一种氯己定葡萄糖酸盐诱导的小鼠腹膜损伤模型

摘要

本方案建立了一种氯己定葡萄糖酸盐（CG）诱导腹膜纤维化的腹膜透析（PD）小鼠模型。与其他腹膜透析动物模型相比，该模型操作简便，易于使用。

摘要

腹膜纤维化是腹膜透析（PD）的重要并发症。为研究并解决这一问题，需要建立合适的腹膜透析动物模型。本实验方案建立了一种由氯己定葡萄糖酸盐（CG）诱导的腹膜纤维化模型，可模拟腹膜透析患者的病理状态。在雄性C57BL/6小鼠中，通过腹腔注射含15%乙醇的0.1% CG溶液，每隔一天给药一次，持续3周，共给药9次，以诱导腹膜纤维化。于第22天进行腹膜功能检测。小鼠安乐死后，取腹部壁层腹膜及肝脏脏层腹膜组织。经Masson三色染色后显微镜下观察，可见组织增厚且纤维化程度升高。超滤率下降，葡萄糖溶质转运表明腹膜通透性因CG处理而增加。所建立的腹膜透析模型可能有助于改进腹膜透析技术、提高透析效能，并延长患者生存期。

引言

腹膜透析（PD）是一种肾脏替代治疗方法。然而，PD 存在一些尚未解决的问题。例如，长期 PD 治疗可导致腹膜损伤，最终引起超滤失败并被迫终止治疗^1,2,3,4,5,6。腹膜纤维化是最严重的并发症之一^7,8。腹膜纤维化的特征是间质内细胞外基质的沉积与积聚，以及腹膜的新生血管形成和血管病变^9,10。

这些腹膜改变的主要原因是反复发作的腹膜炎以及透析液的非生物相容性，后者表现为高渗、高葡萄糖、低pH值以及葡萄糖降解产物的积聚^11,12。因此，合适的动物实验模型可帮助研究人员更好地研究腹膜在腹膜透析（PD）治疗过程中的生理和病理变化。建立动物PD模型对于改进PD技术、提高透析效能以及延长患者生存期具有重要意义。本研究旨在通过腹腔内（i.p.）注射葡萄糖酸氯己定（CG）建立PD小鼠模型，方法如先前所述^13,14。与其他PD动物模型相比，该PD小鼠模型具有操作简便、易于使用和可行性高的优点。

方案

所有小鼠实验均经义大医院／义守大学实验动物中心批准，并依照美国国家研究委员会（NRC, USA 2011）发布的《实验动物护理与使用指南》进行操作。本研究采用7至8周龄的雄性C57BL/6小鼠。

1. 化学试剂的制备

1. 通过将0.1%葡萄糖酸氯己定（CG，参见材料表）溶于15%乙醇中，制备化学刺激物。

2. 动物处理

1. 选取三只小鼠作为对照组。每隔一天进行一次腹腔注射（i.p.），每次注射0.9%生理盐水（NS），剂量为1 mL/kg，持续3周，共给药九次。
2. 选取三只小鼠作为腹膜纤维化组。通过腹腔注射给予氯己定葡糖酸盐（CG）诱导腹膜纤维化，具体方法为：将0.1% CG溶于15%乙醇中（步骤1.1），按12.5 µL/g体重剂量进行i.p.注射，每隔一天一次，持续3周，共给药九次。

3. 腹膜功能测试（改良腹膜平衡试验）

1. 配制含4.25%葡萄糖的透析液。用注射器抽取0.5 mL透析液样本，然后检测透析液样本中的葡萄糖浓度。
   注意：葡萄糖浓度根据己糖激酶/6-磷酸葡萄糖脱氢酶法测定。腹膜透析液样本采用L型Glu 2检测法，并使用生化分析仪进行检测（参见 材料表）。这是初始透析液葡萄糖浓度。
2. 通过肌肉注射 Zoletil 和赛拉嗪（按体积比 1:2 配制，参见 材料表) 以剂量 20 µL/20 gw。此外，麻醉期间应在眼部使用兽用软膏以防止干燥。
3. 腹腔内注射透析液（2 mL/20 g 体重）。
4. 30分钟后，通过脚趾夹捏反射消失评估并确认麻醉深度。然后，在腹部正中线（剑突下方）做一垂直切口，打开小鼠腹腔，用注射器收集腹腔内液体（定义为“体积1”）。随后，称量一块洁净干燥棉片的重量，将棉片置入小鼠腹腔以吸收残留的腹腔内液体。最后，再次称量棉片重量。
   注意：棉片的增重等于残留腹腔液的重量，然后换算为所得体积（比重：1 g/cm³）³；定义为“体积2”）。最终透析液体积为体积1与体积2之和。
5. 使用0.5 mL透析液样本（终末透析液）测定葡萄糖浓度。此即终末透析液葡萄糖浓度。
6. 使用公式计算净超滤量¹⁵:
   
