将质粒DNA电穿孔导入骨骼肌是一种在小鼠中调节基因表达而不影响肌肉收缩功能的有效方法。
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摘要
摘要
通过质粒电穿孔法瞬时调控小鼠骨骼肌基因表达，是评估正常与病理生理状态的有用工具。通过过表达或敲低目的基因，研究人员能够操控特定的分子事件，从而更深入地理解影响肌肉质量、肌肉代谢和收缩功能的机制。此外，编码荧光标签的DNA质粒经电穿孔导入后，可使研究人员在活体（in vivo）条件下检测骨骼肌中蛋白质亚细胞定位的变化。对骨骼肌的一项关键功能评估是肌肉收缩力的测定。在本实验方案中，我们证明在质粒DNA注射、电穿孔及基因表达调控之后，仍可进行完整的肌肉收缩功能研究。本操作指南的目的是逐步演示将DNA质粒电穿孔导入小鼠骨骼肌的方法，以促进其在胫骨前肌和趾长伸肌肌纤维中的摄取与表达，同时证明注射和电穿孔操作不会损害骨骼肌的收缩功能。
引言
质粒DNA电穿孔导入骨骼肌 体内 是通过调控多种生理和病理生理条件下基因表达来评估骨骼肌生理学及分子信号变化的重要工具1,2,3,4,5,6,7,8,9早在1990年，Wolff 等人就已证明将基因转入骨骼肌的实验可行性，其中无需电穿孔即可成功转移RNA和DNA，并且荧光素酶的表达至少维持了2个月。10仅通过注射实现的转染效率相对较低，这一问题较为突出。Aihara 和 Miyazaki 在 1998 年通过将 pCAGGS-IL-5 质粒构建体电穿孔导入胫骨前肌（TA），并检测血清中 IL-5 的表达，证明了电穿孔可显著提高基因转导效率。11自那时以来，许多研究已针对不同DNA浓度、体积及电穿孔参数的效率进行了考察，以确....
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方案
所有涉及动物的实验均在宾夕法尼亚州立大学医学院进行，并经宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会批准，实验过程遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版中规定的伦理标准。本实验采用12周龄雌性C57BL/6小鼠。所有手术器械在实验前均经过高压灭菌以确保无菌。
1. 胫骨前肌和趾长伸肌注射/电穿孔准备
注意：TA 和 EDL 注射/电穿孔制备的步骤相同。
- 实验前，将表达质粒构建体纯化至浓度为 1 µg/µL，并溶于无菌 PBS 中。本实验采用市售的无内毒素质粒纯化试剂盒，对 pcDNA3-EGFP（GFP）或 pcDNA3 空载体（对照）进行纯化。
- 计算质粒浓度，以确保合适的注射体积（TA 注射量为 50 µg DNA 溶于 50 µL 无菌 PBS；EDL 注射量为 10 µg DNA 溶于 10 µL 无菌 PBS），并分装样品。
- 使用选择旋钮设置电穿孔仪参数，按下旋钮进行参数选择：模式 - LV，电压 - 12.5 V/mm（注射时可调整），脉冲时长 - 20 ms，脉冲次数 - 5，间隔时间 - 200 ms，极性 - 单极。
- 使用异氟烷气体麻醉小鼠。将小鼠置于含 5% 异氟烷的诱导箱中，通过镊子夹趾无反应确认达到手术麻醉深度后，将异氟烷浓度降至 2% 维持剂量。随后将小鼠转移至 37 °C 循....
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结果
电穿孔技术可促进骨骼肌中的基因转移，是评估肌肉生理变化的一种有用方法。我们已展示了一种详细、逐步的操作流程，可用于实现胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）中高效的基因转导。转染效率的差异由多种变量引起，这些变量包括电穿孔参数（脉冲次数、电压、脉冲持续时间等）、基因构建体的大小以及注射DNA的浓度/体积。我们先前已证明，采用125 V/cm电压、每次脉冲持续20 ms、间隔200 ms、共5次脉冲的电穿孔参数，足以在TA肌肉中实现高效的基因转移14。在本研究中，我们还证明，在实验后3天，对EDL肌肉进行DNA注射和电穿孔操作不会导致肌肉收缩功能的丧失。
为了可视化基因转移，将 pcDNA3-EGFP 或 pcDNA3（对照）质粒通过电穿孔法导入小鼠胫骨前肌（TA）或趾长伸肌（EDL）。操作后 3 天，小心分离 TA 或 EDL 肌肉，置于最佳切割温度（OTC）包埋介质中，并在液氮冷却的异戊烷（2-甲基丁烷）中快速冷冻，方法如前所述14,
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讨论
体内基因转移结合电穿孔技术是一种用于调控肌肉中蛋白表达的有用且相对简便的工具。我们已展示了在趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）中实现高效基因转移所需的操作步骤，并证实了术后仍可对EDL肌肉进行可行的收缩功能测定。该技术无需使用更复杂的病毒载体，且能够在单块肌肉内直接比较转染与未转染肌纤维的横截面积。该方法的一个局限性在于质粒构建物的摄取效率并非完全均一，部分肌纤维仍处于未转染状态。
上述方法不仅限于表达载体的电穿孔。我们先前已证明，通过使用siRNA或shRNA载体在体内进行相同操作，也可实现蛋白质的敲低in vivo14。此外，还可利用报告基因载体检测靶基因的转录活性2,4,22。这些工具可在单个骨骼肌中同时调控多种蛋白质，并使研究者能够方便地检测转录水平的变化。骨骼肌还可共转染表达载体或sh/siRNA载体与.......
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披露
B.A.H. 和 D.L.W. 声称不存在利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-0 尼龙缝线（不可吸收） | Ethicon | 662G | 用于关闭皮肤切口的缝线 |
| 50µl Hamilton 注射器 | Hamilton | 80501 | 微量注射器 |
| C57BLl/6NHsd 小鼠 | Envigo | 044 | 12 周龄雌性小鼠，用于实验 |
| 卡尺电极 | BTX | 45-0102 | 1.0 cm × 1.0 cm 不锈钢电极 |
| 动态肌肉控制数据采集/分析系统 | Aurora Scientific | 605A | 用于肌肉收缩力测量与分析的软件 |
| ECM 830 电穿孔系统 | BTX | 45-0662 | 电穿孔仪 |
| EndoFree 质粒大提纯化试剂盒 | Qiagen | 12362 | 质粒纯化试剂盒 |
| 超窄剪刀 | Fine Science Tools | 14088-10 | 用于钝性解剖的剪刀 |
| 力传感器 | Aurora Scientific | 407A | 用于测量趾长伸肌（EDL）产生的力量 |
| 微型蚊式止血钳 | Fine Science Tools | 13010-12 | 用于缝合的止血钳 |
| pcDNA3.1 哺乳动物表达载体 | Fisher Scientific | V79020 | 对照载体 |
| pcDNA3-EGFP 表达质粒 | Addgene | 13031 | 用于表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒 |
| Semken 弯头镊 | Fine Science Tools | 11009-13 | 用于手术操作的镊子 |
| 不锈钢手术刀片，10 号 | Becton Dickinson | 37 1210 | 手术刀片 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋介质 | VWR | 25608-930 | 组织学冷冻包埋介质 |
| 麦胚凝集素-德克萨斯红（Wheat Germ Agglutinin-Texas Red） | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | 用于肌肉横切面细胞膜染色 |
参考文献
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve.
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重印与许可
