细胞壁生物力学的研究对于理解植物生长和形态发生至关重要。本方案旨在利用原子力显微镜研究幼嫩植物器官内部组织中的薄初生细胞壁。
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本文内容
摘要
摘要
初生细胞壁的力学性质决定了植物细胞生长的方向和速率，从而影响植物未来的大小和形态。目前已开发出多种复杂技术用于测量这些性质；然而，原子力显微镜（AFM）仍是研究细胞水平上细胞壁弹性的最便捷方法。该技术最重要的局限之一是仅能研究表面暴露或分离的活细胞。本文介绍了利用原子力显微镜研究植物体内深层组织初生细胞壁力学性质的方法。本实验方案描述了对根中细胞壁表观杨氏模量的测量，但该方法也可应用于其他植物器官。实验在液相池中进行，使用振动切片机制备的植物组织切片，从而（i）避免使用质壁分离溶液或用石蜡、树脂浸渍样品，（ii）使实验过程快速高效，（iii）防止样品脱水。根据样品切片方式的不同，可分别研究垂周壁和切向壁。在同一张切片中即可比较不同组织间力学性质的差异。本方案阐述了实验设计的基本原则、样品制备与测量中的关键问题，以及力-形变曲线的选择方法，以消除表面形貌对所测弹性模量值的影响。该方法不受样品整体尺寸限制，但对细胞尺寸较为敏感（即腔体较大的细胞难以准确检测）。
引言
植物细胞壁的机械特性决定了细胞的形状及其生长能力。例如，花粉管生长尖端的硬度低于同一花粉管非生长区域1。拟南芥分生组织上原基的形成之前，未来原基位置的细胞壁刚度会出现局部降低2,3。与主生长轴平行且生长较快的拟南芥下胚轴细胞壁，比垂直于该轴且生长较慢的细胞壁更柔软4,5。在玉米根中，细胞从分裂期向伸长期转变时，根部所有组织的弹性模量均下降。这些模量在伸长区保持较低水平，并在后期伸长区重新升高6。
尽管已有多种方法可用，但每年获得的大量关于细胞壁生物学的生化与遗传信息却很少与细胞壁的机械特性进行比较。例如，细胞壁相关基因的突变体通常表现出生长和发育的改变4,7,8，但这些变化很少从生物力学角度进行描述。造成这一现象的原因之一是在细胞和亚细胞水平上进行测量存在困难。目前，原子力显微镜（AFM）是此类分析的主要方法
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方案
1. 原子力显微镜测量的样品制备
- 植物材料：用 0.35% 的 NaOCl 溶液对玉米（Zea mays L.）和黑麦（Secale cereale L.）种子进行表面灭菌 10 分钟，用蒸馏水冲洗 3 次，然后分别在黑暗条件下 27 °C 水培培养 4 天和 2 天。实验使用初生根。
- 振动切片前溶液与样品的准备
- 使用微波炉将 3%（w/w）低熔点琼脂糖溶于水中，制备用于根组织包埋的琼脂糖溶液。
注意：所有实验均在水中进行。若研究需要缓冲液或其他类型的培养基，建议在琼脂糖制备、切片过程以及原子力显微镜（AFM）液相池中均使用相同的介质，以避免对样品造成损伤。 - 在培养皿（直径 = 35 mm）底部倒入一层约 4 mm 厚的熔融 3% 琼脂糖，并稍作冷却，以防对样品造成热损伤。
- 将三到四个长约 5 mm 的待测植物器官小段水平放置于琼脂糖表面。
注意：样品应半浸入但不完全沉入琼脂糖层中。若样品未浸入，切片时可能从琼脂糖中脱出；若样品沉至底部，则会过于靠近切片边缘，不利于后续操作。 - 当第一层琼脂糖表面形成一层薄的半固态膜（约 30–60 秒）时，小心地在其上方倒入第二层琼脂糖。
注意：底层琼脂糖不应完全凝固，否则在后续操作中两层可能分离。 - 待琼脂糖完全凝固后，切下包含....