7. 使用以下公式计算腹膜通透性¹⁵:
   

4. 腹壁肌肉和肝脏组织的制备及组织学分析

1. 处死小鼠 通过 心脏穿刺（静脉采血）^3,16.
2. 剪取腹壁组织（1 cm × 1 cm）并进行全肝切除。将小鼠腹壁和肝脏组织置于10%中性缓冲甲醛溶液中固定过夜。
3. 准备 3 µm 腹壁肌肉和肝脏的厚切石蜡切片，并按照先前发表的文献进行组织学分析¹⁷.
4. 利用形态测量法评估小鼠腹壁的壁层腹膜和肝脏表面的脏层腹膜¹⁸.
5. 使用统计与绘图软件进行统计分析（参见 材料表以均值 ± 标准差表示所有数据，并采用 t 检验进行统计学显著性分析¹⁹. 定义数值以 P < 0.05 作为显著性结果。

结果

在图1A、B中，Masson三色染色显示腹壁壁层腹膜明显增厚且纤维化更显著¹⁷，表明CG暴露组的腹膜纤维化程度较对照生理盐水组（NS）更为严重。在图2A、B中，肝脏表面的脏层腹膜同样明显增厚且纤维化更显著，从而证实CG暴露组的腹膜纤维化程度较对照生理盐水组（NS）更为严重。在图3A中，CG组的超滤率下降，而葡萄糖溶质转运表明CG诱导组的腹膜通透性增加（图3B）。

讨论

本研究通过腹腔注射CG建立小鼠腹膜透析模型，结果显示该模型出现了腹膜纤维化及功能减退，模拟了腹膜透析患者的病情。

该方案中有几个关键步骤。首先，在进行腹腔注射CG或NS时，必须使用镊子提起小鼠的腹壁皮肤，以防止穿刺导致腹腔内器官损伤。其次，在采集腹壁腹膜进行组织学分析时，应避开腹腔注射造成的损伤区域。

在多种腹膜纤维化的实验动物模型中，CG模型最为常用，因其操作简便且适应性强。Suga 等人²⁰于1995年首次报道了CG诱导的大鼠腹膜纤维化模型，采用每日腹腔注射含0.1% CG和15%乙醇的2 mL生理盐水，持续26天。IshiI 等人²¹使用C57BL/6小鼠，每日腹腔注射0.3 mL含0.1% CG和15%乙醇的生理盐水溶液，共56天，成功在小鼠中诱导出实验性硬化性包裹性腹膜炎。Nishino 等人²²使用Wistar大鼠，每日腹腔注射2 mL含0.1% CG和15%乙醇的生理盐水...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	Y F CHEMICAL CORP., 新北市，中国台湾	-
10% 中性缓冲福尔马林	Taiwan Burnett International Co., Ltd., 台北市，中国台湾	00002A
全自动生化分析仪	Hitachi Ltd., 东京，日本	Labospect Series 008	用于测定葡萄糖浓度
氯己定双葡糖酸盐溶液，20% 溶于 H2O	Sigma-Aldrich, MO, USA	C9394	用15%乙醇稀释至0.1%用于注射
乙醇	Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA	BAKR8006-05	用生理盐水稀释至15%作为工作浓度
葡萄糖（Dianeal）	Baxter International, Inc., IL, USA	FNB9896	商用透析液（4.25%）
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software, Inc., CA, US
L型Glu 2检测试剂盒	FUJIFILM Wako, 日本	461-32403
赛拉嗪 20	Juily Pharmaceutical Co., Ltd., 新北市，中国台湾	-
Zoletil 50	Virbac Laboratories, Carros, 法国	-