将质粒DNA电穿孔导入骨骼肌是一种在小鼠中调节基因表达而不影响肌肉收缩功能的有效方法。
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摘要
摘要
通过质粒电穿孔法瞬时调控小鼠骨骼肌基因表达，是评估正常与病理生理状态的有用工具。通过过表达或敲低目的基因，研究人员能够操控特定的分子事件，从而更深入地理解影响肌肉质量、肌肉代谢和收缩功能的机制。此外，编码荧光标签的DNA质粒经电穿孔导入后，可使研究人员在活体（in vivo）条件下检测骨骼肌中蛋白质亚细胞定位的变化。对骨骼肌的一项关键功能评估是肌肉收缩力的测定。在本实验方案中，我们证明在质粒DNA注射、电穿孔及基因表达调控之后，仍可进行完整的肌肉收缩功能研究。本操作指南的目的是逐步演示将DNA质粒电穿孔导入小鼠骨骼肌的方法，以促进其在胫骨前肌和趾长伸肌肌纤维中的摄取与表达，同时证明注射和电穿孔操作不会损害骨骼肌的收缩功能。
引言
质粒DNA电穿孔导入骨骼肌 体内 是通过调控多种生理和病理生理条件下基因表达来评估骨骼肌生理学及分子信号变化的重要工具1,2,3,4,5,6,7,8,9早在1990年，Wolff 等人就已证明将基因转入骨骼肌的实验可行性，其中无需电穿孔即可成功转移RNA和DNA，并且荧光素酶的表达至少维持了2个月。10仅通过注射实现的转染效率相对较低，这一问题较为突出。Aihara 和 Miyazaki 在 1998 年通过将 pCAGGS-IL-5 质粒构建体电穿孔导入胫骨前肌（TA），并检测血清中 IL-5 的表达，证明了电穿孔可显著提高基因转导效率。11自那时以来，许多研究已针对不同DNA浓度、体积及电穿孔参数的效率进行了考察，以确保实现最高的基因转导效率。Mir 等人测试了多种电穿孔参数，包括电压、脉冲次数、脉冲持续时间与频率，以及DNA浓度，结果表明较高的电压、更多的脉冲次数和更高的DNA浓度均有助于提高电穿孔效率12较高的电穿孔电压存在一个主要缺陷：尽管它有助于增加DNA进入肌纤维的摄取量，但同时也会造成肌肉损伤，从而可能干扰实验结果。Schertzer等人的研究表明，在电穿孔后3天，200 V的电穿孔电压导致约50%的肌纤维受损，而50 V时仅有10%的肌纤维受损。13我们已综合考虑了影响高效DNA转导与肌肉损伤的相关变量，发现每厘米卡钳宽度施加125 V的电压足以实现有效的基因转导。
电穿孔后对肌纤维横截面积和整块肌肉收缩功能的分析，是评估基因调控引起肌肉大小和功能变化的方法中的重要环节。我们及其他研究者此前已证实，单独电穿孔导入对照载体不会导致肌纤维面积减小。在这些研究中，绿色荧光蛋白（EGFP）构建体可作为DNA转染的有效荧光指示剂13,14. 许多研究已对此进行了调查 原位 电穿孔后TA的收缩力表现出不同结果。一项研究表明，75 V/cm的电穿孔在电穿孔后3天导致强直收缩力下降约30%，而在电穿孔后7天，强直收缩力恢复至对照水平；而50 V/cm的电穿孔未对收缩力造成影响。13,15另一项研究表明，在180 V/cm电穿孔后3小时，强直收缩力下降了30%，但在7天后恢复至假手术组的收缩力水平16.
