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方法文章

利用原子力显微镜表征活体植物器官初生细胞壁的力学特性

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DOI：

10.3791/63904

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2022年5月18日

 , 
1Laboratory of Plant Cell Growth Mechanisms, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS

本文内容

摘要

细胞壁生物力学的研究对于理解植物生长和形态发生至关重要。本方案旨在利用原子力显微镜研究幼嫩植物器官内部组织中的薄初生细胞壁。

摘要

初生细胞壁的力学性质决定了植物细胞生长的方向和速率，从而影响植物未来的大小和形态。目前已开发出多种复杂技术用于测量这些性质；然而，原子力显微镜（AFM）仍是研究细胞水平上细胞壁弹性的最便捷方法。该技术最重要的局限之一是仅能研究表面暴露或分离的活细胞。本文介绍了利用原子力显微镜研究植物体内深层组织初生细胞壁力学性质的方法。本实验方案描述了对根中细胞壁表观杨氏模量的测量，但该方法也可应用于其他植物器官。实验在液相池中进行，使用振动切片机制备的植物组织切片，从而（i）避免使用质壁分离溶液或用石蜡、树脂浸渍样品，（ii）使实验过程快速高效，（iii）防止样品脱水。根据样品切片方式的不同，可分别研究垂周壁和切向壁。在同一张切片中即可比较不同组织间力学性质的差异。本方案阐述了实验设计的基本原则、样品制备与测量中的关键问题，以及力-形变曲线的选择方法，以消除表面形貌对所测弹性模量值的影响。该方法不受样品整体尺寸限制，但对细胞尺寸较为敏感（即腔体较大的细胞难以准确检测）。

引言

植物细胞壁的机械特性决定了细胞的形状及其生长能力。例如，花粉管生长尖端的硬度低于同一花粉管非生长区域1。拟南芥分生组织上原基的形成之前，未来原基位置的细胞壁刚度会出现局部降低2,3。与主生长轴平行且生长较快的拟南芥下胚轴细胞壁，比垂直于该轴且生长较慢的细胞壁更柔软4,5。在玉米根中，细胞从分裂期向伸长期转变时，根部所有组织的弹性模量均下降。这些模量在伸长区保持较低水平，并在后期伸长区重新升高6。

尽管已有多种方法可用，但每年获得的大量关于细胞壁生物学的生化与遗传信息却很少与细胞壁的机械特性进行比较。例如，细胞壁相关基因的突变体通常表现出生长和发育的改变4,7,8，但这些变化很少从生物力学角度进行描述。造成这一现象的原因之一是在细胞和亚细胞水平上进行测量存在困难。目前，原子力显微镜（AFM）是此类分析的主要方法9。

近年来，已开展了大量基于原子力显微镜（AFM）的植物细胞壁生物力学研究。已有研究探讨了拟南芥（Arabidopsis）2,3,4,5,10,11 和洋葱12 外层组织细胞的细胞壁机械性能，以及培养细胞13,14,15 的相关特性。然而，植物表层细胞的细胞壁机械性能可能与内部组织存在差异6。此外，植物细胞受到膨压的作用而处于加压状态，使其刚性增强。为了消除膨压的影响，研究人员必须使用质壁分离溶液2,3,4,5,10,11，或将测得的数值分解为膨压和细胞壁各自的贡献部分12。前一种方法会导致样品脱水，从而改变细胞壁的厚度和性质16；而后一种方法则需要额外的测量步骤和复杂的数学处理，且仅适用于形状相对简单的细胞12。内部组织细胞壁的性质可通过冷冻切片17 或树脂浸透的植物材料切片进行评估8。然而，这两种方法均涉及样品的脱水和/或浸透过程，不可避免地会引起性质变化。分离或培养细胞所得的细胞壁性质难以与整株植物的生理状态相关联。植物细胞的培养和分离过程本身均可能影响其细胞壁的机械性能。

本文所述方法补充了上述技术。利用该方法，可检测植物发育任何阶段的任何组织的初生细胞壁。切片和原子力显微镜（AFM）观察均在液体环境中进行，从而避免了样品脱水。由于细胞被切割，细胞膨压问题也得以解决。本方案以玉米和黑麦根为研究对象，但任何适合振动切片机切片的样品均可采用此方法进行检测。

