眼表炎症会损害眼表组织，并影响眼睛的重要功能。本实验方案描述了一种在睑板腺功能障碍（MGD）小鼠模型中诱导眼表炎症并采集受损组织的方法。
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本文内容
摘要
摘要
眼表疾病包括一系列影响角膜、结膜及相关的泪腺网络结构与功能的疾病。睑板腺（MG）分泌脂质，形成一层覆盖性膜，防止泪膜中水相成分蒸发。在过敏性眼病的小鼠模型中，中性粒细胞及其释放的细胞外DNA陷阱存在于睑板腺及眼表区域。聚集的中性粒细胞胞外陷阱（aggNETs）形成由细胞外染色质构成的网状基质，堵塞睑板腺导管开口，导致睑板腺功能障碍。本文介绍了一种诱导眼表炎症及睑板腺功能障碍的方法，并详细描述了采集与眼表相关组织（如角膜、结膜和眼睑）的操作步骤。通过各组织的标准处理技术，展示了睑板腺功能障碍的主要形态学和组织病理学特征。眼表渗出物可用于评估眼表的炎症状态。这些方法为在临床前水平研究局部和全身性抗炎干预措施提供了可行途径。
引言
每一次眨眼都会补充覆盖在角膜上的光滑泪膜。眼表上皮有助于泪膜在眼表的分布和正确排列。角膜和结膜上皮细胞分泌黏蛋白，帮助来自泪腺的水样泪液成分稳定附着于眼球表面。最后，睑板腺（MG）分泌脂质，形成覆盖层，防止泪膜中水样成分的蒸发1,2,3。通过这种方式，所有眼部器官的协调功能共同保护眼表免受病原体侵袭或损伤，并维持清晰透明的视觉，且无任何疼痛或不适。
在健康的 ocular 表面，眼部流动的分泌物或眼眵可清除灰尘、死亡的上皮细胞、细菌、黏液及免疫细胞。聚集的中性粒细胞胞外诱捕网（aggNETs）形成一种网状基质，由细胞外染色质构成，并将这些成分整合入眼眵中。aggNETs 通过蛋白水解作用降解促炎性细胞因子和趋化因子，从而缓解炎症4。然而，当其功能失调时，这些异常的 aggNETs 会驱动多种疾病的发病过程，例如 COVID-19 中的血管闭塞5、胆结石6以及涎石病7。类似地，ocular 表面的 aggNETs 具有保护作用，并有助于缓解这一高度暴露表面的炎症8
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方案
所有涉及动物的实验程序均按照机构规定的动物福利指南进行，并已获得埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）动物福利委员会的批准（许可证号：55.2.2-2532-2-1217）。本研究使用7至9周龄的雌性C57Bl/6小鼠。小鼠购自商业来源（见材料表），并在特定病原体-free环境中饲养，保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
1. 小鼠眼表炎症的诱导
- 进行免疫原制备以实施免疫。
- 在免疫当天新鲜配制免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg/mL）与百日咳毒素（100 µg/mL）在生理盐水中混合，并与佐剂氢氧化铝（40 mg/mL）（参见 材料表）按1:1比例混合。
注意：百日咳毒素的开启、重悬及免疫原配制操作应在层流安全柜中进行。操作时需穿戴防护服，避免与皮肤接触。 - 将免疫原与佐剂混合物在室温下孵育30分钟，然后将100 µL液体装入1 mL注射器中。
- 对未麻醉的小鼠进行腹腔内注射免疫原溶液。
- 用手握住鼠笼网格，轻轻抓住小鼠尾巴。用拇指和食指牢固夹住小鼠背部和颈部皮肤，并将尾巴及后肢固定于无名指与小指之间，紧贴手掌。
- 保持固定后的小鼠头部朝下。
- 将100 µL配制好的免疫原溶液注射至....
