本实验方案描述了光片荧光显微镜结合自动化软件辅助的方法，用于在完整且已透明化的器官和组织中可视化并精确定量增殖态与休眠态的Trypanosoma cruzi寄生虫及T细胞。这些技术为评估治疗效果提供了可靠手段，并有助于深入理解寄生虫与宿主之间的相互作用。
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摘要
摘要
恰加斯病是一种被忽视的疾病，影响全球数百万人，主要集中在拉丁美洲。恰加斯病的病原体Trypanosoma cruzi（T. cruzi）是一种专性胞内寄生虫，具有复杂的生物学特性，可感染包括人类在内的多种哺乳动物，导致心脏和消化系统病变。长期以来，人们一直需要可靠的方法来检测T. cruzi的体内感染，以深入理解恰加斯病复杂的生物学机制，并准确评估各种治疗方案的效果。本实验方案展示了一种集成化流程，可用于对经透明化处理并三维重建的器官中T. cruzi感染的细胞进行自动化定量分析。光片荧光显微镜技术能够精确地可视化和定量整个器官或组织中活跃增殖和休眠状态的T. cruzi寄生虫以及免疫效应细胞。此外，本研究成功采用了CUBIC-HistoVision流程，实现了对透明化器官使用抗体和核染料进行均匀标记。组织透明化结合三维免疫染色技术提供了一种无偏倚的方法，可全面评估药物治疗方案，加深对T. cruzi感染组织细胞结构的理解，并有望推动关于恰加斯病中抗T. cruzi免疫应答、组织损伤及修复机制的研究进展。
引言
恰加斯病由原虫寄生虫T. cruzi引起，是全球最被忽视的热带病之一，每年导致约13,000人死亡。该感染通常从急性期进展至慢性期，其中30%的患者会出现心脏病变，包括心律失常、心力衰竭和猝死1,2。尽管在急性期宿主对寄生虫产生强烈的免疫反应，但少量寄生虫可在宿主体内长期持续存在于心脏和骨骼肌等组织中。多种因素可能共同导致T. cruzi逃避宿主免疫系统的彻底清除，包括适应性免疫反应的延迟启动以及寄生虫存在非复制形式3,4,5,6。此外，非复制的休眠形式寄生虫对锥虫杀灭药物的敏感性较低，这可能部分解释了临床上观察到的治疗失败现象7,8。
新型成像技术的发展为深入了解寄生虫在感染组织中的空间分布及其与参与控制寄生虫的免疫细胞之间的关系提供了契机。这些特征对于更好地理解免疫系统控制寄生虫的过程，以及追踪慢性感染组织中罕见的休眠寄生虫具有重要意义。
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方案
本研究严格遵循《公共卫生服务政策关于实验动物的人道护理与使用》以及实验动物护理评估与认证协会的认证指南进行。动物使用方案（小鼠中T. cruzi感染的控制-A2021 04-011-Y1-A0）已获得佐治亚大学机构动物护理与使用委员会的批准。本研究使用了以下小鼠品系：B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 和 C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J（雌性，1-2月龄）。这些小鼠来自商业来源（见材料表）。
1. 感染、灌注与解剖
- 通过腹腔注射，用源自组织培养的Colombiana（DTU TcI）或Brazil（DTU TcV）克氏锥虫无鞭毛体感染小鼠 T. cruzi 分别表达tdTomato或GFP荧光蛋白的菌株。感染剂量可为50,000至200,000条锥鞭毛体，溶于100 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注：关于报告寄生虫的构建及感染小鼠模型的具体细节可参见 Canavaci 等人的研究.29 和Bustamante等人
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结果
经CUBIC固定的组织用PBS洗涤以去除固定剂，随后在CUBIC-L试剂中孵育。CUBIC-L是一种含氨基醇的碱性缓冲溶液，可从组织中提取色素和脂质，使组织脱色，同时保持组织结构的完整性。纸上的网格线可透过组织清晰可见，表明器官已达到适当的透明效果(图2A)。脱脂后，组织经洗涤并分别浸入CUBIC-R+溶液和封片液中，以实现折射率均一化和成像(图2B)。
一只野生型小鼠被预先用DiR近红外花青染料染色并表达tdTomato的上鞭毛体感染。感染后15天处死小鼠，完整取出心脏，进行固定和透明处理。通过光片显微镜（LSFM）成像和三维重建，我们能够观察到表达tdTomato的增殖型T. cruzi寄生虫（红色）。红色通道中的自发荧光水平可用于准确显示心脏结构及边缘（图2C i）。光片显微镜（L.......