本文所述的原子力显微镜（AFM）研究采用力体积成像技术进行。不同仪器对该方法的命名可能不同，但其基本原理相同：通过对悬臂（或样品）施加正弦波或三角波运动，使每个分析点达到特定的加载力，同时记录悬臂的偏转18。该方法获得的结果包含样品表面的形貌图像以及一系列力-距离曲线。每条曲线可用于计算特定位置的形变、刚度、杨氏模量、黏附力和能量耗散。类似的数据也可通过接触模式扫描后逐点进行力谱分析获得19，但该方法耗时更长。

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方案

1. 原子力显微镜测量的样品制备

  1. 植物材料：用 0.35% 的 NaOCl 溶液对玉米（Zea mays L.）和黑麦（Secale cereale L.）种子进行表面灭菌 10 分钟，用蒸馏水冲洗 3 次，然后分别在黑暗条件下 27 °C 水培培养 4 天和 2 天。实验使用初生根。
  2. 振动切片前溶液与样品的准备
    1. 使用微波炉将 3%（w/w）低熔点琼脂糖溶于水中，制备用于根组织包埋的琼脂糖溶液。
      注意：所有实验均在水中进行。若研究需要缓冲液或其他类型的培养基，建议在琼脂糖制备、切片过程以及原子力显微镜（AFM）液相池中均使用相同的介质，以避免对样品造成损伤。
    2. 在培养皿（直径 = 35 mm）底部倒入一层约 4 mm 厚的熔融 3% 琼脂糖，并稍作冷却，以防对样品造成热损伤。
    3. 将三到四个长约 5 mm 的待测植物器官小段水平放置于琼脂糖表面。
      注意：样品应半浸入但不完全沉入琼脂糖层中。若样品未浸入，切片时可能从琼脂糖中脱出；若样品沉至底部，则会过于靠近切片边缘，不利于后续操作。
    4. 当第一层琼脂糖表面形成一层薄的半固态膜（约 30–60 秒）时，小心地在其上方倒入第二层琼脂糖。
      注意：底层琼脂糖不应完全凝固，否则在后续操作中两层可能分离。
    5. 待琼脂糖完全凝固后，切下包含样品的琼脂糖块，并将其修整为六边形截锥体，以确保后续切片过程中的稳定性（图 1A）。
      注意：样品在该琼脂糖块内可根据所需切片类型进行垂直或水平定向。修块时，样品周围应保留 2–3 mm 厚的琼脂糖。这样，样品切片将由 3% 琼脂糖层固定，有助于后续的固定操作（图 1B）。
  3. 使用振动切片机进行切片
    1. 用氰基丙烯酸酯胶水将琼脂糖块粘附于振动切片机载物台上。将载物台放入切片机中，使锥体的一个角正对切片刀刃。向振动切片机槽中加入水。
    2. 设定切片参数（切片厚度、刀片速度和振动频率），并开始切片。
      注意：切片厚度应控制在 200 至 400 µm 之间。过薄的切片可能影响机械性能测定的准确性，而过厚的切片则易发生断裂。黑麦和玉米根的切片采用 1.3 mm·s-1 的刀片速度和 90 Hz 的振荡频率。
    3. 用细毛笔将切片从水槽中转移至载玻片上，并在切片上滴加一滴水以防止干燥。在光学显微镜下检查切片质量。
      注意：倾斜切片不能用于弹性模量的测量。细胞壁必须垂直于切片平面，否则在原子力显微镜探针作用下可能发生弯曲或屈曲。
  4. 为原子力显微镜测量固定切片（图 1B）
    1. 用移液器在培养皿盖底部倒入一层熔融的 1%（w/w）琼脂糖（约 1 mL）。
      注意：确保培养皿盖的侧壁不会阻碍探针接近样品。琼脂糖层厚度应为 1 mm，并完全覆盖盖子底部。
    2. 待 1% 琼脂糖凝固后，用滤纸轻轻接触切片边缘以吸除多余水分。
      注意：切勿用滤纸直接接触植物切片，以免损伤样品或导致其完全干燥。
    3. 用毛笔小心地将切片从载玻片转移至培养皿盖中心位置。使用 20 µL 移液器，在切片周围小心地加入 1% 琼脂糖（图 1B）。
      注意：1% 琼脂糖不应接触样品本身，仅用于覆盖固定植物样品的 3% 琼脂糖层边缘。1% 琼脂糖应在该 3% 琼脂糖层边缘形成小丘状结构。过大的突起可能阻碍悬臂梁接近样品。
    4. 向含有固定切片的培养皿盖中加入用于原子力显微镜测量的水或其他溶液。

