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方法文章

诱导眼表炎症及受累组织的采集

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DOI：

10.3791/63890

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2022年8月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine 3-Rheumatology and Immunology, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen, 2Deutsches Zentrum für Immuntherapie, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen

本文内容

摘要

眼表炎症会损害眼表组织，并影响眼睛的重要功能。本实验方案描述了一种在睑板腺功能障碍（MGD）小鼠模型中诱导眼表炎症并采集受损组织的方法。

摘要

眼表疾病包括一系列影响角膜、结膜及相关的泪腺网络结构与功能的疾病。睑板腺（MG）分泌脂质，形成一层覆盖性膜，防止泪膜中水相成分蒸发。在过敏性眼病的小鼠模型中，中性粒细胞及其释放的细胞外DNA陷阱存在于睑板腺及眼表区域。聚集的中性粒细胞胞外陷阱（aggNETs）形成由细胞外染色质构成的网状基质，堵塞睑板腺导管开口，导致睑板腺功能障碍。本文介绍了一种诱导眼表炎症及睑板腺功能障碍的方法，并详细描述了采集与眼表相关组织（如角膜、结膜和眼睑）的操作步骤。通过各组织的标准处理技术，展示了睑板腺功能障碍的主要形态学和组织病理学特征。眼表渗出物可用于评估眼表的炎症状态。这些方法为在临床前水平研究局部和全身性抗炎干预措施提供了可行途径。

引言

每一次眨眼都会补充覆盖在角膜上的光滑泪膜。眼表上皮有助于泪膜在眼表的分布和正确排列。角膜和结膜上皮细胞分泌黏蛋白，帮助来自泪腺的水样泪液成分稳定附着于眼球表面。最后，睑板腺（MG）分泌脂质，形成覆盖层，防止泪膜中水样成分的蒸发1,2,3。通过这种方式，所有眼部器官的协调功能共同保护眼表免受病原体侵袭或损伤，并维持清晰透明的视觉，且无任何疼痛或不适。

在健康的 ocular 表面，眼部流动的分泌物或眼眵可清除灰尘、死亡的上皮细胞、细菌、黏液及免疫细胞。聚集的中性粒细胞胞外诱捕网（aggNETs）形成一种网状基质，由细胞外染色质构成，并将这些成分整合入眼眵中。aggNETs 通过蛋白水解作用降解促炎性细胞因子和趋化因子，从而缓解炎症4。然而，当其功能失调时，这些异常的 aggNETs 会驱动多种疾病的发病过程，例如 COVID-19 中的血管闭塞5、胆结石6以及涎石病7。类似地，ocular 表面的 aggNETs 具有保护作用，并有助于缓解这一高度暴露表面的炎症8。ocular 表面 aggNETs 的过度形成或缺失均可能破坏泪膜稳定性，和/或导致角膜损伤、瘢痕性结膜炎及干眼症。例如，睑板腺（MG）阻塞是干眼症的主要病因之一9。已知 aggNETs 还会堵塞 MG 导管中的脂质分泌物流动，导致睑板腺功能障碍（MGD）。aggNETs 引起 MG 开口阻塞，造成覆盖 ocular 表面的脂肪性液体缺乏以及液体逆流淤积，进而导致腺体功能障碍和腺泡损伤。这种功能障碍可引发泪膜蒸发、睑缘纤维化、眼部炎症以及对 MG 的严重损害10,11。

多年来，已开发出多种动物模型以模拟人类睑板腺功能障碍（MGD）的病理过程。例如，1年龄的C57BL/6小鼠已被用于研究年龄相关因素对干眼病（DED）和MGD的影响，反映了50岁及以上患者的眼部疾病病理特征12,13,14。此外，兔子是研究药理学干预效果的合适模型。因此，已有研究通过局部使用肾上腺素或全身给予13-顺式维甲酸（异维A酸）在兔子中诱导MGD15,16,17,18,19。

尽管这些动物模型在确定睑板腺功能障碍（MGD）病理生理学的各种影响因素方面是充分的，但其应用仍受到限制。例如，与年龄相关的MGD小鼠模型仅适用于解析老年人群中的相关因素，因此兔子似乎是研究眼表疾病最合适的动物模型，因为它们能够用于探究多种病理生理机制。然而，由于缺乏在眼表检测蛋白质的全面分析工具，且兔基因组的许多部分尚未注释，其在研究中的应用也受到限制20,21。

此外，用于研究干眼病发病机制的这些动物模型未能提供足够的细节来分析引发眼表炎症的免疫学机制。因此，Reyes 等人建立的小鼠 MGD 模型揭示了小鼠过敏性眼病与人类 MGD 之间的关联，并强调了导致阻塞性 MGD 的免疫病因21。该模型将过敏性眼病与 TH17 型免疫反应相关联，后者可招募中性粒细胞至结膜和眼睑，从而引发 MGD 及慢性眼表炎症21。在此小鼠模型中诱导产生的 MGD 和眼表炎症，是研究由持续免疫反应驱动的局部炎症早期事件的有力工具21。本实验方案描述了伴随阻塞性 MGD 出现的眼表炎症。该方法中，小鼠经免疫致敏后，于两周后在眼表连续 7 天接受免疫原攻击。此外，本文还详细说明了在急性炎症期间获取眼表渗出物及相关眼部器官的步骤，以及角膜、结膜和眼睑的解剖分离方法。

