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方法文章

Mycobacterium tuberculosis 通过尺寸排阻色谱法富集细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/63895

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2022年5月19日

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

本文内容

摘要

该方案描述了尺寸排阻色谱法，一种简便且可重复的富集技术 结核分枝杆菌 来自培养上清液的细胞外囊泡

摘要

细胞外囊泡（EVs）在细菌感染背景下的作用已成为理解微生物生理学的一个新方向。具体而言，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的EVs在宿主-病原体相互作用以及对环境应激的响应中发挥重要作用。Mtb EVs还具有高度抗原性，显示出作为疫苗组分的潜力。目前纯化Mtb EVs最常用的方法是密度梯度超速离心法。该方法存在若干局限性，包括通量低、得率低、依赖昂贵设备、技术难度高，且可能对最终制备物产生不利影响。尺寸排阻色谱法（SEC）是一种更为温和的替代方法，可克服超速离心法的诸多缺点。本实验方案表明，SEC可用于高效富集Mtb EVs，快速、可扩展地获得更高产量且高质量的Mtb EV制备物。此外，通过定量与定性分析手段与密度梯度超速离心法进行比较，进一步证明了SEC的优势。尽管对EV数量（纳米颗粒追踪分析）、表型（透射电子显微镜）和内容物（蛋白质印迹）的评估是针对Mtb EVs优化的，但所提供的工作流程也可应用于其他分枝杆菌。

引言

病原体释放的细胞外囊泡（EV）可能是解锁控制传染病新技术的关键1。结核分枝杆菌（Mtb）是一种具有重大影响的病原体，感染了全球约三分之一的人口，每年导致数百万人死亡2。尽管已有大量文献记录Mtb能够产生EV，但这些EV在感染过程中的生物合成机制及其多种功能（例如免疫刺激、免疫抑制、铁和营养获取）仍不明确3,4,5。对Mtb EV组成的研究揭示其为直径50–150 nm的脂质膜包被小球，来源于质膜，含有具有免疫学意义的脂质和蛋白质3,6。对Mtb EV在细菌生理学中作用的研究表明，细菌EV在响应环境压力以维持生存方面具有重要的调控作用5。宿主-病原体相互作用的研究解释起来更为复杂，但已有证据表明，Mtb EV可影响宿主的免疫反应，并可能作为有效的疫苗组分3,4,7。

迄今为止，大多数关于结核分枝杆菌（Mtb）细胞外囊泡（EVs）的研究均依赖密度梯度超速离心法来富集囊泡8。该方法在小规模研究中是有效的；然而，该技术存在若干技术和操作上的挑战。替代的工作流程通常结合多步离心法，先去除完整细胞和大颗粒碎片，最后通过超速离心步骤沉淀EVs。该方法的效率可能差异较大，常导致产量较低，并伴随可溶性非囊泡相关生物分子的共纯化，同时可能影响囊泡的完整性9。此外，该过程耗时较长，依赖大量人工操作，且由于设备限制，通量非常有限。

本方案描述了一种密度梯度超速离心的替代技术：尺寸排阻色谱法（SEC）。该方法此前已用于环境分枝杆菌，而在本研究中已将其拓展应用于结核分枝杆菌（Mtb）10。使用市售色谱柱和自动组分收集器可提高囊泡制备的一致性，并减少对特定昂贵设备的依赖。与密度梯度超速离心相比，该方案可在更短的时间内完成，显著提高实验通量。该技术操作难度较低，易于掌握，有助于提升实验室间和实验室内的可重复性。最后，SEC具有高分离效率，且过程温和，能够保持囊泡的完整性。

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方案

科罗拉多州立大学机构生物安全委员会批准了本研究（19-046B）。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的培养及富含细胞外囊泡的培养上清液的收集均由经过培训的人员在高等级生物安全实验室中进行。在经过有效的灭活方法处理，并经机构生物安全政策确认和批准后，材料方可移出高生物安全 containment 区域。在重复本实验方案时，若无法实施经验证的灭活或无菌过滤方法，则后续所有操作必须在高等级生物安全实验室中进行。