2. 原子力显微镜的准备与校准

注意：原子力显微镜的力-体积法可生成在研究区域每个点上获得的空间分辨力-距离曲线阵列。在接触模式下获取力-体积模式的所有参数（如悬臂刚度、IOS等）。先前已有文献描述过其他厂商仪器的类似操作流程10,20。

  1. 选择合适的悬臂梁类型。
    注意：悬臂梁的刚度必须与样品的刚度相当21。若悬臂梁比样品硬得多，则其偏转程度很小；而若悬臂梁过软，则无法充分变形样品。典型的共振频率应足以在液体中驱动悬臂梁振动（即至少为数十 kHz）。接触面积应远小于细胞壁的尺寸，因为在杨氏模量计算中，所研究的样品被假定为无限半空间。以下悬臂梁用于黑麦和玉米根部：尖锐型悬臂梁，典型共振频率为 60 kHz，平均弹簧常数为 1.5 N·m-1，尖端曲率半径为 10 nm；或球形悬臂梁，典型共振频率为 75 kHz，平均弹簧常数为 2.8 N·m-1，尖端曲率半径为 150 nm。
  2. 开启原子力显微镜（AFM）设备及相关软件（材料表）。将悬臂梁安装至液体池用探针夹持器上。在探针尖端滴加一滴液体，以防止浸入液体时在尖端形成气泡。
    注意：若出现气泡，可用精密擦拭纸去除液体，然后重新滴加一滴新液体。
  3. 将探针夹持器安装到扫描头上。
  4. 将硬质样品（新鲜载玻片）放入培养皿盖中。倒入液体，确保完全覆盖载玻片。将扫描头置于载物台上，并抬升样品，使液体浸没悬臂梁。
  5. 在下拉菜单的工具中选择探头选项卡。确保已选中用于液体池的扫描头。
  6. 点击对准按钮以打开激光对准窗口。点击相机按钮以打开光学显微镜窗口。利用AFM头部的调节螺丝和光学显微镜窗口进行定位，将激光对准悬臂梁尖端。
  7. 在程序主窗口的下拉菜单中选择半接触模式。
  8. 打开共振选项卡，并在探针菜单中选择所使用的悬臂梁类型。点击自动按钮以确定共振频率。
    注意：如果所用悬臂梁未列于菜单中，请打开工具 > 探针护照（Probe Passport），创建新文件，输入悬臂梁参数并保存，然后在探针下拉菜单中选择该探针。
  9. 在程序主窗口的下拉菜单中选择接触模式。
  10. 点击N_Force Cal按钮以打开悬臂梁校准窗口。选择所使用的悬臂梁，点击扫描按钮，然后点击频谱测量（Spect Meas）按钮，通过热调谐法（thermal-tune procedure）确定悬臂梁的弹簧常数。完成后关闭窗口。
  11. 将设定点（SetPoint）设置为 1 nA。打开接近选项卡，点击着陆（Landing）按钮，使探针接近样品。
  12. 打开扫描选项卡。将扫描速率设为 0.5 Hz。点击区域（Area）按钮，将扫描尺寸设为 10 µm × 10 µm，扫描点数设为 256 × 256。点击运行（Run）按钮，扫描约20行以检查玻璃表面是否存在污染。点击停止（Stop）按钮结束扫描，同时保留已采集数据。
  13. 打开力曲线选项卡。将回撤和接近的参数分别设为 500 nm 和 -100 nm。
  14. 在下拉菜单选择帧（Select Frame）中选择最后一次扫描，以观察表面形貌。
  15. 在玻璃表面找到一个洁净区域，标记应采集力-形变曲线的位置，点击运行（Run）按钮获取曲线。在扫描区域的不同位置记录三至五条力曲线。
  16. 点击数据（Data）按钮以打开分析窗口，并选择包含力-形变曲线的帧。
  17. 点击成对标记（Pair Markers）按钮，标定回撤曲线的线性部分，以计算DFL信号与位移的比值，即逆光灵敏度（IOS，nA nm-1）或偏转灵敏度。
  18. 对所有记录的曲线重复步骤 2.17，并记录所有计算得到的DFL信号与位移比值。这些数值应基本一致。
  19. 关闭分析窗口，点击接近选项卡，然后点击移除（Remove）按钮，将探针从样品表面撤回。