在以下详细步骤中，我们展示了将 pcDNA3-EGFP 质粒注射并电穿孔转染至小鼠胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）中的方法。我们同时证明该方法不影响 EDL 整块肌肉的收缩功能。本实验的目的是展示一种可实现质粒高效导入肌纤维且不导致功能丧失的技术。
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方案
所有涉及动物的实验均在宾夕法尼亚州立大学医学院进行，并经宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会批准，实验过程遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版中规定的伦理标准。本实验采用12周龄雌性C57BL/6小鼠。所有手术器械在实验前均经过高压灭菌以确保无菌。
1. 胫骨前肌和趾长伸肌注射/电穿孔准备
注意：TA 和 EDL 注射/电穿孔制备的步骤相同。
- 实验前，将表达质粒构建体纯化至浓度为 1 µg/µL，并溶于无菌 PBS 中。本实验采用市售的无内毒素质粒纯化试剂盒，对 pcDNA3-EGFP（GFP）或 pcDNA3 空载体（对照）进行纯化。
- 计算质粒浓度，以确保合适的注射体积（TA 注射量为 50 µg DNA 溶于 50 µL 无菌 PBS；EDL 注射量为 10 µg DNA 溶于 10 µL 无菌 PBS），并分装样品。
- 使用选择旋钮设置电穿孔仪参数，按下旋钮进行参数选择：模式 - LV，电压 - 12.5 V/mm（注射时可调整），脉冲时长 - 20 ms，脉冲次数 - 5，间隔时间 - 200 ms，极性 - 单极。
- 使用异氟烷气体麻醉小鼠。将小鼠置于含 5% 异氟烷的诱导箱中，通过镊子夹趾无反应确认达到手术麻醉深度后，将异氟烷浓度降至 2% 维持剂量。随后将小鼠转移至 37 °C 循环水浴板上的鼻罩装置中，继续后续操作。
- 使用小型电推剪去除双侧后肢毛发。交替使用 70% 乙醇和碘伏对下肢进行擦拭，以消毒注射区域。
2. TA 注射/电穿孔
- 将小鼠置于仰卧位，在后肢外侧透过皮肤定位可见的胫骨前肌（TA）肌腱。使用带有可拆卸30 G针头的50 µL微量注射器，将针头插入肌腱接合部上方1-2 mm处，以约5°的浅角进针，直至针尖到达肌肉的上端。
注意：目标是将液体注射至肌肉中段。 - 在缓慢沿注射路径回撤针头的同时，缓慢推动注射器推杆，注入50 µL质粒溶液。肌肉应出现肿胀。
- 设置计时器为1分钟，并测量TA肌所在位置后肢的厚度。根据小鼠体型不同，该厚度通常为5-10 mm。将卡钳式电极调整至所测得的厚度，并将电穿孔仪的电压设定为12.5 V/mm。
- 1分钟后，将卡钳式电极夹住后肢，电极应贴合但不过紧。施加5次方波脉冲，每次持续20 ms，间隔200 ms（每次脉冲应引起肌肉抽动）。
- 用对照载体对另一侧肢体重复上述操作。
- 将小鼠从麻醉状态中取出，置于设定为37 °C的加热垫上使其恢复。待其完全苏醒后，将其放回笼中。
3. EDL 注射/电穿孔
- 将小鼠仰卧固定，通过视觉观察和轻柔触诊定位胫骨前嵴。
- 使用解剖刀，在胫骨前嵴外侧、膝关节下方5 mm至趾长伸肌（TA）肌腱结合部上方2 mm处，沿皮肤做一浅层切口。
- 使用小型剪刀钝性分离筋膜，暴露趾长伸肌（TA）肌肉。
- 再次使用剪刀进行钝性解剖，通过将TA肌肉向外侧轻轻牵拉，将其与胫骨分离，从而暴露趾长伸肌（EDL）。在操作过程中可使用小型弯头镊子将TA肌肉保持在远离EDL的位置。
- 使用带有可拆卸30 G针头的50 µL微量注射器，将针头沿纵向插入趾长伸肌（EDL），直至针尖到达肌肉近端顶端。
- 一边缓慢回撤针头，一边缓慢推动注射器活塞，沿注射路径注入10 µL质粒溶液（肌肉应出现肿胀）。
- 设置计时器为1分钟，并测量EDL处腿部的厚度。根据小鼠体型不同，该值通常为5–10 mm。将卡钳电极调节至测得的厚度，并将电穿孔仪电压设定为12.5 V/mm。
- 1分钟后，将卡钳电极置于下肢两侧，电极应贴合但不过紧。施加5次方波脉冲，每次持续20 ms，间隔200 ms（每次脉冲应引起肌肉抽动）。
- 使用一次性4/0不可吸收尼龙缝线关闭切口。
- 对另一侧肢体重复上述操作，或保留该侧肢体不做处理作为绝对对照。
- 将小鼠从麻醉状态中移出，放置于设定为37 °C的加热垫上恢复。手术后立即皮下注射适当的镇痛剂 ，并在术后12–24小时再次给药。待小鼠恢复意识后，将其放回笼中。
注：先前研究表明，电穿孔后趾长伸肌（TA）立即出现肌肉收缩功能下降，且收缩功能在术后3天内逐渐恢复13,15。因此，对TA和EDL肌肉的组织学、蛋白表达或肌肉收缩功能分析应在电穿孔后3–10天进行。已有研究观察到EGFP的表达可持续长达术后3周13。
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结果