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方案

所有涉及动物的实验程序均按照机构规定的动物福利指南进行，并已获得埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）动物福利委员会的批准（许可证号：55.2.2-2532-2-1217）。本研究使用7至9周龄的雌性C57Bl/6小鼠。小鼠购自商业来源（见材料表），并在特定病原体-free环境中饲养，保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。

1. 小鼠眼表炎症的诱导

  1. 进行免疫原制备以实施免疫。
    1. 在免疫当天新鲜配制免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg/mL）与百日咳毒素（100 µg/mL）在生理盐水中混合，并与佐剂氢氧化铝（40 mg/mL）（参见 材料表）按1:1比例混合。
      注意：百日咳毒素的开启、重悬及免疫原配制操作应在层流安全柜中进行。操作时需穿戴防护服，避免与皮肤接触。
    2. 将免疫原与佐剂混合物在室温下孵育30分钟，然后将100 µL液体装入1 mL注射器中。
    3. 对未麻醉的小鼠进行腹腔内注射免疫原溶液。
      1. 用手握住鼠笼网格，轻轻抓住小鼠尾巴。用拇指和食指牢固夹住小鼠背部和颈部皮肤，并将尾巴及后肢固定于无名指与小指之间，紧贴手掌。
      2. 保持固定后的小鼠头部朝下。
      3. 将100 µL配制好的免疫原溶液注射至下腹部腔体的右侧或左侧象限。
  2. 免疫后2周进行眼表激发。
    1. 使用异氟烷（2.5%）对小鼠进行麻醉。
    2. 每只眼睛滴加5 µL OVA（50 mg/mL）或生理盐水（0.9 % NaCl），双侧眼睛均需处理，等待液滴被眼球吸收，约需5分钟。
    3. 每日重复该操作1次，持续7天。
      ​注：药物的局部给药可采用相同方式进行。

2. 眼部分泌物的采集

  1. 在攻毒后立即向眼部滴加 50 µL 无菌生理盐水，以收集攻毒阶段形成的ocular exudates。
  2. 为获得单细胞悬液，将收集的ocular discharge与含有辅因子钙（5 mM）的重组MN酶（2 x 106 gel U/mL，参见材料表）在37 °C下孵育20分钟。
  3. 在室温下以400 x g 离心7分钟。
  4. 分离上清液，并根据制造商说明书使用多重ELISA检测细胞因子和趋化因子（参见材料表）。
    ​注意：所得上清液可用于蛋白质分析，沉淀物可用于免疫表型分析、吞噬作用、脱颗粒和基因表达等功能性检测。

3. 眼表组织的切除

  1. 按照以下步骤解剖眼睑和眼球。
    1. 采用 CO2 窒息法处死小鼠，并行颈椎脱位。
    2. 将小鼠置于平坦的表面上。
    3. 用浸有70%乙醇的棉签消毒眼部周围的眶区。
    4. 在耳部与眶后窦之间做切口，沿鳞状骨表面垂直切开，再沿上颌骨在下眼睑下方水平延伸切口，同时沿额骨在上眼睑上方水平延伸切口，从而形成围绕眼球的环形切口（图1）。
    5. 使用弯头镊子小心夹住眼球周围已解剖的组织，轻轻拉出组织和眼球。
    6. 将切除的器官置于无菌 PBS 中。
    7. 在体视显微镜下，使用手术刀修剪上眼睑切除组织周围多余的面部肌肉组织。
  2. 按照以下步骤收集结膜。
    1. 将上眼睑置于体视显微镜下的干燥培养皿中。
    2. 使用精细镊子和手术刀，从眼睑内表面极其轻柔地剥离出白色黏膜层。
  3. 接下来，按照以下步骤解剖角膜。
    1. 将眼球置于盛有干冰的新干燥培养皿上，持续3分钟。
    2. 将培养皿平稳地移至实验台面。
    3. 使用精细锋利的剪刀，在角膜靠近角巩膜缘的边界处做一个小切口。
    4. 用手术刀沿眼球延长切口，将巩膜与角膜分离。
    5. 用大量生理盐水冲洗角膜背面，清除残留的虹膜和晶状体。

睑板腺（MG）阻塞的记录

  1. 为评估睑板腺及其开口，将切除的 eyelids 置于体视显微镜下直立位置（图2）。
  2. 根据相机的曝光时间和 ISO 设置，使用白光落射照明拍摄图像。
    注意：对这些图像进行形态计量分析，可对腺体出口处栓塞的大小进行可靠量化。可通过使用 Image J 软件（见材料表）的魔棒工具勾勒眼部分泌栓塞，并执行"分析颗粒"命令来完成量化。

