该方案描述了尺寸排阻色谱法，一种简便且可重复的富集技术 结核分枝杆菌 来自培养上清液的细胞外囊泡
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摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）在细菌感染背景下的作用已成为理解微生物生理学的一个新方向。具体而言，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的EVs在宿主-病原体相互作用以及对环境应激的响应中发挥重要作用。Mtb EVs还具有高度抗原性，显示出作为疫苗组分的潜力。目前纯化Mtb EVs最常用的方法是密度梯度超速离心法。该方法存在若干局限性，包括通量低、得率低、依赖昂贵设备、技术难度高，且可能对最终制备物产生不利影响。尺寸排阻色谱法（SEC）是一种更为温和的替代方法，可克服超速离心法的诸多缺点。本实验方案表明，SEC可用于高效富集Mtb EVs，快速、可扩展地获得更高产量且高质量的Mtb EV制备物。此外，通过定量与定性分析手段与密度梯度超速离心法进行比较，进一步证明了SEC的优势。尽管对EV数量（纳米颗粒追踪分析）、表型（透射电子显微镜）和内容物（蛋白质印迹）的评估是针对Mtb EVs优化的，但所提供的工作流程也可应用于其他分枝杆菌。
引言
病原体释放的细胞外囊泡（EV）可能是解锁控制传染病新技术的关键1。结核分枝杆菌（Mtb）是一种具有重大影响的病原体，感染了全球约三分之一的人口，每年导致数百万人死亡2。尽管已有大量文献记录Mtb能够产生EV，但这些EV在感染过程中的生物合成机制及其多种功能（例如免疫刺激、免疫抑制、铁和营养获取）仍不明确3,4,5。对Mtb EV组成的研究揭示其为直径50–150 nm的脂质膜包被小球，来源于质膜，含有具有免疫学意义的脂质和蛋白质3,6。对Mtb EV在细菌生理学中作用的研究表明，细菌EV在响应环境压力以维持生存方面具有重要的调控作用5。宿主-病原体相互作用的研究解释起来更为复杂，但已有证据表明，Mtb EV可影响宿主的免疫反应，并可能作为有效的疫苗组分3,4,7。
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方案
科罗拉多州立大学机构生物安全委员会批准了本研究（19-046B）。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的培养及富含细胞外囊泡的培养上清液的收集均由经过培训的人员在高等级生物安全实验室中进行。在经过有效的灭活方法处理，并经机构生物安全政策确认和批准后，材料方可移出高生物安全 containment 区域。在重复本实验方案时，若无法实施经验证的灭活或无菌过滤方法，则后续所有操作必须在高等级生物安全实验室中进行。
1. 结核分枝杆菌囊泡粗提物的制备
注意：有关结核分枝杆菌（Mtb）培养及培养滤过蛋白（CFP）制备的详细步骤，请参见参考文献11,12。建议细菌培养基中不含含有细胞外囊泡（EV）或蛋白质成分的生长补充剂（如油酸白蛋白葡萄糖催化酶，OADC）以及吐温类去垢剂。同时建议对细菌培养物的质量及收获的CFP进行检测，以确保细胞死亡和裂解程度有限13,14。
- 通过加入磷酸盐缓冲液（1× PBS）至100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤器的满容量，准备该过滤器（参见材....
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结果
结核分枝杆菌（Mtb）的培养滤液蛋白（CFP）经浓缩和定量后，取3 mg样品上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱。蛋白浓度和颗粒浓度分别通过BCA法和NTA法进行测定。蛋白和颗粒回收量的预期范围以及本实验获得的具体数值见表1。若数值显著高于该范围，可能提示存在污染或色谱柱完整性问题；若数值明显偏低，则提示超滤步骤中存在问题，因此需将穿流液与起始CFP及100R组分进行比较，以判断浓缩是否成功。非特异性蛋白银染结果显示，后续洗脱组分中蛋白含量更高，且其蛋白谱与100R组分相似（图1）。
各组分的蛋白质印迹结果显示，脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）存在于各个组分中，而较晚洗脱的组分显示出较弱强度的条带图 2A，补充图119 kDa脂蛋白LpqH，已知存在于结核分枝杆菌（Mtb）的细胞外囊泡（EVs）中3,
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讨论
Mycobacterium tuberculosis 的细胞外囊泡是高度抗原性的储存库，使其成为开发诊断工具和未来疫苗的有吸引力的方向4,19,20。传统上，密度梯度超速离心法被用于将结核分枝杆菌（Mtb）的细胞外囊泡（EVs）与其他可溶性分泌物质分离8。尽管该方法有效，但耗时较长、技术难度高，且可能影响最终EV制备物的完整性9,10。本方案提供了一种通过尺寸排阻色谱法（SEC）制备Mtb EV的替代方法。
该方法的成功有几个关键点。初始的结核分枝杆菌（Mtb）无细胞滤液（CFP）制备将影响后续尺寸排阻色谱（SEC）所得囊泡的质量和产量。建议在对数生长期中期或之前收获CFP，以限制收获时细胞裂解的程度。迟缓期和稳定期.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢兽医与生物医学科学学院实验奖和学院研究委员会共享研究计划对 NKG 的支持，以及 ATCC 对 KMD 的资助（项目编号 # 2016-0550-0002）。我们还感谢 Anne Simpson 提供的技术支持，以及 BEI Resources、NIAID、NIH 提供以下试剂：抗结核分枝杆菌 LpqH（基因 Rv3763）单克隆抗体，IT-54（体外生产），NR-13792；抗结核分枝杆菌 GroES（基因 Rv3418c）单克隆抗体，克隆株 IT-3（SA-12）（体外生产），NR-49223；以及抗结核分枝杆菌 LAM 单克隆抗体，克隆株 CS-35（体外生产），NR-13811。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS 电泳缓冲液 | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 孔板 | Corning | 15705-066 | |
| 自动组分收集器 | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark 预染蛋白 Marker | Invitrogen | 10748010 | |
| 台式离心机 | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 离心过滤器，截留分子量 100 kDa | Millipore Sigma | UFC710008 | 步骤 1.1 中使用的超滤装置 |
| 电转印系统 | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| 电镜级多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/碳膜 200 目铜网 | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| 山羊抗小鼠 IgG H&L（碱性磷酸酶），全分子，1 mL | AbCam | ab6790 | 二抗 |
| JEM-1400 透射电子显微镜 | JOEL | ||
| Micro BCA 蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| 酶标仪 | BIOTEK | Epoch | |
| 单克隆抗-Mycobacterium tuberculosis GroES（基因 Rv3814c） | BEI Resources | NR-49223 | 一抗 |
| 单克隆抗-Mycobacterium tuberculosis LpqH（基因 Rv3763） | BEI Resources | NR-13792 | 一抗 |
| 单克隆抗-Mycobacterium tuberculosis LAM，克隆 CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | 一抗 |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | 用于透射电镜铜网的等离子清洗 | |
| 配备注射泵及安装 NanoSight NTA 软件计算机的 Nanosight 仪器 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| 硝酸纤维素膜，卷状，0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶 | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁 | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic 电源 | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/包 | IZON Science | SP5-USD | SEC 柱 |
| SDS 上样缓冲液 | Boster | AR1112 | 本实验采用实验室自配配方，但该产品等效 |
| SDS-PAGE 凝胶电泳槽 | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| 银染增强试剂盒 | BioRad | 1610449 | 本实验采用实验室自建方案，但该试剂盒等效 |
| 醋酸铀 | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
参考文献
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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重印与许可