1. 结核分枝杆菌囊泡粗提物的制备

注意：有关结核分枝杆菌（Mtb）培养及培养滤过蛋白（CFP）制备的详细步骤，请参见参考文献11,12。建议细菌培养基中不含含有细胞外囊泡（EV）或蛋白质成分的生长补充剂（如油酸白蛋白葡萄糖催化酶，OADC）以及吐温类去垢剂。同时建议对细菌培养物的质量及收获的CFP进行检测，以确保细胞死亡和裂解程度有限13,14。

  1. 通过加入磷酸盐缓冲液（1× PBS）至100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤器的满容量，准备该过滤器（参见材料表）。在4 °C条件下，以2,800 × g离心5分钟。
    注意：若使用无死体积限位的过滤器，需特别注意避免样品体积减少至低于滤膜水平，导致离心过程中滤膜完全干燥。
  2. 弃去滤过液及残留的PBS，然后将Mtb CFP加至样品室的最大容量。在4 °C条件下，以2,800 × g离心，直至体积减少至超滤装置的最小体积。根据需要重复此步骤，继续向装置中添加CFP，直至整个样品充分浓缩。
    注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100 kDa滤过液（100F）材料。储存于4 °C。
  3. 向含有浓缩物的过滤器中加入1× PBS至装置的总容量。按步骤1.2所述方法再次浓缩体积。重复此步骤五次，以确保充分洗涤和缓冲液置换。
  4. 根据超滤装置的说明书回收100 kDa浓缩后的CFP截留物（100R）（参见材料表）。回收100R后，用最小体积的1× PBS至少冲洗滤膜三次，并将冲洗液与100R合并，以最大化回收率。
  5. 按照制造商说明，使用二辛可宁酸法（BCA）对100R材料进行定量（参见材料表）。进行测定时，将样品用PBS稀释为1:2、1:5和1:10多个稀释度，并每个样品设三个重复。
    ​注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100R材料。储存于4 °C。

2. 利用尺寸排阻色谱法从CFP中富集结核分枝杆菌EV

注意：以下步骤专为使用 3 mg 的 100R Mtb CFP 并结合 SEC 柱和自动组分收集器（AFC，参见材料表）而设计。用户可根据起始浓度和色谱柱类型的不同，参照制造商的说明对本方案进行相应调整。此外，建议用户阅读并理解自动组分收集器的使用手册。

  1. 让SEC柱在室温下平衡。
  2. 使用塔式单元背面的电源开关打开AFC，并在主菜单触摸屏上按SETUP，根据需要调整称重传感器的设置。称重传感器仅在首次使用、每次软件更新后，或发现收集的组分体积不一致时才需校准。
  3. 在SETUP界面中，选择CAROUSEL > CALIBRATE以校准转盘。将带有13个小孔且孔朝上的转盘插入AFC塔中，并通过按-和/或+按钮调整转盘位置，使液体喷嘴正对冲洗位置。
  4. 取下已平衡的SEC柱的盖帽。将SEC柱滑入合适的柱架中，并小心地安装到AFC塔上。确保柱上的射频识别（RFID）标签朝向AFC，并检查柱与阀门之间的连接是否牢固。将废液出口管放入收集容器中。
  5. 在SETUP界面中，选择Collection Schedule，通过按-和/或+按钮将计数设为13，体积设为0.5 mL。将"Buffer Volume"设置保留默认值2.7 mL，然后按X关闭"Collection Schedule"窗口。
  6. 从主界面选择START COLLECTION，并选择YES确认收集参数。将13个已标记、开盖且管口朝向转盘中心的1.7 mL微量离心管装入转盘。
  7. 选择OK启动AFC，然后安装柱储液罐并再次按OK推进。按YES选择冲洗柱的选项，并加入一个柱体积的0.2 µm滤过的PBS以去除任何保存缓冲液。冲洗完成后，按OK继续推进AFC。
  8. 将转盘盖盖在AFC上，然后按OK。准备一个柱体积的0.2 µm滤过的PBS。使用移液器去除柱中多余的缓冲液。
  9. 将步骤1.5中定量的3 mg 100R样品用1x PBS定容至500 µL。将3 mg样品加至柱顶部。推进AFC，使样品流入筛板。待样品完全进入柱后，将步骤2.6中准备的PBS加入储液罐中。
  10. 监测AFC运行过程，其将首先收集空体积，然后按指定收集各组分。运行结束后，转盘返回废液位置，取下盖子，并从转盘中取出各组分管。在定量（步骤3）和定性（步骤4）前，将组分储存于4 °C。
  11. 若需重复使用该柱，请按YES选择清洗柱的选项；否则按NO。请遵循AFC上的操作说明。
    ​注：柱经清洗且保存缓冲液流过后，可将其取下、加盖，并在4 °C下储存。