3. 数据采集

  1. 使用光学显微镜将样品引导至原子力显微镜（AFM）悬臂下方。点击 Approach 选项卡，然后点击 Landing 按钮，以 1 nA 的SetPoint 在接触模式下接近样品。
  2. 点击 Scanning 选项卡，然后点击 Area 按钮。选择 70 µm × 70 µm 的Area Size 进行扫描。
  3. 点击 Move Probe 按钮，并通过移动扫描器检查整个扫描区域。根据扫描器突出的程度，找到样品表面的最高点。
  4. 打开 Approach 选项卡，然后点击 Remove 按钮，使探针从样品表面撤回。以最高点为目标，再次点击 Landing 按钮接近样品。随后，点击 Move Probe 按钮并移动扫描器，重新检查表面。扫描区域内任何位置都不应要求扫描器完全抬升。
    注意：理想情况下，扫描器的 z 轴范围应超过样品的高度差。然而，若扫描区域中有少量点超出扫描器能力范围，仍可接受，但此类点不应过多。若存在大面积无法被扫描器触及的区域，可能导致扫描中止。
  5. 将扫描Rate 设置为 0.5 Hz。将扫描Size 设置为 70 µm × 70 µm，扫描Point 设置为 64 × 64。点击 Run 按钮开始扫描，以检查样品表面及其可能存在的琼脂糖污染情况。
    注意：若样品含有较大腔室的细胞，可减小扫描区域尺寸，或调整扫描位置，使扫描区域内包含更多的细胞壁结构。
  6. 点击主窗口顶部的 On 按钮，关闭反馈回路。
  7. 在程序主窗口的下拉菜单中选择 HDPlus 模式（力体积法），此时将弹出一个附加窗口（HD 窗口）。
  8. 在主程序窗口中将 SetPoint 设置为 0.1 nA。
  9. 在 HD 窗口的 Main 选项卡中，设置适合所研究样品的扫描参数（悬臂正弦运动的振幅和频率）。
    注意：每种类型的样品和悬臂均需选择相应的扫描参数，需进行一些预实验确定。对于玉米或黑麦根部样品，使用尖锐或球形探针，振幅为 400 nm，频率为 300 Hz。
  10. 打开 HD 窗口中的 Noises 选项卡，并输入悬臂的共振频率。
  11. 打开 HD 窗口的 Quant 选项卡，输入IOS、悬臂Stiffness 以及探针半径和角度。根据探针几何形状选择用于计算的接触模型。
    注意：DMT 模型考虑了探针与样品之间存在的粘附力，在力学生物学中应用最为广泛21。
  12. 打开 HD 窗口的 Scan 选项卡，并选择要记录的信号。选择信号记录的方向。勾选 Force volume 选项框，以记录所有力曲线。
    注意：应同时在正向和反向记录弹性模量信号，以提供更多的数据点用于计算。
  13. 点击主程序窗口顶部的 Off 按钮，开启反馈回路。
  14. 在主 HD 窗口中点击 PhaseCorr 按钮，以校正光学系统的灵敏度。
  15. 主 HD 窗口的 vs Time 选项卡实时显示 DFL 信号随时间变化的函数；选择该函数中用于基线水平确定以及拟合接触模型以进行后续计算的部分。
  16. 在程序主窗口中将扫描Point 值设置为 256 × 256，扫描Rate 设置为 0.2 Hz，然后点击 Run 按钮开始扫描样品。
  17. 扫描结束后，点击主窗口顶部的 On 按钮，关闭反馈回路。
  18. 在下拉菜单中选择 Contact 模式，打开 Approach 选项卡，点击 Remove 按钮使探针从样品表面撤回。
  19. 点击 Data 按钮，打开分析软件并保存输出结果。
  20. 在每日测量结束时，从探头头部取下悬臂探针 holder，并用超纯水多次小心冲洗。每次冲洗后均使用精密擦拭纸吸除水分。