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讨论
目前缺乏对寄生虫及其免疫反应的广泛性全器官成像，这限制了人们对宿主-寄生虫相互作用复杂性的理解，并阻碍了恰加斯病疗法的评估。本研究采用CUBIC技术对感染了T. cruzi的小鼠完整器官和组织进行透明化处理和染色。
本研究测试了多种组织透明化方案（PACT32、ECi33、FLASH34、iDISCO11,26 和 fDISCO13）；然而，只有 CUBIC 能够较好地保留 tdTomato 或 GFP 寄生虫荧光信号。类似地，既往研究报道，与其他组织透明化方法相比，CUBIC 能更好地保留内源性表达的标记物35。
有限的分辨率是当前传统光片显微镜的缺陷之一.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
我们感谢Etsuo Susaki博士在组织透明化和免疫染色方案方面提供的宝贵帮助和建议。同时，我们感谢CTEGD生物医学显微成像中心的M. Kandasamy在使用光片显微镜和共聚焦成像技术时提供的技术支持。我们还感谢Tarleton研究团队所有成员在本研究过程中给予的有益建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-甲基咪唑 | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（安替比林） | TCI | D1876 | |
| 6孔细胞培养板 | 赛默飞世尔科技 | 140675 | |
| AlexaFluor 647 抗小鼠 Fab 片段 | 杰克逊免疫研究实验室 | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 抗兔 Fab 片段 | 杰克逊免疫研究实验室 | 111-607-003 | |
| 抗GFP纳米抗体Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| 抗RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| 抗-α-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 品系编号 #007914 | 通用名称：Ai14、Ai14D 或 Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 品系 #007914 | 通用名称：Ai14、Ai14D 或 Ai14(RCL-tdT)-D |
| 碘化BOBO-1 | 赛默飞世尔科技 | B3582 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 菌株 #032080 | 通用名称：Cd8a-Cre（E8III-Cre） |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Kimwipes 清洁擦拭纸 | Kimberly-Clark | T8788 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D 免疫染色试剂盒 | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D 细胞核染色试剂盒 | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| 氰基丙烯酸酯凝胶超级胶水 | 透明胶带 | 571605 | |
| DiR（DiIC18(7)；1,1’-二辛基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚三羰花青碘化物）公司：Biotium | Biotium | #60017 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon 离心管 15 mL | 康宁 | CLS430791 | |
| Falcon 离心管 50 mL | 康宁 | CLS430290 | |
| 甲醛溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 肝素 | 赛默飞世尔科技 | J16920.BBR | |
| 透明质酸酶 | Sigma | #H3884 或 #H4272 | |
| Imaris 文件转换器 x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris 软件 | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector 软件 | LaVision BioTec，Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| 23 号静脉注射针 | 萨托里，迷你萨特注射器滤器 | 16534 | |
| Kimwipes | 无尘擦拭布 | ||
| 光片荧光显微镜 | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II 成像系统 | |
| 甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 041838.K2 | |
| 微量移液器吸头，10 个 µL, 200 µL 和 1,000 µL | Axygen | T-300、T-200-Y 和 T-1000-B | |
| 电动移液器分配器 | Fisher Scientific，Fisherbrand | 03-692-172 | |
| 封片液 | TCI | M3294 | |
| N-丁基二乙醇胺 | TCI | B0725 | |
| 烟酰胺 | TCI | N0078 | |
| N-甲基烟酰胺 | TCI | M0374 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190-094 | |
| RedDot 2 远红核染料 | Biotium | #40061 | |
| 牺牲灌注系统 | Leica | 10030-380 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 血清移液管 | 康宁 无菌 | 4488 | |
| 摇床培养箱 | TAITEC | BR-43FM MR | |
| 叠氮化钠（NaN3) | 赛默飞世尔科技 | 447815000 | |
| 碳酸钠（Na2CO3) | 赛默飞世尔科技 | L13098.36 | |
| 氯化钠（NaCl） | 赛默飞世尔科技 | 447302500 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | 赛默飞世尔科技 | 014707.A9 | |
| SYTOX Green 核酸染料 | 赛默飞世尔科技 | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
参考文献
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
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