3. 结核分枝杆菌EVs的定量

  1. 使用BCA法和微BCA法测定各组分的蛋白质浓度12。
    1. 对于从3 mg 100R Mtb CFP中收集的0.5 mL组分，对每份样品的第1–7号组分进行三份平行测定，使用微BCA法并按1:3比例稀释。
    2. 对于第5–13号0.5 mL组分，每份样品进行三份平行测定，使用BCA法且不稀释。
      注：对第5–7号组分同时进行两种检测，有助于确保所有组分均获得可读结果。
  2. 采用纳米颗粒追踪分析（NTA）定量各组分的颗粒浓度。
    1. 将样品用1 mL 1× PBS稀释，建议起始稀释比例如下：第1–3号组分使用1:100稀释，其余组分使用1:10稀释。
    2. 涡旋振荡稀释后的溶液，然后将样品吸入1 mL一次性注射器中。如有条件，将注射器置于自动注射泵中。
    3. 设置注射泵流速为30 µL/min，视频采集参数设为屏幕增益10–12，相机水平10–12，并为每个样品调节焦距。
    4. 以恒定流速连续采集至少三个视频，每个视频时长30秒。
    5. 使用软件进行分析时，检测阈值设为5。
      ​注：若不消耗大量样品体积，可能无法获得最晚洗脱组分（>7）的NTA数据。

4. 结核分枝杆菌囊泡的鉴定

  1. 使用银染蛋白凝胶观察各组分的总蛋白谱。
    注意：SDS-PAGE 和银染的详细操作步骤参见参考文献15。
    1. 向每种组分各取 10 µL，以及 5 µg 的 CFP、100R 和 100F 中加入 SDS 上样缓冲液，在 100 °C 下煮沸 5 分钟，随后上样至 4%–12% Bis-Tris 凝胶，并使用蛋白分子量标记物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（见材料表）。
    2. 使用 1× 2-[N-吗啉代]乙磺酸（MES）电泳缓冲液（见材料表），在 200 V 电压下电泳 35 分钟。
    3. 从凝胶夹中取出凝胶，并进行银染染色15。
  2. 通过蛋白质印迹法（Western blot）评估各组分中外泌体（EV）标志物的存在与否。
    注意：蛋白质印迹法的详细操作步骤参见参考文献15。
    1. 按照步骤 4.1.1–4.1.2 所述进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。
    2. 从凝胶夹中取出凝胶，将分离后的蛋白在 50 V 电压下转移至 0.2 µm 硝酸纤维素膜（见材料表），转移时间至少为 1 小时。
    3. 进行 Western blot 分析以检测目标蛋白，推荐使用针对 LpqH、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）和 GroES 的一抗（见材料表）。
    4. 根据标志物的有无情况，按下游应用需求合并相应组分。
  3. 通过透射电子显微镜（TEM）确认完整囊泡的存在。
    1. 向 15 µL 囊泡样品中加入 15 µL 4% 电镜级多聚甲醛进行固定，4 °C 过夜保存。
    2. 准备 200 目的 Formvar-碳包被铜 TEM 载网，清洁表面并制成亲水性基底。
      注意：建议使用 95% 氩气、5% 氧气、30% 等离子功率进行等离子清洗 1 分钟。
    3. 将 10 µL 固定后的样品滴加到载网上，静置 10 分钟使样品吸附，然后用滤纸吸去多余液体。
    4. 将载网在超纯水液滴上漂浮 30 秒，随后吸去多余液体。
    5. 将载网在 d% 电镜级醋酸铀液滴上漂浮 2 分钟，然后吸去多余液体。
    6. 让载网在空气中彻底干燥。
    7. 使用透射电子显微镜（TEM）（见材料表）在 100 kV 或类似条件下成像。
      注意：应根据下游应用选择其他外泌体（EV）定量与表征方法。建议参考《细胞外囊泡研究的最低信息标准》18 指南，以确保所有 EV 研究的严谨性和可重复性。