- 使用微波炉将 3%（w/w）低熔点琼脂糖溶于水中，制备用于根组织包埋的琼脂糖溶液。
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结果
通过所述方法在黑麦和玉米根上获得的典型弹性模量和DFL图谱以及力曲线如图2所示。图2A展示了在黑麦初生根横切面上获得的弹性模量和DFL图谱。模量图中的白色区域（图2A，左）对应于由于扫描器在z方向达到极限而导致的杨氏模量错误高估。该图像不适合作为外部图谱用于进一步筛选满意的力曲线。而右侧所示的DFL信号图（偏转/误差图）（图2A，右）则更适用于此目的。
玉米根横切面和纵切面的模量图如图2B、C所示。当扫描器在尝试到达样品底部时已完全伸展，可能导致测量结果错误，甚至扫描中断（图2C的上部）。有时，在接触模式下获得良好扫描后，仪器在切换至力体积模式时会突然完全收缩扫描器，并发出警报，提示已达到z方向.......
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讨论
初生细胞壁的力学性质决定了植物细胞生长的方向和速率，从而决定了植物未来的大小和形态。本文介绍的基于原子力显微镜（AFM）的方法补充了现有用于研究植物细胞壁性质的技术，能够用于检测属于植物内部组织的细胞壁弹性。利用该方法，研究人员绘制了生长中玉米根部不同组织细胞壁的力学性质图谱，并基于这些性质构建了数学模型6。模拟的根在施加模拟膨压的压力后表现出线性尺寸的变化，这些变化的范围与方向与在质壁分离介质中新鲜离体根所表现出的变化相同但方向相反6。
样品制备对本实验方案至关重要。在整个制备过程中应避免样品干燥。待切片植物材料的正确放置是一个关键问题；细胞壁必须严格垂直于未来的扫描平面。否则，由于细胞壁发生弯曲或屈曲，将获得不理想的力-形变曲线。琼脂糖包埋的切片应使用额外的琼脂糖紧密固定（图 2B）。但需注意，额外的琼脂糖不得接触样品本身，否则将测得琼脂糖的力学性质而非样品性质。本实验方案中最重要的步骤是对获得的力曲线进行筛选。即.......
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致谢
我们感谢俄罗斯圣彼得堡国立大学的 Dmitry Suslov 博士和俄罗斯联邦喀山科学中心俄罗斯科学院鞑靼农业科学研究所的 Mira Ponomareva 教授，分别为本研究提供了玉米和黑麦种子。本研究所述方法是在俄罗斯科学基金会项目 No. 18-14-00168（授予 LK）的框架内开发的。部分工作（所呈现结果的获取）由 AP 完成，并得到了俄罗斯科学院喀山科学中心政府任务的财政支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | Helicon | B-5000-0.1 | 用于样品固定 |
| 刷子 | - | - | 用于切片移动 |
| 悬臂梁 | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | 型号：Biosphere B150-FM |
| 悬臂梁 | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | 型号：FMG01 |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | - | - | 用于振动切片 |
| 载玻片 | Heinz Herenz | 1042000 | 用于振动切片和原子力显微镜校准 |
| ImageAnalysis P9 软件 | NT-MDT, Russia | - | 用于数据分析 |
| Leica DM1000 正置荧光显微镜 | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | 用于切片检查 |
| NaOCl | - | - | 用于种子灭菌 |
| Nova PX 3.4.1 软件 | NT-MDT, Russia | - | 用于实验操作 |
| 配备 HD 控制器的 NTEGRA Prima 显微镜 | NT-MDT, Russia | - | 用于原子力显微镜检测和数据采集 |
| 35 mm 培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 用于样品固定 |
| 1000 µL 移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| 2–20 µL 移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| 超纯水 | - | - | - |
| Leica VT 1000S 振动切片机 | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | 用于样品切片 |
参考文献
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A.
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