- 在免疫当天新鲜配制免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg/mL）与百日咳毒素（100 µg/mL）在生理盐水中混合，并与佐剂氢氧化铝（40 mg/mL）（参见 材料表）按1:1比例混合。
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结果
本方案描述了建立小鼠眼表炎症模型的逐步操作流程。该方案旨在展示如何进行局部给药、获取眼部分泌物，以及切除相关附属器官，包括健康和炎症状态的眼睑（图2）、角膜和结膜。在分离结膜时需特别注意上眼睑的解剖操作，并在角膜解剖过程中将结膜保存于1×PBS中，以防止其干燥。处理后的结膜可用于组织学、药代动力学及基因表达研究。
根据上述方案，连续7天在眼部表面局部应用OVA和生理盐水。仅用生理盐水局部激发的小鼠表现出健康的角膜表面，睁眼充分且眨眼模式正常。然而，在经OVA局部激发的免疫小鼠中引发了眼部炎症。在滴加OVA溶液后最初2小时内，小鼠出现瘙痒感而非疼痛。渗出物和眼睑湿疹仅在激发阶段的最后3天内被观察到。根据动物行为判断，未见明显疼痛表现。因此，推测小鼠在短期内承受了中等程度的应激。每日OVA激发引发了明显的临床症状，包括大量眼部分泌物、结膜水肿以及眼裂明显缩小。此外，上下眼睑经常发生黏连，影响了眨眼这一基本功能（图2）。本模型严格遵循预定的终止标准 （补.......
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讨论
睑板腺的油性分泌物对眼睛健康至关重要22。然而，这些皮脂腺可能被聚集的中性粒细胞胞外诱捕网（aggNETs）阻塞，后者以平行细丝的形式排列于上下眼睑的睑板表面，从而破坏泪膜23。这种破坏可导致睑板腺功能障碍（MGD）1，并加速泪液蒸发，进而引发眼表损伤2。本方案描述了建立免疫介导的眼表炎症以导致睑板腺阻塞的方法。
小鼠模型的研究已证实，MG 梗阻与眼表炎症相关的根本机制是免疫介导的。在 AED 小鼠模型中，强烈的 TH17 反应可募集中性粒细胞，而 MGD 患者泪液中中性粒细胞及其他髓系细胞增多，提示中性粒细胞在阻塞 MG 中发挥重要作用21。在 AED 小鼠模型中，通过肽基精氨酸脱亚胺酶 4 检测证实了阻塞 MG 开口的 aggNETs 的存在。在此模型中，中性粒细胞聚集能力减弱，并形成阻塞 MG 腺体导管和开口的 aggNETs
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了德国研究基金会（DFG）PANDORA 项目编号 B3（2886）、SCHA 2040/1-1、MU 4240/2-1、CRC1181(C03)、TRR241(B04)，欧盟地平线2020计划FET开放项目（2018-2020）861878，以及大众基金会（资助编号97744）对MH的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Gibco | ||
| 氢氧化铝 | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/mL 终浓度：体内：1 mg/100 µL |
| C57Bl/6小鼠，7–9周龄 | Charles River Laboratories | ||
| 钙 | Carl roth | CN93.1 | 1 M 终浓度：5 mM |
| 弯头镊 | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| 精细尖头剪刀 | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| 层流安全柜 | Herasafe | ||
| 宏摄影相机 | Canon | EOS6D | |
| 宏摄影相机（无红外滤光片） | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 × 106 酶单位/mL |
| 多因子流式检测试剂盒（定制小鼠13重检测面板） | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| 0.9% NaCl（生理盐水） | B.Braun | ||
| 卵清蛋白（OVA） | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 生理盐水中10 mg/200 µL |
| 百日咳毒素 | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 生理盐水中50 µg/500 µL 终浓度：体内：100 µg/100 µL |
| 培养皿 | Greiner bio-one | 628160 | |
| 手术刀 | Feather一次性手术刀 | No. 21 | 终浓度：体内： 300 ng/100 µL |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi508 | |
| 注射器（角膜/虹膜冲洗） | BD Microlane | 27 G × 3/4 - Nr.20 0.4 × 19 mm | |
| 注射器（腹腔免疫） | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
参考文献
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tea....
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