5. 睑缘透照法（睑板腺形态学）

  1. 为评估睑板腺（MG）区域，将切除的眼睑置于水平位置，并打开配备红外相机的体视显微镜的背光（图3）。
  2. 根据相机的ISO值（见材料表）调整曝光时间以获取图像。
    注意：在体视显微镜下对透射照明的眼睑进行红外成像，有助于测量每个腺泡的形状和大小。对这些图像进行形态计量分析可可靠地量化睑板腺的大小和数量。可通过使用Image J软件的“魔棒工具”勾勒出睑板腺轮廓，并执行"Analyze Particles"命令来完成定量分析。

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结果

本方案描述了建立小鼠眼表炎症模型的逐步操作流程。该方案旨在展示如何进行局部给药、获取眼部分泌物，以及切除相关附属器官，包括健康和炎症状态的眼睑（图2）、角膜和结膜。在分离结膜时需特别注意上眼睑的解剖操作，并在角膜解剖过程中将结膜保存于1×PBS中，以防止其干燥。处理后的结膜可用于组织学、药代动力学及基因表达研究。

根据上述方案，连续7天在眼部表面局部应用OVA和生理盐水。仅用生理盐水局部激发的小鼠表现出健康的角膜表面，睁眼充分且眨眼模式正常。然而，在经OVA局部激发的免疫小鼠中引发了眼部炎症。在滴加OVA溶液后最初2小时内，小鼠出现瘙痒感而非疼痛。渗出物和眼睑湿疹仅在激发阶段的最后3天内被观察到。根据动物行为判断，未见明显疼痛表现。因此，推测小鼠在短期内承受了中等程度的应激。每日OVA激发引发了明显的临床症状，包括大量眼部分泌物、结膜水肿以及眼裂明显缩小。此外，上下眼睑经常发生黏连，影响了眨眼这一基本功能（图2）。本模型严格遵循预定的终止标准 （补...

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讨论

睑板腺的油性分泌物对眼睛健康至关重要22。然而，这些皮脂腺可能被聚集的中性粒细胞胞外诱捕网（aggNETs）阻塞，后者以平行细丝的形式排列于上下眼睑的睑板表面，从而破坏泪膜23。这种破坏可导致睑板腺功能障碍（MGD）1，并加速泪液蒸发，进而引发眼表损伤2。本方案描述了建立免疫介导的眼表炎症以导致睑板腺阻塞的方法。

小鼠模型的研究已证实，MG 梗阻与眼表炎症相关的根本机制是免疫介导的。在 AED 小鼠模型中，强烈的 TH17 反应可募集中性粒细胞，而 MGD 患者泪液中中性粒细胞及其他髓系细胞增多，提示中性粒细胞在阻塞 MG 中发挥重要作用21。在 AED 小鼠模型中，通过肽基精氨酸脱亚胺酶 4 检测证实了阻塞 MG 开口的 aggNETs 的存在。在此模型中，中性粒细胞聚集能力减弱，并形成阻塞 MG 腺体导管和开口的 aggNETs

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了德国研究基金会（DFG）PANDORA 项目编号 B3（2886）、SCHA 2040/1-1、MU 4240/2-1、CRC1181(C03)、TRR241(B04)，欧盟地平线2020计划FET开放项目（2018-2020）861878，以及大众基金会（资助编号97744）对MH的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBSGibco
氢氧化铝Imject alum Adjuvant7716140 mg/mL
终浓度：体内：1 mg/100 µL
C57Bl/6小鼠，7–9周龄Charles River Laboratories 
钙Carl rothCN93.11 M
终浓度：5 mM
弯头镊FST by Dumont SWITZERLAND5/45 11251-35
精细尖头剪刀FST Stainless steel, Germany15001-08
层流安全柜Herasafe
宏摄影相机CanonEOS6D
宏摄影相机（无红外滤光片）NikonD5300
MnaseNew England biolabsM0247S2 × 106 酶单位/mL
多因子流式检测试剂盒（定制小鼠13重检测面板）BiolegendCLPX-200421AM-UERLAN
0.9% NaCl（生理盐水）B.Braun
卵清蛋白（OVA）Endofit, Invivogen9006-59-1生理盐水中10 mg/200 µL
百日咳毒素 ThermoFisher Scientific PHZ1174生理盐水中50 µg/500 µL
终浓度：体内：100 µg/100 µL
培养皿Greiner bio-one628160
手术刀Feather一次性手术刀No. 21 终浓度：体内： 300 ng/100 µL
体视显微镜ZeissStemi508
注射器（角膜/虹膜冲洗）BD Microlane27 G × 3/4 - Nr.20 0.4 × 19 mm
注射器（腹腔免疫）BD Microlane24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm

参考文献

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