4. 数据评估与后处理

注意：不要依赖自动计算的弹性模量值。由于表面高度变化较大，应剔除大量伪影曲线。

  1. 在分析软件中打开已保存的文件。
  2. 选择 HDForceVolume 帧。
  3. 按住 Ctrl 键，并选择在同一扫描方向上获得的一个可视帧。点击 Load External Map 按钮，以查看细胞壁的位置。
    注意：任何信号图均可用作可视帧，但使用 DFL 信号图（不同仪器可能将其称为偏转信号或误差信号）可能是最简便的方法。
  4. 在 Main 选项卡中，检查 InvOptSens (IOS) 和悬臂梁的 Stiffness 值。
  5. 打开 Additional 选项卡，检查探针参数和接触模型。
  6. 在可视帧的细胞壁上点击多个点，并仅选择那些能被模型良好拟合的曲线。详见代表性结果部分。
  7. 记录所获得的数值。

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结果

通过所述方法在黑麦和玉米根上获得的典型弹性模量和DFL图谱以及力曲线如图2所示。图2A展示了在黑麦初生根横切面上获得的弹性模量和DFL图谱。模量图中的白色区域（图2A，左）对应于由于扫描器在z方向达到极限而导致的杨氏模量错误高估。该图像不适合作为外部图谱用于进一步筛选满意的力曲线。而右侧所示的DFL信号图（偏转/误差图）（图2A，右）则更适用于此目的。

玉米根横切面和纵切面的模量图如图2B、C所示。当扫描器在尝试到达样品底部时已完全伸展，可能导致测量结果错误，甚至扫描中断（图2C的上部）。有时，在接触模式下获得良好扫描后，仪器在切换至力体积模式时会突然完全收缩扫描器，并发出警报，提示已达到z方向...

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讨论

初生细胞壁的力学性质决定了植物细胞生长的方向和速率，从而决定了植物未来的大小和形态。本文介绍的基于原子力显微镜（AFM）的方法补充了现有用于研究植物细胞壁性质的技术，能够用于检测属于植物内部组织的细胞壁弹性。利用该方法，研究人员绘制了生长中玉米根部不同组织细胞壁的力学性质图谱，并基于这些性质构建了数学模型6。模拟的根在施加模拟膨压的压力后表现出线性尺寸的变化，这些变化的范围与方向与在质壁分离介质中新鲜离体根所表现出的变化相同但方向相反6。

样品制备对本实验方案至关重要。在整个制备过程中应避免样品干燥。待切片植物材料的正确放置是一个关键问题；细胞壁必须严格垂直于未来的扫描平面。否则，由于细胞壁发生弯曲或屈曲，将获得不理想的力-形变曲线。琼脂糖包埋的切片应使用额外的琼脂糖紧密固定（图 2B）。但需注意，额外的琼脂糖不得接触样品本身，否则将测得琼脂糖的力学性质而非样品性质。本实验方案中最重要的步骤是对获得的力曲线进行筛选。即...

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致谢

我们感谢俄罗斯圣彼得堡国立大学的 Dmitry Suslov 博士和俄罗斯联邦喀山科学中心俄罗斯科学院鞑靼农业科学研究所的 Mira Ponomareva 教授，分别为本研究提供了玉米和黑麦种子。本研究所述方法是在俄罗斯科学基金会项目 No. 18-14-00168（授予 LK）的框架内开发的。部分工作（所呈现结果的获取）由 AP 完成，并得到了俄罗斯科学院喀山科学中心政府任务的财政支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低熔点琼脂糖HeliconB-5000-0.1用于样品固定
刷子--用于切片移动
悬臂梁NanoTools, GermanyNT_B150_v0020-5型号：Biosphere B150-FM
悬臂梁NT-MDT, RussiaFMG01/50型号：FMG01
氰基丙烯酸酯粘合剂--用于振动切片
载玻片Heinz Herenz1042000用于振动切片和原子力显微镜校准
ImageAnalysis P9 软件NT-MDT, Russia-用于数据分析
Leica DM1000 正置荧光显微镜Leica Biosystems, Germany11591301用于切片检查
NaOCl--用于种子灭菌
Nova PX 3.4.1 软件NT-MDT, Russia-用于实验操作
配备 HD 控制器的 NTEGRA Prima 显微镜NT-MDT, Russia-用于原子力显微镜检测和数据采集
35 mm 培养皿Thermo Fisher Scientific153066用于样品固定
1000 µL 移液器吸头Thermo Fisher Scientific4642092-
2–20 µL 移液器吸头Thermo Fisher Scientific4642062-
超纯水---
Leica VT 1000S 振动切片机Leica Biosystems, Germany1404723512用于样品切片

参考文献

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