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结果

结核分枝杆菌（Mtb）的培养滤液蛋白（CFP）经浓缩和定量后，取3 mg样品上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱。蛋白浓度和颗粒浓度分别通过BCA法和NTA法进行测定。蛋白和颗粒回收量的预期范围以及本实验获得的具体数值见表1。若数值显著高于该范围，可能提示存在污染或色谱柱完整性问题；若数值明显偏低，则提示超滤步骤中存在问题，因此需将穿流液与起始CFP及100R组分进行比较，以判断浓缩是否成功。非特异性蛋白银染结果显示，后续洗脱组分中蛋白含量更高，且其蛋白谱与100R组分相似（图1）。

各组分的蛋白质印迹结果显示，脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）存在于各个组分中，而较晚洗脱的组分显示出较弱强度的条带图 2A，补充图119 kDa脂蛋白LpqH，已知存在于结核分枝杆菌（Mtb）的细胞外囊泡（EVs）中3,

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讨论

Mycobacterium tuberculosis 的细胞外囊泡是高度抗原性的储存库，使其成为开发诊断工具和未来疫苗的有吸引力的方向4,19,20。传统上，密度梯度超速离心法被用于将结核分枝杆菌（Mtb）的细胞外囊泡（EVs）与其他可溶性分泌物质分离8。尽管该方法有效，但耗时较长、技术难度高，且可能影响最终EV制备物的完整性9,10。本方案提供了一种通过尺寸排阻色谱法（SEC）制备Mtb EV的替代方法。

该方法的成功有几个关键点。初始的结核分枝杆菌（Mtb）无细胞滤液（CFP）制备将影响后续尺寸排阻色谱（SEC）所得囊泡的质量和产量。建议在对数生长期中期或之前收获CFP，以限制收获时细胞裂解的程度。迟缓期和稳定期...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢兽医与生物医学科学学院实验奖和学院研究委员会共享研究计划对 NKG 的支持，以及 ATCC 对 KMD 的资助（项目编号 # 2016-0550-0002）。我们还感谢 Anne Simpson 提供的技术支持，以及 BEI Resources、NIAID、NIH 提供以下试剂：抗结核分枝杆菌 LpqH（基因 Rv3763）单克隆抗体，IT-54（体外生产），NR-13792；抗结核分枝杆菌 GroES（基因 Rv3418c）单克隆抗体，克隆株 IT-3（SA-12）（体外生产），NR-49223；以及抗结核分枝杆菌 LAM 单克隆抗体，克隆株 CS-35（体外生产），NR-13811。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20x MES SDS 电泳缓冲液ThermoFisher ScientificNP0002
96 孔板Corning15705-066
自动组分收集器IZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark 预染蛋白 MarkerInvitrogen10748010
台式离心机Beckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 离心过滤器，截留分子量 100 kDaMillipore SigmaUFC710008步骤 1.1 中使用的超滤装置
电转印系统ThermoFisher Scientific09-528-135
电镜级多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15714-S
Formvar/碳膜 200 目铜网Electron Microscopy SciencesFCF200H-Cu-TA
山羊抗小鼠 IgG H&L（碱性磷酸酶），全分子，1 mLAbCamab6790二抗
JEM-1400 透射电子显微镜JOEL
Micro BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23235
酶标仪BIOTEKEpoch
单克隆抗-Mycobacterium tuberculosis GroES（基因 Rv3814c）BEI ResourcesNR-49223一抗
单克隆抗-Mycobacterium tuberculosis LpqH（基因 Rv3763）BEI ResourcesNR-13792一抗
单克隆抗-Mycobacterium tuberculosis LAM，克隆 CS-35BEI ResourcesNR-13811一抗
NanoClean 1070Fischione Instruments用于透射电镜铜网的等离子清洗
配备注射泵及安装 NanoSight NTA 软件计算机的 Nanosight 仪器Malvern PanalyticalNS300
硝酸纤维素膜，卷状，0.2 μmBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶ThermoFisher ScientificNP0323BOX
磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁Corning21-040-CV
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic 电源BioRad1645050
qEV Original 35 nm 5/包IZON ScienceSP5-USDSEC 柱
SDS 上样缓冲液BosterAR1112本实验采用实验室自配配方，但该产品等效
SDS-PAGE 凝胶电泳槽ThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
银染增强试剂盒BioRad1610449本实验采用实验室自建方案，但该试剂盒等效
醋酸铀Electron Microscopy Sciences22400

参考文献

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