围延长切口，将巩膜与角膜分开。
   5. 通过大量用盐水冲洗，从角膜背面去除虹膜和晶状体的残留物。

4. 睑板腺（MG）梗阻的记录

1. 为了评估MG及其孔口，将切除的眼睑放在体视显微镜下的直立位置（图2）。
2. 根据相机的曝光时间和ISO设置，使用白光落射照明拍摄图像。
   注意:对这些图像的形态学分析提供了腺体出口处塞子尺寸的可靠量化。定量可以通过用魔杖工具勾勒眼塞并执行Image J软件的"分析颗粒"命令来执行（参见 材料表）。

5. 眼睑透照（睑板腺形态）

1. 要评估MG区域，请将切除的眼睑置于水平位置，并打开配备红外摄像头的立体显微镜的背光（图3）。
2. 根据相机的ISO调整曝光时间（参见 材料表），以捕获图像。
   注意:在体视显微镜下对这些透照眼睑的红外成像可以帮助测量每个腺泡的形状和大小。这些图像的形态学分析提供了MG大小和数量的可靠定量。可以通过使用魔杖工具勾勒出MG并执行Image J软件的"分析颗粒"命令来进行定量。

结果

本协议描述了建立眼表炎症小鼠模型的顺序步骤。这些协议旨在展示如何在局部应用治疗，获取眼部渗出物，并切除相关的辅助器官，如健康和发炎的眼睑（图2），角膜和结膜。解剖上眼睑时必须注意结膜的隔离，并且在角膜解剖期间必须将其储存在1x PBS中。这将防止结膜干燥，结膜可用于组织学、药代动力学和基因表达研究。

按照上述方案连续7天局部施用OVA和生理盐水。局部用盐水攻击的小鼠显示出健康的眼表，眼睛睁开，有规律的眨眼模式。然而，在用OVA攻击的免疫C57BL / 6J小鼠中煽动了眼部炎症。滴注后的前2小时内，在眼表滴注OVA溶液引起瘙痒，而不是疼痛。渗出液和眼睑湿疹仅在挑战阶段的最后3天观察到。判断动物的行为，没有明显的疼痛。因此，假设小鼠在短时间内承受适度的压力。每日OVA挑战引发了临床表现，如大量眼分泌物，水肿和眼睛狭窄。此外，上下眼睑经常相互粘附，损害了眨眼的基本功能（图2）。该模型遵循严格的中断标准 （补充文件）， 并得到当地动物实验...

讨论

睑板腺的油性分泌物对健康的眼睛非常重要²²。然而，聚集的中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）阻塞这些皮脂腺，这些中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）排列成位于双眼睑睑板上的平行链，可以破坏泪膜²³。这种破坏导致睑板腺功能障碍（MGD）¹ 和加速泪液蒸发并调节眼表损伤²。该协议描述了建立导致MG梗阻的免疫介导的眼表炎症。

来自小鼠模型的研究已经证实了导致与眼表炎症相关的MG阻塞的潜在免疫介导机制。在AED小鼠模型中募集中性粒细胞的强烈TH17反应以及MGD患者泪液中中性粒细胞和其他骨髓细胞的增加表明中性粒细胞阻碍MG²¹的作用。在患有AED的小鼠中，肽基精氨酸脱亚胺酶4证实了aggNETs闭塞MG孔的存在。在该模型中，中性粒细胞显示出聚集和形成阻塞MG腺体导管和孔口的agGNETT的能力降低¹⁰。此外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Gibco
氢氧化铝	浓缩液明矾佐剂	77161	40 mg/ mL <强>终浓度：体内：1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 小鼠，7 岁;9 周	Charles River Laboratories
钙	Carl roth	CN93.1	1 M 终浓度：5 mM
弯曲镊子	FST by Dumont 瑞士	5/45 11251-35
细尖剪刀	FST 不锈钢，德国	15001-08
层流安全柜	Herasafe
微距摄影相机	佳能	EOS6D
微距摄影相机（无红外滤光片）	尼康	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106 凝胶 U/mL
多分析物流式测定试剂盒（定制小鼠 13 重面板）	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9%（盐水）	B.Braun
卵清蛋白 （OVA）	Endofit，Invivogen	9006-59-1	10 mg/200 µL 盐水
百日咳毒素	赛默飞世尔科技	PHZ1174	50 和微型;g/ 500 和微量;盐水中的 L 最终浓度：体内：100 µg/ 100 和微量;L
Petridish	Greiner bio-one	628160
手术刀	羽毛一次性手术刀	No. 21	<强>终浓度：体内：  300 ng/ 100 µL
体视显微镜	蔡司	Stemi508
注射器（角膜/虹膜清洗）	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
注射器（腹腔免疫）	BD Microlane	24 G1"-Nr 17， 055* 25 mm