电穿孔技术可促进骨骼肌中的基因转移，是评估肌肉生理变化的一种有用方法。我们已展示了一种详细、逐步的操作流程，可用于实现胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）中高效的基因转导。转染效率的差异由多种变量引起，这些变量包括电穿孔参数（脉冲次数、电压、脉冲持续时间等）、基因构建体的大小以及注射DNA的浓度/体积。我们先前已证明，采用125 V/cm电压、每次脉冲持续20 ms、间隔200 ms、共5次脉冲的电穿孔参数，足以在TA肌肉中实现高效的基因转移14。在本研究中，我们还证明，在实验后3天，对EDL肌肉进行DNA注射和电穿孔操作不会导致肌肉收缩功能的丧失。
为了可视化基因转移，将 pcDNA3-EGFP 或 pcDNA3（对照）质粒通过电穿孔法导入小鼠胫骨前肌（TA）或趾长伸肌（EDL）。操作后 3 天，小心分离 TA 或 EDL 肌肉，置于最佳切割温度（OTC）包埋介质中，并在液氮冷却的异戊烷（2-甲基丁烷）中快速冷冻，方法如前所述14,
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讨论
体内基因转移结合电穿孔技术是一种用于调控肌肉中蛋白表达的有用且相对简便的工具。我们已展示了在趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）中实现高效基因转移所需的操作步骤，并证实了术后仍可对EDL肌肉进行可行的收缩功能测定。该技术无需使用更复杂的病毒载体，且能够在单块肌肉内直接比较转染与未转染肌纤维的横截面积。该方法的一个局限性在于质粒构建物的摄取效率并非完全均一，部分肌纤维仍处于未转染状态。
上述方法不仅限于表达载体的电穿孔。我们先前已证明，通过使用siRNA或shRNA载体在体内进行相同操作，也可实现蛋白质的敲低in vivo14。此外，还可利用报告基因载体检测靶基因的转录活性2,4,22。这些工具可在单个骨骼肌中同时调控多种蛋白质，并使研究者能够方便地检测转录水平的变化。骨骼肌还可共转染表达载体或sh/siRNA载体与...
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披露
B.A.H. 和 D.L.W. 声称不存在利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-0 尼龙缝线（不可吸收） | Ethicon | 662G | 用于关闭皮肤切口的缝线 |
| 50µl Hamilton 注射器 | Hamilton | 80501 | 微量注射器 |
| C57BLl/6NHsd 小鼠 | Envigo | 044 | 12 周龄雌性小鼠，用于实验 |
| 卡尺电极 | BTX | 45-0102 | 1.0 cm × 1.0 cm 不锈钢电极 |
| 动态肌肉控制数据采集/分析系统 | Aurora Scientific | 605A | 用于肌肉收缩力测量与分析的软件 |
| ECM 830 电穿孔系统 | BTX | 45-0662 | 电穿孔仪 |
| EndoFree 质粒大提纯化试剂盒 | Qiagen | 12362 | 质粒纯化试剂盒 |
| 超窄剪刀 | Fine Science Tools | 14088-10 | 用于钝性解剖的剪刀 |
| 力传感器 | Aurora Scientific | 407A | 用于测量趾长伸肌（EDL）产生的力量 |
| 微型蚊式止血钳 | Fine Science Tools | 13010-12 | 用于缝合的止血钳 |
| pcDNA3.1 哺乳动物表达载体 | Fisher Scientific | V79020 | 对照载体 |
| pcDNA3-EGFP 表达质粒 | Addgene | 13031 | 用于表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒 |
| Semken 弯头镊 | Fine Science Tools | 11009-13 | 用于手术操作的镊子 |
| 不锈钢手术刀片，10 号 | Becton Dickinson | 37 1210 | 手术刀片 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋介质 | VWR | 25608-930 | 组织学冷冻包埋介质 |
| 麦胚凝集素-德克萨斯红（Wheat Germ Agglutinin-Texas Red） | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | 用于肌肉横切面细胞膜染色 |
参考文献
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